医学科学杂志。2021; 27:e928480-1–e9284800-9。
凝血酶通过激活SIRT1介导的自噬途径加重心肌细胞缺氧/复氧损伤
,1,一 ,2,B、，C类 ,三，F类和
1,E、，F类 李凌波
三中国吉林省长春市长春生物讯生物科技有限责任公司
1中国吉林省长春市吉林大学第一医院输血科
2中国吉林省长春市吉林大学第一医院口腔科
三中国吉林省长春市长春生物讯生物科技有限责任公司
通讯作者。 一研究设计
B类数据收集
C类统计分析
D类数据解释
E类手稿准备
F类文献检索
G公司资金募集
2020年9月11日收到；2020年12月18日验收。
摘要
背景
急性心肌梗死是全世界成年人死亡的主要原因。本研究旨在探讨凝血酶和SIRT1在缺氧/复氧（H/R）损伤中的作用和机制。
材料/方法
用H9c2心肌细胞建立H/R模型，模拟体内缺血/再灌注损伤。MTT法检测细胞活力，qRT-PCR检测SIRT1、凝血酶和PAR-1水平，western blot分析评估凝血酶、PAR-1、SIRT1，LC3I、LC3II和Beclin1。ELISA用于测定IL-1b、IL-6、TNF-a、MMP-9和ICAM-1。建立H/R模型后，用黄嘌呤氧化酶法评估超氧化物歧化酶（SOD）活性，用硫代巴比妥酸法检测丙二醛含量，用CM-H2DCFDA法检测活性氧的产生。
结果
研究结果表明，凝血酶增强H/R损伤心肌细胞的炎症因子分泌和氧化应激，但抑制细胞活力。我们还观察到凝血酶促进H/R损伤心肌细胞的自噬。此外，凝血酶通过H/R增强SIRT1表达的上调。然而，发现抑制SIRT1可以抑制凝血酶对炎症因子分泌、氧化应激和细胞活力的影响。此外，SIRT1的下调抑制了凝血酶对H/R损伤自噬的抑制作用。
结论
凝血酶通过激活SIRT1介导的自噬途径加重心肌细胞的H/R损伤。这些发现可能为未来临床工作中缺血/再灌注损伤的治疗提供潜在的靶向治疗。
关键词：自噬、氧化应激、全身炎症反应综合征、凝血酶
背景
急性心肌梗死（MI）是全球成年人死亡的主要原因，在过去几十年中，20%以上的死亡与心血管疾病有关[1,2]. 虽然直接经皮冠状动脉介入治疗被认为是急性心肌梗死的标准治疗方法，但心肌缺血/再灌注（I/R）损伤是心力衰竭的主要原因[三]. I/R是一个由炎症、代谢因子、微血管阻塞和其他过程和因素调节的多因素过程[4].
丝氨酸蛋白酶凝血酶是凝血级联反应的重要组成部分。它参与内皮细胞激活、血管生物学过程和血小板聚集[5]. 越来越多的证据表明，凝血酶在创伤性脑损伤以及缺血性和出血性卒中中起着重要作用[6]. 胶质纤维酸性蛋白（GFAP）阳性星形胶质细胞中凝血酶和凝血酶受体PAR-1增加[7]. 此外，缺氧和缺糖后海马脑片中凝血酶活性增加[8]. 此外，据报道凝血酶参与心律失常的发生和凝血酶受体激活对室性心律失常的影响[9].
自噬是指细胞降解的过程，通过这个过程，细胞蛋白质和细胞器被隔离在自噬体内，传递到溶酶体，并被溶酶体水解酶消化[10]. 自噬是维持心肌细胞功能的基本过程[11]. 此外，自噬参与多种心血管疾病，是一种适应性反应或有害的发病机制[12]. 一般来说，自噬在心肌I/R过程中起双重作用，适度自噬可能有益于心肌细胞，过度自噬可引起有害反应，如参与I/R过程的心肌细胞凋亡[13–15]. 如前所述，适度的自噬激活对I/R损伤起到心脏保护作用[16]. 然而，关于凝血酶和自噬在心肌缺血再灌注损伤中的调节作用的研究有限。因此，我们认为研究凝血酶如何影响心肌细胞的自噬是非常有趣的。
在本研究中，深入研究了缺氧/复氧损伤（H/R）后心肌细胞中凝血酶对自噬作用的机制。我们证明凝血酶通过激活SIRT1介导的自噬途径增加心肌细胞的H/R损伤。
材料和方法
细胞培养与缺氧/复氧治疗
H9c2心肌细胞取自美国型培养物收集中心（美国马里兰州罗克维尔）。H9c2细胞在含有10%胎牛血清（FBS）的Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM）（均来自美国加利福尼亚州卡尔斯巴德Invitrogen Life Technologies）中于37°C的含5%CO的湿化培养箱中培养2处理后的H9c2细胞首先在含有5%CO的无血清10%FBS-DMEM中培养237°C下培养12小时。然后，将细胞置于缺氧室中，并辅以厌氧袋，然后在5%CO中培养2/95%牛顿2在37°C下培养21小时。随后，将H9c2细胞培养在10%FBS DMEM和5%CO中2在37°C下保持3小时，进行复氧。
细胞治疗和转染
对于细胞治疗，用达比加群（1 nM）或凝血酶（5 U/ml）处理H/R损伤的H9c2细胞，并添加或不添加达比加群（1nM）。此外，用凝血酶（5U/ml）处理H/R损伤的H9c2细胞，并加入或不加入3-MA。凝血酶的剂量是根据我们的实验经验和以前的参考确定的[17].
对于细胞转染，根据制造商的说明，使用Lipofectamine 2000（Invitrogen，Life Technologies，Carlsbad，CA，USA），用凝血酶（5 U/ml）处理的H9c2细胞转染si-SIRT1或si-NC（均购自中国上海基因制药有限公司）。
MTT检测
H9c2细胞的细胞活力在转染后48 h使用MTT（3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四唑溴化铵）检测。简单地说，H9c2细胞以5×10的密度种植在96个板中三每个孔培养细胞并孵育48小时。在上述处理后，将10μl的5mg/mL MTT溶液添加到每个孔中，并将平板在37℃下再孵育4小时o个C.去除MTT后，随后用180μL二甲基亚砜替换上清液。使用微孔板阅读器（DNM-9602；中国北京佩龙）在450 nm处测量光密度（OD）值。
RNA提取和定量实时PCR
采用实时定量PCR（qRT-PCR）检测PAR-1、SIRT1和凝血酶的表达。使用TRIZOL试剂（美国纽约州格兰德岛Invitrogen）提取总RNA。随后，使用高容量cDNA逆转录试剂盒（applied Biosystems；Thermo Fisher Scientific，Inc.）将RNA转化为cDNA，使用SYBR-Green I Real-Time PCR试剂盒（TaKaRa Biotechnology，Dalian，China），使用Bio-Read MiniOption热循环器（美国加利福尼亚州Hercules的Bio-Rad Laboratories，Inc.）进行检测。引物序列如下：
F 5′-CCTATGAGACACGAA-3′和
PAR-1的R 5′-GCTCTTGACCTTCACT-3′；
F 5′-AGGGAACCTCTGTGCCT-3′和
SIRT1的R 5′-TGGCATACTCGCACCTAAC-3′；
F 5′-ATGGCTGCAATCCGAAAGAG-3′和
凝血酶的R 5′-ACAGTAGGGACGTACCTCC-3′；和
F 5′-ATCCCATCACCATTCC AG-3′和
GAPDH的R 5′-TTCTAGACGGCAGGTCAGGT-3′。GAPDH被用作mRNA的内部控制。使用2-ΔΔCq方法。
Western Blot分析
Western blotting检测凝血酶、PAR-1、SIRT1、LC3I、LC3II和Beclin1的水平。简单地说，使用蛋白质分析试剂（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）测量从样品中提取的总蛋白质。用十二烷基硫酸钠（10%）聚丙烯酰胺凝胶电泳（10%SDS-PAGE）分离等量蛋白质，转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，并在室温下用5%脱脂奶封闭1h。然后将膜与一级抗体在4°C下孵育过夜：抗凝血酶（ab92621，1μg/ml）、抗SIRT1（ab189494，1/1000）、抗LC3A/B（ab128025，2μg/ml）、抗Beclin 1（ab210498，1/1000）和抗GAPDH（ab8245，1/500）均购自Abcam（Cambridge，MA，USA），而抗PAR1（#MBS3088648，1/500）购自MyBioSource，Inc.（美国加利福尼亚州圣地亚哥）。用含吐温的三缓冲盐水冲洗3次后，在室温下将膜与相应的山羊抗鼠或山羊抗兔二级抗体孵育1小时。使用生物图像分析系统（美国加利福尼亚州里士满市Bio-Rad）分析蛋白质带。数据被归一化为b-actin，作为内部控制。
酶联免疫吸附试验
用酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒测定血清中IL-1b、IL-6、TNF-a、MMP-9和ICAM-1的蛋白水平。所使用的ELISA试剂盒如下：大鼠IL-1βELISA试剂箱（ab255730）、大鼠IL-6 ELISA试剂包（ab234570）、大白鼠TNF-αELISA试剂库（ab236712）、大白细胞介素-1 ELISA试剂袋（ab100763）（均购自Abcam）和大鼠MMP9 ELISA试剂架（EK1463，Boster生物技术有限公司）。根据制造商的说明执行协议。
超氧化物歧化酶、丙二醛和活性氧生成的测量
H/R诱导后，用黄嘌呤氧化酶法评估超氧化物歧化酶（SOD）活性，用硫代巴比妥酸法检测丙二醛（MDA）含量，用CM-H2DCFDA（生命科技，Invitrogen，目录号：C6827）测量活性氧（ROS）生成。
统计分析
使用t吨采用单因素方差分析（ANOVA）和Tukey事后检验对3组或更多组进行比较。所有数据均表示为平均值±SD，并使用SPSS 20.0进行分析。P（P）<0.05被认为表明存在统计学上的显著差异。
结果
凝血酶增加H/R损伤心肌细胞的炎症因子分泌和氧化应激
为了研究凝血酶对H/R损伤心肌细胞的影响，检测炎症因子水平、氧化应激和细胞活力。如所示H/R处理后MDA含量和ROS水平升高；但SOD活性受到抑制。H/R治疗还显著上调了血清中IL-1b、IL-6、TNF-a、ICAM-1和MMP-9的水平()但抑制心肌细胞的活性(). 用凝血酶处理H/R损伤的心肌细胞后，我们观察到凝血酶明显增强了H/R诱导的MDA含量、ROS水平和炎症因子（IL-1b、IL-6、TNF-a、ICAM-1和MMP-9）水平的上调。此外，凝血酶显著促进H/R对SOD活性和细胞活力的抑制作用。此外，达比加群能显著减轻H/R和凝血酶诱导的氧化应激和炎症因子分泌；它还能够减轻对细胞活力的影响。所有这些结果表明，凝血酶增加H/R损伤心肌细胞的炎症因子分泌和氧化应激。
H/R损伤心肌细胞中凝血酶诱导炎症因子分泌和氧化应激。(一)检测凝血酶处理的H/R模型、达比加群处理的H/R模型、凝血酶和达比加群联合处理的H/R模型以及对照组的MDA含量、ROS水平和SOD活性，以评估氧化应激。(B类)ELISA检测IL-1b、IL-6、TNF-a、ICAM-1和MMP-9的水平。(C类)MTT用于检测细胞活力***P（P）<0.001 vs对照组，n=3。
凝血酶增加H/R损伤心肌细胞的自噬
接下来，我们研究了凝血酶对H/R损伤心肌细胞自噬的影响。western blotting结果显示H/R损伤显著增加了凝血酶、PAR-1、SIRT1和Beclin1的水平，以及LC3I向LC3II的转化(). 此外，H/R损伤对心肌细胞自噬的影响通过凝血酶显著增加，但通过达比加群减弱。此外，达比加群逆转了凝血酶对H/R损伤心肌细胞自噬的影响。qRT-PCR结果还证实，H/R损伤心肌细胞中凝血酶、PAR-1和SIRT1的表达明显受凝血酶上调而达比加群下调(). 上述结果表明，凝血酶增加了H/R损伤心肌细胞的自噬。
凝血酶诱导H/R损伤心肌细胞自噬。(一)Western blotting检测凝血酶、PAR-1、SIRT1、Beclin1水平以及LC3I向LC3II的转化。(B类)qRT-PCR检测凝血酶、PAR-1和SIRT1的表达***P（P）<0.001 vs对照组，n=3。
SIRT1沉默抑制凝血酶对H/R损伤心肌细胞氧化应激和炎症因子分泌的影响
随后，我们研究了SIRT1调节凝血酶对H/R损伤心肌细胞中炎症因子分泌、氧化应激和细胞活力影响的分子机制。我们发现H/R处理显著增加了MDA含量和ROS水平，但抑制了SOD活性(). ELISA结果显示，H/R还显著上调了血清IL-1b、IL-6、TNF-a、ICAM-1和MMP-9水平()同时降低心肌细胞的细胞活力(). 此外，凝血酶还显著加剧H/R损伤对心肌细胞的影响。有趣的是，SIRT1敲除或自噬抑制剂3-MA可降低H/R损伤细胞中炎症因子的水平，包括IL-1b、IL-6、TNF-a、ICAM-1和MMP-9，以及对氧化应激和细胞活力的影响，无论是否进行凝血酶治疗。所有这些结果表明，SIRT1沉默抑制凝血酶诱导的H/R损伤心肌细胞炎症因子和氧化应激水平的上调。
SIRT1的沉默抑制了凝血酶对H/R损伤的心肌细胞中炎症因子和氧化应激分泌的影响。(一)检测MDA含量、ROS水平和SOD活性，以评估用凝血酶处理的H/R模型、用si-SIRT1和达比加群转染的H/R-模型、用凝血素和3-MA联合处理的H/R模型和对照组的氧化应激。(B类)ELISA法检测血清中IL-1b、IL-6、TNF-a、ICAM-1和MMP-9的水平。(C类)MTT用于检测细胞活力***P（P）<0.001 vs对照组，n=3。
SIRT1沉默抑制凝血酶对H/R损伤星形胶质细胞自噬的调节作用
我们最终探索了SIRT1对自噬作用的分子机制。蛋白质印迹()结果显示，凝血酶治疗后凝血酶和PAR1水平升高，但不受si-SIRT1或自噬抑制剂3-MA的影响。此外，凝血素上调了自噬因子的水平，包括LC3II/I和Beclin1的比率，而3-MA可以抑制自噬因素的水平。凝血酶增加SIRT1表达，si-SIRT1降低SIRT1的表达。同时，qRT-PCR结果证实SIRT1被si-SIRT1有效地击倒(); 然而，si-SIRT1对凝血酶和PAR1水平没有明显影响。这些结果表明，SIRT1的沉默抑制了凝血酶对H/R损伤心肌细胞自噬的调节。
SIRT1沉默可抑制H/R损伤星形胶质细胞中凝血酶对自噬的调节。(一)Western blotting检测凝血酶、PAR-1、SIRT1、Beclin1水平以及LC3I向LC3II的转化。(B类)qRT-PCR检测凝血酶、PAR-1和SIRT1的表达***P（P）<0.001 vs对照组，n=3。
讨论
缺血性心脏病的特点是限制心肌区域的血液供应，导致梗死和组织坏死[18]. 此外，心肌梗死是世界上最常见的心血管疾病之一[19]. 近几十年来，越来越多的研究探讨了I/R在心肌损伤中的作用[20,21]; 然而，I/R的分子机制仍不明确。据报道，I/R损伤激活自噬和凋亡，导致细胞死亡[22]. 因此，本研究主要关注凝血酶对H/R损伤心肌细胞中炎症因子和氧化应激以及自噬的影响。我们首次证明凝血酶可能通过激活SIRT1诱导的心肌细胞自噬来促进H/R损伤。
炎症和氧化应激是参与各种类型损伤的密切相关过程[23]. 凝血酶参与炎症、凋亡和氧化应激[24]. 先前的研究表明凝血酶激活NLRP3炎性体并诱导小胶质细胞凋亡[25]. 另一项研究表明，凝血酶在动脉粥样硬化的发病机制中诱导前炎症细胞因子的分泌并增强炎症反应[26]. 这些结果支持凝血酶激活炎症因子的能力。然而，如之前的另一项研究所述，凝血酶通过激活PAR启动炎症前信号反应，这将有助于增加炎症前细胞因子和趋化因子的分泌，并促进白细胞迁移[27]表明凝血酶在不同条件下可能在炎症中发挥不同的作用。我们的研究表明，凝血酶刺激H/R损伤心肌细胞中炎症因子的分泌，这与前面提到的一些结果一致。然而，只有有限的报告表明凝血酶对氧化应激和自噬的影响。此外，凝血酶可诱导活性氧的生成，从而导致海马神经元的氧化损伤和死亡[28]. Hu等人还证明凝血酶可以诱导大鼠中枢神经系统胶质细胞的自噬[29]. 此外，凝血酶诱导的自噬在减轻脑出血方面具有良好的作用[17]. 这些先前的报告与我们的发现一致，即凝血酶增强了H/R损伤后的氧化应激和自噬。此外，我们首次表明，在H/R条件下，凝血酶也能促进炎症和氧化应激。
SIRT1是一种NAD+依赖性蛋白脱乙酰酶，参与各种代谢和病理过程，通过调节基因表达保护细胞凋亡、炎症和氧化应激[30]. 越来越多的证据表明，SIRT1与I/R过程中的炎症和氧化应激密切相关。通过靶向SIRT1，下调的miR-29a通过抑制氧化应激和NLRP3介导的焦下垂减轻心肌I/R损伤[31]. 据Zhang等人报道，和厚朴酚通过SIRT1-Nrf2信号通路减轻了大鼠心肌I/R损伤中的心肌氧化损伤和凋亡[32]. 然而，没有研究关注SIRT1与凝血酶之间的关系。在本研究中，我们证明抑制SIRT1抑制凝血酶对H/R损伤心肌细胞炎症和氧化应激的促进作用。
此外，SIRT1已被证明是各种I/R损伤（包括缺血性卒中）中自噬的重要调节器[33]，I/R肝损伤[34]和心肌I/R损伤[35]. 由于自噬在I/R损伤中起保护和有害作用，因此SIRT1也被报道改善或促进I/R或H/R损伤也就不足为奇了。邱等人发现，miR-204可以通过抑制SIRT1诱导的自噬来改善心肌细胞的H/R损伤，并且SIRT1在H/R受伤后上调[36]. 然而，也有报道称，在某些情况下，SIRT1的激活可能会改善I/R或H/R损伤[37–39]. 在这些条件下，H/R损伤后SIRT1的表达可能下调[40]. 所有这些结果表明，SIRT1在I/R和H/R损伤中的作用仍需要更多的研究来进一步表征和证实。我们的研究发现，H/R损伤后，凝血酶治疗后，SIRT1的表达升高。反过来，沉默SIRT1可抑制H/R损伤心肌细胞中凝血酶增强的自噬。
结论
总之，本研究进行了体外实验，旨在研究凝血酶和SIRT1在H/R损伤中的作用。我们首次证明，凝血酶通过激活SIRT1介导的心肌细胞自噬途径影响H/R损伤。这可能为临床上I/R损伤治疗的发展提供一个新的方向。
脚注
数据的可用性
所有数据都可以从手稿或作者的要求中获得。
利益冲突
没有。
支持来源：部门来源
工具书类
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