少突胶质细胞衍生细胞外囊泡作为抗原特异性治疗小鼠自身免疫性神经炎

注射Ol-EV抑制几种EAE模型中的疾病

为了确定Ol-EVs是否可以恢复EAE的免疫耐受，我们在三种活动性EAE模型中测试了它们的作用，即慢性（MOG_35–55/C57BL/6，MBP_{交流（1-11）}/B10.PL）和复发缓解（PLP_139–151/SJL）临床疾病。在临床疾病发展之前或疾病发作之后，我们在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中静脉注射三次同基因Ol-EVs（Ol-EV/i.v.），间隔3天。对照组小鼠静脉注射PBS（假治疗）、PBS中的免疫肽或PBS中HEK-EV。Ol-EV在所有三种EAE模型的预防和治疗方案中均改善了临床疾病，而HEK-EVs没有效果(图2，A到​toF）。F类). 最后一次注射后，当小鼠被处死时，治疗效果持续至少2周。在PLP中_139–151/SJL EAE模型，Ol-EV治疗有疗效，但在进行中的疾病中比其他两种EAE模型的疗效稍差。PLP的相对电阻_139–151/其他研究人员报道了SJL EAE对静脉耐受诱导的作用(23). 我们还测试了Ol-EV在过继性EAE中的治疗效果，其中受体新生C57BL/6小鼠移植了MOG_35–55-特异性CD4⁺来自EAE供体小鼠的T细胞。Ol-EV治疗阻止了EAE进展(图S2，A到C类)因此，在主动EAE和过继EAE中表现出相似的治疗效果。与静脉注射相比，皮下注射Ol-EV并没有改善EAE(图S3，A和B类)提示静脉途径可能对诱导Ol-EV耐受至关重要。

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图2。

Ol-EV/i.v.可预防性和治疗性抑制活性EAE。

(A类到F类)大约10¹⁰将同基因Ol-EV或HEK-EV静脉注射（红色箭头）于C57BL/6、B10.PL或SJL/J小鼠，用MOG免疫以诱导EAE_35–55、MBP_交流1–11，或PLP_139–151分别是。在C57BL/6和B10中，Ol-EV治疗是预防性的（A至C；免疫后1、4和7天（d.p.i）。PL EAE小鼠或SJL/J EAE小鼠中的−7和−2 d.p.i.）或治疗性（C57BL/6和B10.PL EAE小鼠中的d至F；11、14和17 d.p.i，或SJL/J EAE鼠中的24、27和30 d.pi.）。肽MOG_35–55（每只小鼠200μg），MBP_交流1–11（每只小鼠400μg）和PLP_139–151平行静脉注射（每只小鼠100μg）进行比较。每种肽/静脉注射的剂量与EAE诱导免疫所用的剂量相同。这些实验至少做了两次，结果相似(n个=每组10只小鼠）。符号表示日平均值±SEM。数据通过双向方差分析和Bonferroni的多重比较进行分析；NS（不显著）*P（P）< 0.01; **P（P）< 0.001; ***P（P）< 0.0005; ****P（P）< 0.00001. (G公司到我)分别按（D）至（F）所述处理的EAE小鼠的存活率（%）(n个＝每组15至30只小鼠）。数据通过Gehan-Breslow-Wilcoxon试验进行分析***P（P）< 0.0001.

与临床疾病的改善一致，Ol-EV治疗保护EAE小鼠免受神经病理学症状、脱髓鞘和轴突损伤(图S3、C和D类). 此外，Ol-EV治疗减少了浸润CD45的数量⁺和CD4⁺中枢神经系统细胞和脾细胞对免疫肽的回忆反应减弱(图S3、E到H（H）).

虽然静脉注射游离促脑肽对EAE有治疗作用，但重复注射会导致部分小鼠过敏性休克和死亡(24). 总的来说，Ol-EV的效果与MOG相似_35–55和MBP_{交流（1-11）}，我们实验中包含的肽作为阳性对照；然而，Ol-EV/静脉注射被证明比肽/静脉注射更安全(图2G). 这些数据表明，静脉注射Ol-EV可以抑制多种EAE模型中正在进行的临床疾病。

Ol-EV对EAE的抑制作用是髓鞘银依赖性的

为了阐明Ol-EV抑制EAE的机制，我们首先使用MOG测定Ol-EVs对血T细胞的时间效应_35–55-特异性T细胞受体（TCR）转基因2D2小鼠。向初生2D2小鼠注射Ol-EV/i.v.可降低CD4的数量⁺外周血T细胞(图3A)和脾脏(图S4、A到C类)，但动力学明显慢于MOG_35–55/静脉注射。CD4细胞⁺T细胞变成caspase 3⁺Ol-EV注射24小时后，而MOG_35–55仅在6小时后诱导caspase 3的稳健表达(图3，B和​和C）。C类). 这些数据表明CD4细胞凋亡⁺T细胞是Ag特异性的，因为它不是由HEK-EV处理诱导的。

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图3。

Ol-EV产生的髓鞘银在体内呈现给T细胞，Ol-EVs抑制EAE是髓鞘银依赖性的。

(A类)循环血CD4的时间进程（平均值±SEM）⁺静脉注射Ol-EV、对照HEK-EV或MOG治疗MOG-特异性TCR-转基因小鼠（2D2）后6、24和48小时的T细胞_35–55肽（100μg）(n个=每个实验中每组5个）。(B类和C类)循环血CD4中Caspase 3的表达（平均值±SEM）⁺来自注射了Ol-EVs的2D2小鼠的T细胞。(D类到我)2D2或OT-II初始CD4⁺T细胞（5×10⁶)将CFSE标记物注入CD45.1⁺受体小鼠。48小时后，用含有MOG的乳液对小鼠进行皮下免疫_35–55+完全弗氏佐剂（CFA）或OVA_323–339+CFA或巡回注射10¹⁰HEK电动汽车或Ol电动汽车。72小时后，收集脾脏和CD45.2⁺CD4细胞⁺流式细胞术分析T细胞（2D2和OT-II）。（D和F）2D2和OT-II细胞的细胞因子产生（IFN-γ和IL-17A）、PD-1表达（E和I）和增殖（CFSE稀释；G和H）（平均值±SEM）。这些实验进行了两次，结果相似(n个=每组5只小鼠）。采用Bonferroni事后检验对（A）、（F）、（H）和（I）中的数据进行双向方差分析*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.001; ***P（P）< 0.0005; ****P（P）< 0.00001. 未付款吨测试（针对OT-II CD4⁺T细胞组）***P（P）< 0.0001;P（P）< 0.00001. (J型)大约10¹⁰将MOG缺陷Ols、对照Ols、HEK EV或PBS（假手术）的Ol-EVs静脉注射到MOG中_35–55-免疫C57BL/6小鼠。注射日期为图中红色箭头所示的注射日期(K（K）)来自任一WT（MBP）的Ol-EV^+/+)或MBP^−/−将B10.PL Ols静脉注射到接种MBP的B10.PL-EAE小鼠体内_{交流（1-11）}对照组小鼠注射HEK-EVs或PBS（假）。这些实验进行了两次，结果相似(n个=每个实验中每组5至7只小鼠）。符号表示日平均值±SEM。数据通过双向方差分析和Bonferroni的多重比较进行分析****P（P）< 0.00001.

为了进一步探讨Ol-EV对T细胞的影响，我们转移了标记为天然CD4的羧基荧光素二醋酸酯琥珀酰亚胺酯（CFSE）⁺MOG（2D2）或卵清蛋白（OVA）（OT-II）特异性T细胞转化为原始CD45.1⁺小鼠，2天后，我们注射Ol-EV/静脉注射。Ol-EV的作用是Ag特异性的，因为它诱导MOG-特异性CD4的激活和增殖，但不是OVA-特异性的CD4⁺T细胞，通过其干扰素-γ（IFN-γ）和IL-17A的产生来确定(图3，D和​和F）F类)和CFSE稀释(图3，G和​和H）。H（H）). 此外，Ol-EV在2D2上诱导程序性死亡-1（PD-1）表达，但在OT-II CD4上不诱导⁺T细胞(图3，E和​和I）。我). 总的来说，这些数据表明，Ol-EV传递的髓鞘Ag呈现给CD4⁺体内T细胞。

为了确定Ol-EV/i.v.是否以髓磷脂Ag依赖的方式抑制EAE，我们将MOG-缺陷Ol-EV注射到患有EAE的C57BL/6小鼠中，而MBP-缺陷Ol-EV则注射到患有EA的B10.PL小鼠中。使用CRISPR-Cas9系统生成MOG缺乏的Ol-EV；Ols中的Ol-EV来源于用含有MOG-特异性单引导RNA（sgRNA）和Cre的慢病毒转导的Cas9-转基因小鼠，而对照Ol-EVs来源于用含扰物sgRNA和Cre慢病毒转染的Cas9转基因小鼠的Ols(图S5，A到C类). 通过聚合酶链反应（PCR）和ELISA确认Ols和衍生EVs中的MOG基因敲除(图S5、D和E类). MBP缺乏的Ol-EV是从寒战小鼠的Ols中产生的，即MBP^−/−(25). 在这两种EAE模型中，髓磷脂缺乏的Ol-EV未能抑制疾病(图3，J和​和K），K（K）)，证明Ol-EV/i.v.以依赖Ag的方式抑制EAE。

最后，为了测试Ol-EV在EAE中的抑制作用是否仅依赖于髓磷脂Ag，而不依赖于Ol-EVs中的其他成分，Ol-EVs是由Ols特异性产生的，我们设计HEK细胞表达小鼠MOG，并证实这些细胞的EV也包含MOG(图S6，A到C类). 接下来，我们向患有EAE的C57BL/6小鼠注射HEK/MOG-EV或Ol-EV；两种治疗方法对疾病的抑制作用相似(图S6、D到F类)，证实了Ol-EVs的作用取决于其中存在的髓鞘Ag，而不取决于Ols特异性产生的其他成分。

Ol-EV/i.v.优先被单核细胞和中性粒细胞摄取

培养的Ols表达少量主要组织相容性复合体（MHC）II类分子(图S7). 这是非易燃条件下Ols的典型情况(26,27)消除了Ol-EV直接向CD4表达髓磷脂Ags的可能性⁺T细胞。我们假设静脉注射的Ol-EV被吞噬性抗原呈递细胞（APCs）摄取，APCs处理其蛋白并将其呈递给致脑炎T细胞_H（H）细胞。

为了明确鉴定摄取Ol-EV/i.v.的细胞，我们通过用表达Cre的慢病毒转导OPCs，产生了含有Cre重组酶的Ol-EVs。Cre公司⁺Ol-EV静脉注射到幼稚Rosa26.stop中。注射后不同时间处死的Td-番茄报告小鼠(图S8，A和B类). 绝大多数Td-番茄⁺细胞为脾细胞和吞噬血细胞，如单核细胞（43%）、中性粒细胞（28%）和DC亚群（26%），而B细胞只有4%，几乎没有CD3⁺T细胞为Td-番茄⁺(图S8、C和D类). 无Td-番茄⁺在淋巴结（LNs）或中枢神经系统中发现细胞，表明Ol-EVs不能到达淋巴结或穿过完整的血脑屏障（BBB）。然而，当Cre⁺将Ol-EV注射到Rosa26.stop。患有EAE的Td-番茄小鼠，我们发现大量Td-蕃茄⁺CNS中的细胞，包括几乎所有单核细胞衍生的DC（moDCs；CD11b⁺CD11c公司⁺赖氨酸6c^高的中央控制室2⁺赖氨酸6克⁻)中性粒细胞（CD11b⁺CD11c公司⁻赖氨酸6c⁺赖氨酸6克⁺)，而只有一小部分小胶质细胞（CD45^整数CD11b型⁺赖氨酸6c⁻)是Td-番茄⁺(图4C). 无Td-番茄⁺在淋巴组织中发现细胞（CD4⁺，CD8⁺和CD19⁺)或在神经元、星形胶质细胞和Ols中。类似于幼稚的老鼠(图S8，A和B类)，绝大多数Td-番茄⁺脾细胞中的细胞为moDCs和中性粒细胞，少数B细胞为Td-番茄⁺(图4D). 这些数据表明，在患有EAE的小鼠中，摄取Ol-EV/i.v.的细胞主要是外周血、脾脏和CNS中的单核细胞/moDC、常规DC（cDC）和中性粒细胞。

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图4。

Ol-EV被单核细胞、中性粒细胞和cDC摄取，但后两者对于Ol-EVs抑制EAE是不可或缺的。

(A类和B类)确定Td-番茄的浇口策略⁺CD11b型⁺中性粒细胞（Ly6g⁺赖氨酸6c⁺)和单核细胞（Ly6g⁻Ly6c型⁺)来自中枢神经系统和脾脏。这些实验做了两次，结果相似(n个=每组5只小鼠）。(C类和D类)转基因C57BL/6 Rosa26.stop。MOG免疫Td-番茄小鼠_35–55发病时静脉注射约10粒¹⁰含有Cre重组酶的Ol-EV或也含有Cre的HEK-EV。两天后，用流式细胞仪分析脾脏和CNS细胞。CD4代表性直方图⁺T细胞、B细胞（CD19⁺)、小胶质细胞（CD45^低的赖氨酸6c⁻CD11b型⁺)，中性粒细胞（Ly6g⁺)和单核细胞（Ly6c⁺)在脾脏（C）和CNS（D）中表达Td-番茄。Td-番茄的分布⁺注射Cre的小鼠细胞⁺HEK-EV和Cre⁺Ol-EV（如图所示）类似。MFI，平均荧光强度。(E类)通过在发病时腹腔注射抗Ly6g抗体（克隆1A8，每只小鼠每次注射200μg），C57BL/6 EAE小鼠的中性粒细胞被耗尽（13和16 d.pi.）。对照小鼠注射同种对照抗体。静脉注射Ol-EV或HEK-EV，每次14、17和20天（红色箭头）。符号表示日平均值±SEM(F类)CD45.1型⁺用Zbtb46 iDTR或CD45.1照射和移植小鼠⁺骨髓和MOG免疫_35–55.cDC耗尽（Zbtb46⁺MHCII公司⁺CD11c公司⁺)EAE发病后每三天腹腔注射DTX（20 ng/g）。静脉注射Ol-EV或HEK-EV，注射时间分别为13、15和18 d.p.i.（红色箭头）。符号表示日平均值±SEM。所有EAE实验至少进行了两次，结果相似(n个＝每组5至7只小鼠）。EAE实验采用双向方差分析和Bonferroni多重比较进行分析****P（P）< 0.00001.

为了确定哪种吞噬细胞群介导Ol-EV对EAE的抑制，我们在对患有EAE的小鼠进行Ol-EV治疗期间用抗Ly6g抗体耗尽中性粒细胞（血液中中性粒细胞数量减少约75%；图S9，A和B类). 中性粒细胞的耗竭本身对疾病进程没有影响(图4E)，与疾病发作后中性粒细胞耗竭对EAE没有影响的研究结果一致(28). 中性粒细胞的耗竭并不影响Ol-EV对EAE的抑制(图4E)表明中性粒细胞不介导Ol-EV的作用。

接下来，我们研究了cDC（CD11c）的作用⁺MHCII公司⁺Zbtb46型⁺). 我们首先产生了辐射诱导的Zbtb46-DTR（CD45.2⁺)→CD45.1⁺限制白喉毒素（DTX）对cDC作用的骨髓嵌合体小鼠(29) (图S9，C和D类)6周后，我们在这些小鼠中诱导了EAE。我们在发病后开始腹腔注射DTX，然后在EV治疗期间每隔一天注射一次，证实DTX治疗减少了脾脏cDC的数量(图S9、E和F类). cDC的缺失对于Ol-EV抑制EAE也是必不可少的(图4F). 我们无法直接测试单核细胞的作用，因为单核细胞耗竭会阻碍EAE的发展(30). 总之，这些数据表明，单核细胞/moDC通过Ol-EV介导EAE抑制，因为在炎症CNS中，几乎所有这些细胞都获得Ol-EVs，并有能力在MHC II类环境中呈现髓鞘Ags。

Ol-EV/i.v.诱导免疫抑制单核细胞

鉴于我们的数据表明单核细胞/moDC在EAE中介导Ol-EV的作用，我们随后检查了它们的表型。罗莎26.stop。静脉注射Ol-EV及其脾脏和CNS Td-番茄⁺单核细胞被荧光激活细胞分选（FACS）分选（与图4，A和​和B），B类)，并分析其mRNA。与对照组相比，Ol-EV治疗诱导了几个调节基因的上调：精氨酸酶1(精氨酸1),第1页,Il10号机组，干扰素调节因子1(红外1)，甲型肝炎病毒细胞受体2(哈弗cr2)[也称为T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域蛋白3(立方米)]，以及信号转导子和转录激活子3(状态3)，除其他外(图5A). 来自中枢神经系统（而非脾脏）的单核细胞也减少了一些促炎介质、趋化因子（C-C基序）配体2的表达(Ccl2公司)，肿瘤坏死因子-α(天花)，一氧化氮合酶(伊诺斯)，IL-23α亚基(伊利23a)和IL-1β(伊尔1b) (图5A)在EAE发病机制中起重要作用(31). 我们通过相应蛋白质的免疫染色验证了其中一些发现。Ol-EV治疗的小鼠IL-10百分比较高⁺和PD-L1⁺脾脏和中枢神经系统中的单核细胞(图5，B和​和C，C类、和图S10，A和B类)这些小鼠的脊髓中含有较多的Arg1⁺CD11b型⁺单元格(图S11，A和B类). 他们也有较高比例的凋亡（caspase 3⁺和PD-1⁺)CD4细胞⁺脾脏和中枢神经系统中的T细胞(图5，D到​toG（扭矩），G公司、和图S6、H和我). 我们发现免疫抑制单核细胞（PD-L1⁺中央控制室2⁺赖氨酸6c⁺)和凋亡T细胞（caspase 3⁺产品开发-1⁺CD4细胞⁺) (图5H)支持与单核细胞相互作用导致致脑T细胞凋亡并改善疾病的观点。我们还研究了Ol-EV/i.v.是否影响Foxp3的数量或频率⁺CD25型⁺T型_法规与对照组相比没有发现差异(图S6、J和K（K）)，表明T_法规在EAE中不介导Ol-EV的抑制作用。

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图5。

Ol-EVs诱导免疫抑制性moDC。

(A类)脾和CNS单核细胞（CD45⁺CD11b型⁺赖氨酸6c^高的中央控制室2⁺赖氨酸6克⁻Td-番茄⁺)从Rosa26.stop中分类。Cre后2天的Td-番茄EAE小鼠⁺HEK-EV或Cre⁺Ol-EV注射，用定量PCR（qPCR）进行基因表达分析。数值相对于Cre单核细胞进行标准化⁺HEK-EV处理的小鼠，如日志所示₂。使用未配对分析数据吨测试；不显著（NS）*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.001; ***P（P）< 0.0005; ****P（P）< 0.00001. (B类和C类)脾脏和中枢神经系统IL-10的百分比（平均值±SEM）⁺和PD-L1⁺接受HEK-或Ol-EV的EAE小鼠单核细胞(n个=每组5只小鼠）。使用未配对分析数据吨测试****P（P）< 0.00001. (D类到G公司)脾和CNS CD4中caspase 3和PD-1的流式细胞术分析（平均值±SEM）⁺EAE小鼠的T细胞注射三次HEK-或Ol-EV，从发病时开始。使用未配对分析数据吨测试**P（P）< 0.001; ***P（P）< 0.0005. 这些实验进行了两次，结果相似(n个=每组5只小鼠）。(H（H）)矛兵的第页脾和CNS单核细胞（PD-L1）的相关性分析⁺中央控制室2⁺赖氨酸6c⁺)半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3⁺和PD-1⁺CD4 T细胞(n个= 10). (我)C57BL/6 EAE小鼠在疾病高峰期移植2×10⁶分类Td-番茄⁺用Ol-EV（红色）或HEK-EV（黑色）治疗的EAE小鼠的CNS中的moDC（红色箭头）。(J型)C57BL/6 EAE小鼠在第12天和第15天腹膜内注射阻断性抗PD-L1抗体（每只小鼠每次注射200μg；克隆10F.9G2）或同种型对照抗体。HEK-或Ol-EV在第13天、第16天和第19天静脉注射（红色箭头）。符号表示日平均值±SEM。所有EAE实验至少进行了两次，结果相似(n个=每组7只小鼠）。EAE实验在（I）中通过Mann-Whitney检验进行分析*P（P）< 0.01. In（J），采用双向方差分析和Bonferroni的多重比较*P（P）<0.01和****P（P）< 0.00001.

最后，为了在功能上验证Ol-EV诱导的moDC的免疫抑制表型，我们移植了中枢神经系统衍生的Td番茄⁺Cre治疗EAE小鼠的moDCs⁺Ol-EV进入患有持续疾病的小鼠(图5I). Td-番茄的单次转运⁺moDCs诱导病害快速恢复，而对照Td-番茄转移⁺Cre治疗小鼠的moDCs⁺HEK-EV没有改变疾病进程(图5I). 这些数据表明，在Ol-EV/i.v.治疗后，moDC获得免疫抑制表型，并通过导致致脑炎T细胞死亡来改善疾病。

Ol-EV/i.v.诱导的单核细胞PD-L1对EAE抑制至关重要

鉴于PD-1及其配体在免疫耐受中的重要性(32–34)，我们研究了Ol-EV是否通过PD-1/PD-L1相互作用抑制EAE。我们在发病后、Ol-EV注射前24小时静脉注射抗PD-L1抗体。在抗PD-L1治疗后，小鼠患上了一种严重的疾病，对Ol-EV/i.v.治疗没有反应(图5J). 相反，用抗体阻断PD-L2并不能阻止Ol-EV抑制EAE(图S11C). 为了在不使用抗PD-L1抗体的情况下确认PD-L1在Ol-EV作用中的重要性，我们移植了PD-1^−/−或野生型（WT）CD4⁺T细胞进入RAG1^−/−用MOG免疫小鼠_35–55用于EAE诱导，并在发病后，静脉注射Ol-EV。小泡抑制WT CD4转染小鼠的EAE⁺T细胞，但不在使用PD-1转移的小鼠中^−/−CD4细胞⁺T细胞(图S11D). 这些数据表明，PD-1与PD-L1的相互作用，而不是与PD-L2的相互作用对于Ol-EV在EAE中的治疗效果至关重要。

Ol-EVs以IL-10依赖的方式诱导PD-L1表达

Ol-EV/i.v.诱导脾和CNS单核细胞IL-10表达(图5和​和6），6)，增加了IL-10通过诱导PD-L1表达等途径参与Ol-EV抑制EAE的可能性(6). 为了验证这一点，我们首先在缺乏IL-10受体β亚单位（IL-10Rβ）的小鼠中诱导EAE^−/−)并在疾病发作时静脉注射Ol-EVs或HEK-EV。在缺乏IL-10Rβ的情况下，Ol-EV不能抑制EAE(图6，A和​和B），B类)以及从Ol-EV处理的IL-10Rβ的CNS中分离的白细胞数量^−/−小鼠没有像WT小鼠那样减少(图6C). 接下来，为了确定Ol-EV治疗后哪个细胞群体产生IL-10并诱导单核细胞PD-L1表达，我们与WT或IL-10进行了不匹配共培养^−/−CD4细胞⁺T细胞和APC（CD11b⁺CD11c公司⁺MHCII公司⁺CD19编号⁻)来自MOG_35–55-免疫小鼠并添加Ol-EV或HEK-EV。髓系APC中IL-10缺乏阻止Ol-EV对髓系细胞PD-L1的诱导(图6，D和​和G），G公司)，而CD4缺乏IL-10⁺T细胞没有作用(图6，E和​和F）。F类). 这些数据表明，Ol-EVs诱导单核细胞/DCs产生IL-10，进而以自分泌方式诱导PD-L1表达。

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图6。

Ol-EV以IL-10依赖的方式诱导PD-L1。

(A类)WT和IL-10Rβ的临床病程^−/−EAE小鼠注射三次（红色箭头）约10¹⁰Ol-EV或HEK-EV。EAE实验至少进行了两次，结果相似(n个=每组7只小鼠）。数据通过双向方差分析和Bonferroni的多重比较进行分析****P（P）< 0.00001. (B类)疾病严重程度的累计得分（平均值±SEM）。(C类)在免疫后第25天（p.i.）处死小鼠，CD45数量⁺通过流式细胞术和血细胞仪测定从CNS中获得的白细胞。数据表示为平均值±SEMn个=每个实验中每组7人。(D类到G公司)APC和总CD4⁺从MOG的脾脏和淋巴结中分离出T细胞_35–55-免疫WT和IL-10^−/−小鼠在10 d.p.i.不匹配细胞共培养（WT APC+WT CD4⁺; WT-APC+白细胞介素-10^−/−CD4；白介素-10^−/−APC+WT CD4⁺; 白介素-10^−/−APC+IL-10^−/−CD4细胞⁺)用Ol-EVs、HEK-EVs或PBS治疗3天。流式细胞术分析单核细胞/树突状细胞（CD11b）中PD-L1的表达⁺MHCII公司⁺CD19编号⁻赖氨酸6克⁻)（D和F）和CD4中的PD-1⁺T细胞（E和G）。这些实验进行了两次，结果相似。数据表示为平均值±SEMn个=每个实验中每组5人。（B、C、F和G）*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01; ***P（P）< 0.0005; ****P（P）通过双向方差分析和Bonferroni的事后检验，<0.00001。

我们感谢K.Regan编辑了这份手稿。基金：这项工作得到了NIH（5R01AI106026和R01A1124386）向A.R.提供的资助。