基因子集表达上调应用程序;对象/对象小鼠：糖尿病相关性肥胖与阿尔茨海默病相互作用的证据

2.2. 组织采集和样品制备

用木聚嗪和氯胺酮（分别为20和100 mg/kg）麻醉小鼠。经心灌注补充了完整蛋白酶抑制剂鸡尾酒的PBS（Nacalai Tesque）后，大脑被移除并沿矢状面分割；然后，将右半球（皮层和海马区）快速冷冻在液氮中，并在−80°C下保存，直到进行生化分析。将左半球用4%多聚甲醛固定过夜，然后将其埋入石蜡中进行组织学分析。为了进行生化分析，将组织在预冷（干冰上）的BioSpec生物粉碎机（BioSpec）中粉碎，并在冰上含有0.1%SDS和完整蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Roche）的冰冷RIPA裂解缓冲液（Millipore）中，以20 mL/g湿重脑组织的比例用聚四氟乙烯均质机（Kinematica）均质。10万×离心后克收集上清液，在4°C下放置1h，用于生化分析。样品制备和后续分析的顺序是独立于基因型随机分配的。

2.3。RNA‐序列

使用RNeasy Lipid Tissue Mini Kit（Qiagen）提取总RNA。使用Micropoly（a）Purist从纯化的总RNA中分离出mRNA^TM（TM）mRNA纯化试剂盒（Thermo Fisher Scientific）。cDNA在用固体酶裂解后从mRNA逆转录^TM（TM）总RNA‐序列试剂盒（Thermo Fisher Scientific）。用生物分析仪（安捷伦）评估RNA和cDNA的质量。使用下一代测序系统（5500xl SOLiD系统，赛默飞世尔科技公司）进行测序。

2.4. 差异表达基因分类

我们选择了2543个DEGq个任何两组之间的比较均<0.05。接下来，我们使用基于Ward方法和欧几里德距离的凝聚层次聚类将DEG分为10个聚类。根据间隙统计，集群数量设置为10（图S1（第一阶段）).³¹所有分析均在R中进行。³²

2.5. 细胞特异性基因的富集分析

为了分析每个集群中细胞特异性基因的富集情况，我们使用了来自小鼠大脑皮层的神经元、星形胶质细胞、少突胶质前体细胞（OPC）、新形成的少突胶质细胞（NFO）、髓鞘化少突胶质（MO）、小胶质细胞、内皮细胞和周细胞的公开的RNA-seq数据集。³³我们使用了这八种细胞类型中的七种（周细胞除外）。在22458个基因中，当比较任何两种细胞类型的平均值时，我们选择了10952个基因表达倍数变化>5。接下来，我们使用基于Ward方法和欧几里德距离的凝聚层次聚类法将10952个基因分为20个簇。在20个聚类中，我们手动筛选出7个，通常在特定的细胞类型中显示出显著的峰值（图S2系列A） ●●●●。NFO和MO集成到一个集群中。我们最终将每个簇中的基因定义为细胞特异性基因（图S2系列B） 。为了检查细胞特异性基因和集群中基因之间的重叠程度，我们使用超几何分布测试和倍数富集率（FER）计算了p值，如下所示：

哪里x个是一组细胞特异性基因和一组基因之间重叠的基因数量，米是细胞特定基因的数量，n个是一个簇中的基因数，N个是基因的总数，以及E类是预期值。FER大于1表示细胞特异性基因与簇中基因之间的重叠程度高于预期。

2.6. 人类AD脑中二甘醇的富集分析

我们使用AlzData来确定人类AD大脑中上调或下调的基因。²⁷AlzData是一个数据库，存储内嗅皮层（EC）、额叶皮层（FC）、海马（HIP）和颞叶皮层（TC）的统计元分析结果。基因表达水平采用线性回归模型进行分析，包括年龄和性别作为协变量。我们从AlzData下载了经过处理的数据，并在处理的数据中使用了对数倍变化（log2FC）值和FDR调整的p值。检查DEG之间的重叠程度（已调整第页<0.05），在人类AD大脑和集群中的基因中，我们通过超几何分布测试计算了p值，并确定了FER。

2.7. 潜在调节器预测

为了预测可能调节簇10中基因表达水平的转录因子（TF），我们使用oPOSSUM（3.0版）在距离基因转录起始位点±5kb的区域中搜索保守的TF结合位点。³⁴在oPOSSUM的“小鼠单位点分析”中，TF的z评分≥10，Fisher评分≥7（默认值）。

2.8. 定量实时PCR

使用RNeasy Lipid Tissue Mini试剂盒（QIAGEN）从脑组织中纯化总RNA，然后在无核酸酶的水中洗脱并储存在−80°C下。使用ReverTra Ace®qPCR RT Master Mix（丰田）进行逆转录。使用Luna Universal qPCR Master Mix（新英格兰生物实验室）在i1000热循环器（Bio‐Rad）中进行实时PCR，以检测胶质纤维酸性蛋白的mRNA水平(Gfap公司)，髓磷脂相关糖蛋白(美格)，蛋白脂质蛋白1(第1页)，DNAX‐激活蛋白12(数据12)，骨髓细胞上表达的触发受体2(特雷2)，C‐C基序趋化因子配体3(Ccl3公司)，C‐C基序趋化因子配体4(第4类)，BTG抗增殖因子2(Btg2型)，富含半胱氨酸的血管生成诱导剂61(气缸61)，一种AP-1转录因子亚单位(6月B日)，羊毛甾醇合酶(最小二乘法)，双特异性磷酸酶1(灰尘1),福斯（AP-1转录因子亚单位），神经元PAS域蛋白4(Npas4型),β‐微管蛋白(管4a)、和β‐肌动蛋白使用了以下引物：β‐肌动蛋白正向引物：AGTGTGACGTTGACATCCGTA，反向引物：GCCAGAGCTAATCTCCTTC；特雷2正向引物：TGCTGGCAAAGGAAAGGT，反向引物：GTTGAGGGCTTGGACAGG；数据12正向引物：GTTGACTCTGATTGCCT和反向引物：CCCTTCCGCTGTCCCTTGA（均来自Integrated DNA Technologies）；Btg2型正向引物：ATGAGCCACGAGAGAGAAC，反向引物：GCCCTACTGAAACCTTGAGTC；气缸61正向引物：CTGCGCTAAACAACTCAACGA，反向引物：GCAGATCCTTTCAGAGCGG；6月B日正向引物：TCACGACGACTCTTACGCAG，反向引物：CCTTGAGACCCCGATGGA；最小二乘法正向引物：TCGTGGGGACCCTATAAAC，反向引物：CGTCCTCCGCTTGATAAAAGTC；黄昏1正向引物、GTTGTTGGATTGTCGCTCCTT和反向引物：TTGGGCACGATATCTCCAA；福斯正向引物：CGGGTTCAACGCCGACTA，反向引物：TTGGCACTAGACGGACAGA；Npas4型正向引物：AGCATTCGAGCTCATCTGAA和反向引物，GGCGAAGTAAGTCTGTAGGATT；β‐微管蛋白正向引物：CACCTGCAAGCGTCAAT，反向引物：TCCCCATGATGTCCAGTG；Gfap公司正向引物：CGGAGACGCATCACCTCTG，反向引物：AGGGAGTGAGGAGTCATCG；Ccl3公司正向引物：TTCTCTGTACCATGCACTCTGC，反向引物：CGTGGAATCTTCCGGCTGTAG；第4类正向引物：TTCCTGCTGTTTCTTACACCT，反向引物：CTGTCTGCCTTTTGCAG；美格正向引物：CTGCCGCTGTTTTGGATAATGA，反向引物：CATCGGGGAAGTCGAAACGG；和第1页正向引物：CCAGAATGATGGTTTCTCCC，反向引物：GGCCCATGAGTAAGGACG。使用Bio‐Rad iCycler iQ软件（Bio-Rad）对相对表达水平进行量化和分析。使用ΔΔCt方法计算相对mRNA水平β‐肌动蛋白或β‐微管蛋白视情况，作为每个特定基因扩增反应的内部控制。

2.9. ELISA和其他生化分析

如前所述，使用ELISA测定GFAP和CD11b的水平。³⁵在与辣根过氧化物酶（HRP）结合的亲和素-D（载体）或抗兔IgG（H+L）、HRP结合物（Promega）和3,3′，5,5′-四甲基联苯胺底物（Sigma-Aldrich）孵育后，使用iMark平板读取器（Bio-Rad）进行比色定量。为了测量Aβ，使用聚四氟乙烯玻璃匀浆器将脑样本在5体积（w/v）的1%Triton X-100中，在含有完全蛋白酶抑制剂（Roche）的25mM Tris缓冲盐水（TBS）（pH 7.9）中匀浆。在冰上培养3小时后，匀浆以100000×克在4°C下保持20分钟。上清液保存为Triton X‐100可溶性部分。将所得沉淀与5体积（w/v）的5M盐酸胍混合，超声处理，并在室温下孵育2小时。用TBS稀释混合物并在4000×克在4°C下保持20分钟。上清液在装入ELISA板之前被中和。按照制造商的说明（Wako），通过ELISA测定人/大鼠Aβ40和Aβ42水平。

2.10. 免疫组织化学染色

按照“组织采集和样品制备”一节中的描述固定小鼠大脑。大脑样本被石蜡包埋，并切成10微米厚的切片。脑切片浸没在EDTA缓冲液（1 mM，pH 8.0）中，并进行高压灭菌以回收抗原。切片浸泡在95%甲酸中进行Aβ染色。通过用过氧化氢孵育切片，内源性过氧化物酶活性被猝灭。切片在4°C下与一级抗体孵育过夜；我们使用了抗Aβ（6E10，表位：Aβ的3-8个氨基酸）抗体（默克公司）。然后用HRP偶联二级抗体和二氨基联苯胺反应混合物培养切片（Vector Laboratories）。染色切片在显微镜下进行评估（BZ‐X810，Keyence）。

2.11. Klüver–Barrera（KB）染色

大脑切片在65°C温度下用Luxol Fast Blue溶液（日本Muto Pure Chemical）处理过夜。将切片冷却至室温，用95%乙醇和蒸馏水冲洗，用0.1%碳酸锂和70%乙醇处理，用蒸馏水冲洗并用含有10%乙酸的0.1%甲酚紫醋酸盐溶液（多纯化学品）复染。切片用95%乙醇脱水，用二甲苯清除，并用Entelan®New（默克，美国）安装。使用莱卡显微镜（德国威兹拉莱卡DM5000B）进行组织学分析，获取各组胼胝体旁体的图像。

我们感谢Junko Hirokawa女士、Miho Yamamoto、Tomomi Tajiri和Toomi Sato提供技术援助；大阪大学RNA-seq的Saki Ishino女士和Noboru Ogiso博士在国家老年医学和老年病学中心的实验动物实验室提供技术支持。我们还感谢诺华制药公司的Matthias Staufenbiel博士、Ulf Neumann博士和Tobias Keck博士提供APP23小鼠。我们感谢成田Masashi教授提供批判性阅读和讨论。我们还感谢NCGG衰老神经生物学系的实验室成员，感谢武田清彦、藤井靖、田中俊彦和森岛厚之博士参与了有益的讨论。这项工作得到了NCGG长寿科学研究基金的部分支持（28-45、19-3和19-9至NS）；日本科学促进会/教育、文化、体育、科学和技术部的资助（JP2629316、JP15K15272和JP17H04154给NS；JP17H07419和JP18H02725给MiS）；武田科学基金会研究鼓励拨款（给NS和MiS）；SENSHIN医学研究基金会研究拨款（给NS）；诺华老年研究基金会奖（授予NS）；日本抗衰老医学会授予NS的年度研究奖；武田医学研究基金会研究拨款（给NS）；日本老龄与健康基金会（给MiS）的研究拨款；以及Uehara Memorial Foundation（给MiS）的研究拨款。