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自然医学。作者手稿；PMC 2021 10月1日提供。
以最终编辑形式发布为：
《国家医学》，2020年10月；26(10): 1636–1643.
2020年8月24日在线发布。 数字对象标识：10.1038/s41591-020-1051-9
预防性维修识别码：项目管理委员会7869028
美国国立卫生研究院：美国国立卫生研究院1660695
PMID：32839624

炎症细胞因子特征预测新冠肺炎的严重程度和生存率

黛安·玛丽·德尔瓦莱,1,2,三，14 Seunghee Kim-Schulze先生,1,2,三，4,14 黄新辉,5,6,7,14 诺姆·D·贝克曼,8 莎伦·尼伦伯格,8,9 王波（Bo Wang）,10 约尼特·拉文,10 塔里亚·H·斯瓦茨,10 迪普·马杜里,10 Aryeh股票,11 托马斯·马龙,2,三，10 谢慧,1 Manishkumar帕特尔,1 凯文·塔巴勒斯,1 奥利弗·范·奥克伦,8 阿德布·拉赫曼,1,2,三，8 帕特里夏·科瓦奇,8,9 朱迪思·阿贝格,10 埃里克·沙特,8 桑达尔·贾加纳特,10 马杜·马祖姆达尔,5,6,7 亚历山大·查尼,8 阿道夫·菲波·贝坦库尔,11 达莫达拉·拉奥·门杜,11 杰弗里·詹,11 大卫·雷奇,12 基思·西格尔,10 卡洛斯·科尔登·卡多,11 马克·费尔德曼,13 萨米尔·帕雷克,三，4,10 米里亚姆·梅拉德,1,2,三，4,10和萨查·格尼亚特1,2,三，4,10,11,⊠
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

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补充资料

摘要

多项研究表明，严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）引起的过度炎症反应是导致疾病严重程度和死亡的主要原因。然而，严重缺乏致病性炎症的预测性生物标记物来帮助指导可靶向的免疫途径。我们实施了一项快速多重细胞因子分析，以测定2019年冠状病毒肺炎（COVID-19）住院患者在纽约西奈山卫生系统入院时的血清白细胞介素（IL）-6、IL-8、肿瘤坏死因子（TNF）-α和IL-1β(n个=1484），随访至入院后41天（中位数，8天），收集临床信息、实验室测试结果和患者结果。我们发现，住院时高血清IL-6、IL-8和TNF-α水平是患者生存的独立预测因素(P（P）< 0.0001,P（P）=0.0205和P（P）分别为0.0140）。值得注意的是，在调整疾病严重程度、常见实验室炎症标志物、缺氧和其他生命体征、人口统计学和一系列合并症时，IL-6和TNF-α血清水平仍然是疾病严重程度和死亡的独立和重要预测因素。这些发现在第二组患者中得到验证(n个= 231). 我们建议在管理和治疗新冠肺炎患者时应考虑血清IL-6和TNF-α水平，以分层前瞻性临床试验，指导资源分配，并告知治疗方案。

截至2020年7月下旬，由SARS-CoV-2感染引起的新型冠状病毒肺炎已在全世界造成1550多万人感染，634000人死亡。最近对美国新冠肺炎疫情最初中心纽约市医院的一项研究报告称，2020年3月，21%的确诊新冠肺炎住院患者死亡1这些发现与西奈山卫生系统观察到的结果一致2,三。目前尚无针对新型冠状病毒肺炎的治疗或预防疗法，强调需要加强对SARS-CoV-2发病机制的当前了解，以合理开发治疗方法。

最近的研究表明，除了直接的病毒损伤外，不受控制的炎症也会导致新冠肺炎的严重程度（参考文献。4,5). 与这一假设一致，高水平的炎症标记物，包括C反应蛋白（CRP）、铁蛋白和D二聚体，高中性粒细胞与淋巴细胞比率6–9炎症细胞因子和趋化因子水平升高6,8–11已在严重疾病患者中观察到。致病性炎症，也称为细胞因子风暴，与之前感染其他严重冠状病毒（包括SARS-CoV和中东呼吸综合征冠状病毒）的患者相似12与用嵌合抗原受体修饰（CAR）T细胞治疗的癌症患者中观察到的细胞因子释放综合征（CRS）相似13Tocilizumab是一种IL-6受体抑制剂，是美国食品和药物管理局（FDA）批准的治疗CAR T细胞患者CRS的药物14多个单中心研究已使用IL-6抑制剂治疗新型冠状病毒肺炎患者，并获得了一些临床益处15和报告的故障14除IL-6外，一些细胞因子在CRS中升高并导致组织损伤。TNF-α在几乎所有急性炎症反应中都很重要，是炎症的放大因子。TNF-α阻断剂已被用于治疗十多种不同的自身免疫性炎症疾病，这表明这可能是一种潜在的治疗方法，可以减少新冠肺炎患者的器官损伤（参考文献。16). IL-1也是一种高度活性的促炎细胞因子，阻断IL-1活性的单一疗法可用于治疗炎症性疾病，包括类风湿关节炎和遗传性自身炎综合征，如冰毒相关综合征，并导致疾病严重程度持续降低17IL-8是一种强效的促炎细胞因子，在炎症过程中对中性粒细胞的募集和激活起着关键作用18考虑到SARS-CoV2感染患者中经常出现中性粒细胞增多，IL-8可能参与了新冠肺炎的病理生理学。

为了减轻SARS-CoV-2引起的炎症，免疫调节剂，包括针对细胞因子的小分子和单克隆抗体，已迅速进入临床试验4许多FDA批准的药物已经在临床上以非标签方式常规使用。考虑到这些药物的使用带来的显著副作用，迫切需要确定生物标记物，以准确预测哪些患者会因未经检查的炎症反应而恶化，并帮助指导合理的靶向免疫调节治疗策略。

在这项研究中，我们询问炎症细胞因子水平是否有助于预测新冠肺炎患者的病程和结局。为了增强细胞因子分析的相关性，我们将重点放在四种致病性细胞因子IL-6、IL-8、TNF-α和IL-1β上，并使用临床可用或实验药物来抵消它们。临床标本在ELLA微流体平台上进行分析（参见方法). 我们之所以选择这个平台，是因为分析结果的快速周转时间（样本采集后3小时内），使这些结果具有潜在的可操作性。

我们跟踪了1484名疑似或确诊的新冠肺炎患者从住院日到出院或死亡日在西奈山卫生系统住院。我们在入院时测量了血清IL-6、IL-8、TNF-α和IL-1β水平，并将这些结果与疾病严重程度的临床和实验室标志物以及疾病结局相关联。我们发现，与实验室和临床严重程度因素的其他标准生物标志物测量值无关，患者出现时血清IL-6和TNF-α水平升高是疾病严重程度和生存率的有力预测因素。这些结果表明，多重细胞因子分析可用于对患者进行分层，并指导资源分配和前瞻性干预研究。

结果

队列特征和细胞因子范围。

根据快速机构审查委员会（IRB）的批准，我们从1484名疑似或确诊SARS-CoV-2感染的患者中获取了实验室和健康信息，这些患者于2020年3月21日至4月28日在纽约市西奈山卫生系统住院。根据纽约州卫生部的紧急使用批准，我们在临床实验室实施了ELLA微流体可溶分析物测试，以测量已知在CAR T细胞相关CRS-IL-6、IL-8、，TNF-α和IL-1β，并评估其与严重程度和生存率的相关性。在接受检测的患者中，1257人的严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型聚合酶链式反应（PCR）检测呈阳性或推定阳性，而其余167人无法得到证实。

使用ELLA快速检测酶联免疫吸附试验（ELISA）微流控平台对1953份标本进行分析，以量化循环IL-6、IL-8、TNF-α和IL-1β血清水平(方法和扩展数据图1a–e（电子）). 在1484名累积患者中的大多数患者中，样本采集一次，通常在入院时进行（中位数为1.2天；四分位间距（IQR）为0.7–3.0天）。患者子集(n个=244）在入院后进行了不止一次的细胞因子测量，尽管对于所有的预后分析，只使用了第一次可用的测试。对于整个队列，从第一次细胞因子测试到最后一次随访的中位时间（即出院日期、死亡日期或住院日期，以最晚者为准）为8 d（IQR，3.1-16.0 d，直至41 d）。患者特征列于表1作为参考，并作为对照，在本研究开始之前收集的细胞因子测量在健康献血者和在CAR T细胞治疗后出现或未出现CRS的癌症患者中进行19,20.

表1|

患者特征

PCR证实的SARS-Cov-2患者PCR证实无SARS-Cov-2的患者
中位年龄（IQR）-年63 (53–72)60 (49–73)
男性787/1,309 (60.1%)90/167 (53.9%)
种族/民族-西班牙裔577/1,268 (45.5%)62/167 (37.1%)
种族/民族-非裔美国人278/1268（21.9%）46/167 (27.5%)
种族/民族-白人277/1,268 (21.8%)43/167 (25.7%)
种族/民族-亚洲73/1,268 (5.8%)5/167 (3.0%)
种族/民族-其他63/1,268 (5.0%)11/167 (6.6%)
肥胖（BMI≥30）465/1,176 (39.5%)34/149 (22.8%)一
合并症-高血压420/1,268 (33.1%)67/167 (40.1%)
糖尿病合并症293/1,268 (23.1%)34/167 (20.4%)
合并疾病-CKD167/1,268 (13.2%)第27页（16.2%）
共病癌症（活动）147/1,267 (11.6%)37/166 (22.3%)
共病-心房颤动123/1,267 (9.7%)9/167 (5.4%)一
共病-CHF69/1,268 (5.4%)18/167 (10.8%)一
共病性心律失常72/1,268 (5.7%)13/167 (7.8%)
共病-COPD44/1,268 (3.5%)18/167 (10.8%)
睡眠呼吸暂停合并症50/1,268 (3.9%)6/167 (3.6%)
吸烟电流55/965 (5.7%)27/143 (18.9%)一
吸烟史293/965 (30.4%)53/143 (37.1%)
检测到SARS-CoV-2 PCR1,257/1,257 (100.0%)0/167 (0.0%)一
检测到SARS-CoV-2抗体65/73 (89.0%)3/5 (60.0%)
最大严重性得分b条-轻度/中度505/1168（43.2%）99/150 (66.0%)一
最大严重性得分b条-严重的285/1,168 (24.4%)22/150（14.7%）一
最大严重性得分b条-严重伴有终末器官损伤378/1,168 (32.4%)29/150 (19.3%)一
SOFA得分=0309/870 (35.5%)42/119 (35.3%)
SOFA得分=1163/870 (18.7%)24/119 (20.2%)
SOFA得分>1（中位数=4）398/870 (45.7%)53/119 (44.5%)
急性呼吸窘迫综合征199/1,267 (15.7%)11/167（6.6%）一
随访期间死亡269/1,317 (20.4%)13/167 (7.8%)一
一通过Fisher精确检验或χ2检验，PCR-阳性和PCR-阴性亚群之间存在显著差异。
b条方法中描述的严重程度评分是西奈山传染病和肺病团队根据文献中使用的标准建立的新冠肺炎的综合衡量标准，包括氯化铬、丙氨酸氨基转移酶水平、呼吸器/呼吸器和血管升压药的使用和类型（参见方法). 此处所示的严重程度得分是整个观察期内达到的最大值，但对于所有其他分析，使用了第一次测量时的严重程度分数。分母表示具有可用信息的患者数量。慢性肾病；充血性心力衰竭；慢性阻塞性肺病；抗体。

我们发现IL-6(P（P）<0.0001），IL-8(P（P）<0.0001）和TNF-α(P（P）<0.0001），与健康供者血清或从无CRS的CAR T细胞治疗患者中分离的血浆相比，新冠肺炎血清显著升高(图1). 所评估的四种细胞因子具有不同的检测范围，IL-6具有最动态的特征，其次是IL-8和TNF-α(图1和扩展数据图1d). 与以前的报告一致，IL-1β水平大多较低或在0.1pg ml的检测极限−1，尽管该测定能够检测到不同水平的重组对照细胞因子(扩展数据图1b). 因此，绝大多数患者表现为细胞因子升高或细胞因子风暴，但与CAR T CRS期间细胞因子的协同增加（平均Spearman第页=0.6），在新型冠状病毒肺炎样本中，细胞因子水平之间没有高度相关性（平均Spearman’s第页=0.4），根据每个独立细胞因子的相对分布，提示细胞因子表达的差异模式和潜在的不同临床表现(扩展数据图1e,​，f）。如果). 由于根据CAR-T后定义的截止值，对新冠肺炎中每种细胞因子分析的样本中有70%以上的样本属于CRS范围，并且由于我们没有确定的IL-1β截止值，我们决定使用高于新冠肺炎患者每种细胞素中位数的截止值来区分高值和低值。按照方法中的描述进行经验测试后，选择用于进一步统计分析的截止值大于70pg ml−1对于IL-6，大于50pg ml−1对于IL-8，大于35pg ml−1对于TNF-α和大于0.5pg ml−1IL-1β。

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测量的细胞因子范围。

西奈山卫生系统住院的新型冠状病毒肺炎患者所有测试血清样本中细胞因子的检测范围（橙色，n个=1959），与健康献血者的血清样本（黑色，n个=9）和多发性骨髓瘤患者的血浆样本（蓝色，n个=151）和期间（红色，n个=121）由CAR T细胞疗法诱导的CRS。粗条表示中值，误差条表示95%置信区间，每个值用点表示。双边Mann–Whitney的两两比较t吨-测试表明，与非CRS癌症患者健康献血者的样本相比，新冠肺炎样本中IL-6、IL-8和TNF-α的水平显著升高(****P（P）< 0.0001, ***P（P）< 0.001, **P（P）<0.01和*P（P）< 0.05; NS，不显著）。中位数、平均值和范围如所示扩展数据图1d（误差带表示95%置信区间的中位数）。血液透析。

与人口统计学和合并症的关系。

我们在每个患者中使用第一个可用的细胞因子测量来测量与人口统计学和合并症的相关性。我们假设，由于SARS-CoV-2感染，与健康献血者和非CRS CAR-T治疗的患者相比，新冠肺炎患者的细胞因子升高。在1484名有新冠肺炎症状的住院患者中，11.7%的患者经PCR检测为SARS-CoV-2阴性，因此被排除在进一步的单变量分析之外。应当注意的是，根据随后的检测结果，在五名经PCR检测SARS-CoV-2阴性的患者中，有三名患者的SARS-CoV 2 S棘突蛋白抗体可能存在假阴性检测。尽管有类似的合并症，但与严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型感染检测呈阳性的患者相比，这部分患者的细胞因子水平显著降低(图2a). 在其余经PCR检测为SARS-CoV-2阳性的患者中，1097名患者有完整的人口统计学和合并症信息。

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通过PCR状态、人口统计和合并症确定的细胞因子水平。

观察到的细胞因子水平与一，SARS-CoV-2 PCR状态（阴性表示SARS-CoV-2 PCR检测阴性的COVID-19类呼吸道症状患者）(n个=1422个独立患者样本）；b条人口统计学（不包括PCR阴性，有1298、1307、1174和1131名患者的性别、年龄、BMI和种族/民族数据）；和c（c）共病（不包括PCR阴性，964名和1266名个体患者的吸烟和共病诊断数据）。指示单个测量值的散点图（点）；粗线为中线；代表95%CI的误差条；和双边Mann-Whitney单变量统计分析t吨-测试(****P（P）< 0.0001, ***P（P）< 0.001, **P（P）<0.01和*P（P）< 0.05; NS，不显著）。这里没有显示COPD、HIV、睡眠呼吸暂停和活动性癌症，它们的细胞因子水平没有显示出任何显著差异。黄色突出显示的是调整所有人口统计学和共病变量后仍然显著的统计值，黄色阴影表示调整后P（P）值（光：*，中：**，高：***，饱和：****）。灰色区域表示细胞因子水平低于相应的截止值。

男性IL-6水平显著高于女性(P（P）<0.0001），但其他三种细胞因子没有性别差异(图2b). 随着年龄段的增加（<50岁、50-70岁和>70岁），IL-6、IL-8和TNF-α水平增加(图2b)作为连续变量进行评估时，年龄也是如此。任何细胞因子与体重指数（BMI）均无相关性。吸烟和种族/民族与IL-6、IL-1β和/或TNF-α的单变量关联较弱，但具有显著性，这在调整其他协变量后未得到证实，但IL-1β与TNF-β除外，与西班牙裔和非裔美国人相比，其仍显着更高。

然后我们评估细胞因子水平是否与下列共病相关表1根据单变量分析，我们发现慢性肾脏病（CKD）、糖尿病和高血压患者的TNF-α和IL-8显著增加，而充血性心力衰竭（CHF）患者的TNF-α也增加。有房颤病史的患者IL-6和IL-8升高。细胞因子与活动性癌症、哮喘、慢性阻塞性肺病（COPD）、人类免疫缺陷病毒（HIV）和睡眠呼吸暂停症之间没有相关性。

使用多变量回归模型，我们证实CKD是唯一与细胞因子水平升高显著相关的共病，而糖尿病和高血压患者TNF-α升高可由其他变量解释。在人口统计学变量中，年龄和性别（IL-6）仍与细胞因子水平显著相关，如单变量分析所示。因此，在随后的分析中，我们将人口统计学和合并症作为混杂变量。通过ELLA测量的细胞因子水平没有受到与入院相关的检测时间的显著影响。因此，这种时间差异不被视为潜在的混淆因素。

细胞因子与死亡风险之间的关系。

接下来，我们考虑了影响生存率的因素，定义为死亡时间，并通过单变量Kaplan–Meier分析对整个队列中的细胞因子进行了审查。我们发现，只有年龄和CKD与新冠肺炎死亡风险增加显著相关。我们评估了细胞因子是否可以根据新冠肺炎住院后的总生存率和疾病严重程度来区分患者。使用统计分析部分中描述的截止值，按细胞因子水平高低对患者进行分层，我们发现每个细胞因子都可以根据入院后的首次可用测量值预测患者的总体生存率。在调整人口统计学和共病因素（即性别、年龄、种族/民族、吸烟、CKD、高血压、哮喘和CHF）后，每种细胞因子都可以独立预测总生存率(图3).

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细胞因子水平和存活率。

在对性别、年龄、种族/民族、吸烟、CKD、高血压、哮喘和CHF进行多变量调整后，基于所测每个细胞因子的生存曲线(n个= 1,246). Cox回归模型显示了从ELLA细胞因子测试到最后随访日期（出院、死亡或仍在医院，以较晚者为准）的每种细胞因子的CI总生存率，其显著性由P（P）值和HR。如果细胞因子高（红色，高于70 pg ml的临界值−1对于IL-6，50 pg ml−1对于IL-8，35 pg ml−1TNF-α和0.5 pg ml−1IL-1β）与低（蓝色，低于临界值）。每行表示随访时间内的预测生存概率，误差带表示相应的双侧95%置信区间。

当在模型中同时考虑所有细胞因子时，即使在对人口统计学和合并症进行调整后，除IL-1β外，所有细胞因子仍然显著(n个=1,097). 这证实了每种受试细胞因子的相对独立性，仅年龄（50-70岁vs<70岁，危险比（HR）=2.09（1.25-3.49）；>70岁与<50岁相比，HR=3.76（2.24-6.33）、IL-6（HR=2.23（1.61-3.09））、IL-8（HR=1.41（1.05-1.89））和TNF-α（HR=1.50（1.09-2.07））在调整后与生存率降低显著相关(P（P）=0.0049,P（P）<0.0001,P（P）=0.0205和P（P）分别为0.0140）。该模型的内部验证获得了0.738的未修正一致性指数、0.705的十倍变异系数（CV）一致性指数和0.716的自举校正一致性指数。作为进一步验证，我们还使用竞争风险模型进行了该分析，在该模型中，存活出院的患者被视为竞争事件，住院患者被审查，并发现了相同的结论，其中高IL-6、，IL-8和TNF-α与不良预后显著相关，而与人口统计学和合并症无关(补充表1). 我们在接下来的分析中使用了竞争风险模型。

使用细胞因子补充风险分层。

接下来，我们询问细胞因子是否对风险分层和生存有价值，是否独立于已知的实验室和临床严重程度指标（即温度、O2饱和度、呼吸频率和严重程度评分见方法和扩展数据图2). 我们首先测试了四种测试的细胞因子水平是否与已知的炎症标记物CRP、D-二聚体和铁蛋白相关，并发现所有细胞因子与每次测量都有很强的相关性，IL-6和IL-1β与发烧额外相关(图4a). 此外，IL-6和IL-8水平与严重程度（中度、重度和重度，伴有末端器官损伤）密切相关，严重程度考虑了肺部成像、肌酐清除率（CrCl）、血管活性物质和通气的使用，而TNF-α没有区分中度和重度新冠肺炎的表现或机械通气的使用，但是，只是随着终末器官损伤而增加。在校正CRP、D-二聚体、铁蛋白和所有共病水平后，观察细胞因子对生存的预测价值，IL-6和IL-8仍然独立预测生存，因此显示出这些已知标记物的附加值(补充表2). 当包括其他严重程度指标（包括严重程度评分）时，IL-8不再预测生存率，可能是因为这些附加参数是竞争风险模型的更强因素(补充表3).

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细胞因子水平与严重程度相关，并独立预测生存率。

细胞因子水平与既定炎症和严重程度测量值的相关性。一，每个细胞因子与每个指标的相关性(n个=1106表示发烧，n个O=11122饱和，n个CRP=1023，n个D二聚体=926，n个铁蛋白=1017，n个=1038，血小板和n个=1023疾病严重程度评分），使用与图2图例。误差条表示中位数±95%置信区间。b条、竞争风险分析(n个=671）在调整以下变量后，通过IL-6、IL-8、TNF-α、IL-1β、年龄、性别、种族/民族、吸烟状况、哮喘、心房颤动、癌症、CHF、CKD、COPD、糖尿病、高血压、睡眠呼吸暂停、严重程度、最大收缩压、2最小饱和度、D-二聚体、白蛋白、钙、氯化物和血小板计数。c（c）Kaplan–Meier单变量分析正常人IL-6和TNF-α水平的生存率(n个=257），低(n个=258）或非常低(n个=287）O2饱和度，或中度(n个=588）与严重冠状病毒肺炎伴终末器官损害(n个=136），在第一次可用测试时测量。EOD，末端器官损伤。

然后，我们研究了细胞因子与炎症、肾功能、心肌劳损和呼吸窘迫等一系列公认标记物之间的相关性，以了解它们对该队列生存率的影响。通过非监督分析，中性粒细胞、白细胞、CRP、铁蛋白、D-二聚体、乳酸脱氢酶和低O2除TNF-α与肌酐等组织损伤标记物密切相关外，饱和与所有细胞因子共同聚集(扩展数据图3). 使用反向消除过程选择信息最丰富的变量，定义每个可用的测量值，作为生存率与细胞因子竞争风险回归分析中的混杂因素，我们发现严重程度评分、O2饱和度、血小板、低白蛋白、收缩压、D-二聚体、白蛋白、钙、氯化物和剩余血小板计数。值得注意的是，在竞争风险回归分析中评估细胞因子对生存率的预测值时，即使使用这些测量值作为变量进行调整(n个=802），我们发现IL-6和TNF-α与不良预后显著相关(图4b). 使用该模型进行的内部验证获得了0.794的未修正一致性指数和0.764的修正指数（十倍CV和bootstrap）。在一组患者中(n个=663），顺序器官衰竭评估（SOFA）严重程度量表评分也可用，我们证实IL-6（HR=2.9，P（P）<0.0001），IL-8（HR=1.6，P（P）=0.04）和TNF-α（HR=1.6，P（P）=0.03）与生存率低相关，在校正了上述所有最具信息性的变量后，包括SOFA严重程度增加（作为连续变量或SOFA评分≤1与>1）。

最后，我们应用了我们分析中的生存模型（主要模型：细胞因子、人口统计学和合并症；次要模型：主要模型加上炎症、肾功能、心肌劳损和呼吸窘迫的标记物）对2020年4月22日至6月16日期间收集的231名SARS-CoV-2 PCR检测呈阳性的住院患者进行独立验证，这些患者具有可用的细胞因子、人口统计学、共病性和实验室数据。接收器工作特性曲线（AUC）图下的面积表明，主要模型在第3天到第31天期间表现良好，AUC范围为0.65到0.76(扩展数据图4a). 二级模型的AUC稍高，从0.70到0.88不等(扩展数据图4d). 两种模型的综合AUC分别为0.68和0.74。直到第20天，实际生存概率和预测生存概率相似，之后两条曲线分离(扩展数据图4b,​，e）。e（电子）). 原始模型和验证队列之间的预后指数分布没有显著差异(P（P）=0.11）和二级模型(P（P）=0.06) (扩展数据图4c,​，f如果).

因此，我们得出结论，IL-6和TNF-α在疾病严重程度和生存率方面独立预测患者预后(补充表4). 即使在对风险因素进行分层后P（P）值，即严重性得分，O2饱和度和年龄IL-6和TNF-α仍然是生存的独立预测因素，IL-8也达到显著水平(图4c和补充表5).

药物和治疗对细胞因子水平的影响。

虽然我们的数据没有证明IL-6和TNF-α在疾病转归中的致病作用，但我们希望阐明各种治疗方法对所测细胞因子的影响，作为这些炎症因子产生致病作用的潜在缓解策略。从244名接受过一次以上ELLA细胞因子检测的患者中，通过绘制从治疗开始到首次ELLA检测的时间，我们能够评估各种治疗和实验药物对细胞因子水平的影响(图5a). 我们对接受抗IL-6受体单克隆抗体tocilizumab非标签治疗的进行性呼吸衰竭和明显全身炎症患者子集的分析表明，这些患者开始时IL-6水平升高，然后血清IL-6短暂升高，这以前被解释为IL-6受体药物饱和后清除被破坏21这种短暂升高仅见于IL-6，而非IL-8，而TNF-α在治疗后似乎逐渐降低。与未接受这些药物的患者相比，接受皮质类固醇和雷德西韦治疗的患者随着时间的推移，IL-6的水平分别迅速而逐渐降低，但我们观察到对TNF-α没有影响。羟基氯喹、对乙酰氨基酚或抗凝剂并未明显改变细胞因子水平。在皮质类固醇中，地塞米松对IL-6的降低作用最大(图5b)，可能支持最近RECOVERY试验的结果，该试验显示该药物对重症住院患者的临床益处22.

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治疗对细胞因子水平的影响。

一，治疗对IL-6（顶行）、IL-8（中行）和TNF-α（底行）的影响。线条（红色：有指示治疗；蓝色：无指示治疗）通过平滑样条曲线表示最佳拟合曲线，该样条曲线基于首次接触或治疗开始的时间，对每个细胞因子水平的纵向唯一时间点分布进行平滑样条。在代表1315名患者不同时间点的1670份样本中，有可用信息，来自接受托珠单抗、皮质类固醇（泼尼松、甲基强的松龙或地塞米松中的任何一种）、瑞德西韦、对乙酰氨基酚、羟氯喹和/或抗凝剂（阿哌沙班、依诺肝素、肝素或利伐沙班）的患者的样本数量分别为73、305、76、620、1333和1113。b条，不同皮质类固醇对IL-6的影响。

讨论

我们旨在了解炎症细胞因子在新型冠状病毒肺炎病程和结局中的作用。我们建立了一种快速多重细胞因子试验，以测量IL-6、TNF-α和IL-1β，这些已知的炎症和器官损伤标记物，以及CXCL8/IL-8，因为其在中性粒细胞的募集和激活中具有强大作用，而中性粒细胞在新冠肺炎患者中通常升高（参考文献。23). 值得注意的是，阻断这些细胞因子的药物要么是FDA批准的，要么是在临床试验中。通过对一个月内1400多名住院患者的研究，我们确定新型冠状病毒肺炎与患者出现时所有四种细胞因子的高水平相关。重要的是，我们的观察结果表明，细胞因子模式可以预测新冠肺炎的存活率和死亡率，独立于人口统计学和共病性，也可以预测疾病严重程度的标准临床生物标志物，包括实验室和临床因素。基于这些观察结果的模型在另外231项专利的验证队列中得到了证实。我们发现，在调整人口统计学特征和合并症后，IL-6是生存、超越或优于CRP、D-二聚体和铁蛋白的最可靠的预后标志之一。当包括有关通气和终末器官损伤的信息时，它仍然与严重程度和预后预测独立相关。此外，即使根据临床评估和IL-6调整其他风险因素，如年龄、性别、缺氧、疾病严重程度评分，已知TNF-α升高也会导致器官损伤，是不良预后的有力预测因子。我们的细胞因子小组还包括IL-8，它与生存时间相关，尽管在多变量调整后被其他严重性因素所掩盖，IL-1β的检测结果很差，因此只有边际预测值。尽管常规用于确定炎症和严重程度的经典标记物仍有助于对患者进行分层，但当结合多变量分析时，许多标记物可能由于共线性而不再显著，而IL-6和TNF-α仍然独立预测预后。本文使用的总体生存率和竞争风险模型一致显示，当所有受试细胞因子都在模型中时，TNF-α和IL-6的显著预后价值，以及人口统计学、合并症和其他临床和实验室测量，突出了我们的发现的稳健性。值得注意的是，与新冠肺炎相关的细胞因子反应与与脓毒症和CAR T细胞相关的传统细胞因子风暴截然不同，细胞因子水平在数天和数周内持续升高，细胞因子之间相对缺乏协调。这增加了抗细胞因子治疗缓解策略的可能性，尽管哪种策略及其使用的机会窗口仍有待确定。基于与细胞因子水平的机械关联来指导此类治疗可以提供一种合理的方法。

世界各地已经启动了用FDA批准的药物阻断IL-6信号传导的试验，在小规模、单中心、观察性研究中，在一部分患者身上看到了一些临床益处15,24相反，对抗IL-6受体单克隆抗体沙利鲁单抗与安慰剂的随机试验进行中期分析，发现仅对严重但非中度疾病患者有潜在益处(https://investor.regeneron.com/news-releases/news-relase-details/regeneron-and-sanofi-provide-update-us-phase-23-adaptive). 目前还没有与IL-6水平和治疗反应相关的可用数据，目前的研究也没有将细胞因子分析作为其纳入标准的一部分。中度疾病和高IL-6水平的患者可能会从细胞因子阻断中受益最大。此外，在接受地塞米松治疗的患者中观察到的IL-6降低可能是该治疗有效性的机制25还需要评估抗肿瘤坏死因子-α治疗在新冠肺炎中的作用。由于IL-6和TNF-α似乎是独立变量，因此联合方案阻断这两种细胞因子的研究对于提高临床疗效至关重要。

早期细胞因子测量是预后的可靠预测因素，因此，提高了使用血清细胞因子水平进行治疗决策的重要性。这些细胞因子的预测值可能有助于为治疗干预提供信息，以确定哪些人可能发生呼吸衰竭、终末器官损伤和死亡，并选择最佳试验设计来破坏潜在的炎症环境。建立在疾病早期细胞因子水平上的预测模型可能有助于为高危人群的医疗分配和优先级排序提供信息。

虽然在我们的验证队列中得到了证实，但IL-6和TNF-α的预测值也应以前瞻性的方式进行评估，以便对数据收集进行更多的控制。虽然本研究的重点仅针对四种已知炎症或致病性的细胞因子，但额外的可溶性分析物可能有助于完善生存预测模型。我们目前的努力是建立这样一个预测模型，该模型将利用前瞻性收集的队列，我们将利用高维分析，如Olink邻近延伸分析和SomaLogic适配体平台26它可以从血清或血浆中测量数百到数千种可溶性分析物。除IL-6和TNF-α外，这些分析中信息最丰富的维度可以被带回到快速4–8复合ELLA细胞因子检测系统中，用于临床决策。我们认为，在预测和监测新冠肺炎患者时，这些做法将使细胞因子测量达到护理标准。

方法

ELLA细胞因子试验。

ELLA平台是一种快速细胞因子检测系统，基于四个平行的单复式微流体ELISA分析，按照制造商的说明在药筒内进行三次ELISA分析。我们首先在西奈山人类免疫监测中心用接受免疫治疗（如CAR T细胞和双特异性抗体）的多个骨髓瘤患者的血浆验证了ELLA对IL-6、IL-8和TNF-α的检测，已知这些患者会引发细胞因子释放风暴。分析验证(扩展数据图1a–c（c）)使用参考细胞因子对照和生物复制品在不同批次的卡式瓶中进行。重复性大于95%，高检测范围（>250pg ml）内分析物的组内CV为0.8%，组间CV为0.4-0.8%−1)最低检测范围（5–50pg ml）的分析物的CV为2.6–4.2%−1). 血清和血浆似乎相当于检测这些细胞因子。2020年3月，随着纽约市新冠肺炎病例数量的增加，我们将ELLA方法转移到西奈山医院临床实验室中心，该中心允许将ELLA细胞因子测试编码到我们的电子健康记录订购系统中，作为新冠肺炎诊断面板的一部分。

患者信息和数据源。

这项研究由西奈山伊坎医学院（ISMMS）的人类研究保护计划（Human research Protection Program）审查和批准。人体保护计划是ISMMS确保人体保护工作的关键组成部分。它支持我们的研究人员确保研究的道德行为和遵守联邦、州和机构法规，并提供专业的办公室工作人员协助调查人员、参与者和五个IRB。查询患者电子健康记录时，获得了知情同意豁免。RT-PCR SARS-CoV-2实验室检测的样本通过鼻咽或口咽拭子采集于西奈山53个不同地点之一，代表门诊、急诊、急诊和住院设施。在西奈山卫生系统内通过静脉穿刺采集ELLA血样。收集所有标本和影像作为护理标准的一部分。

在2020年3月21日至4月28日期间，1484名疑似新冠肺炎住院患者通过PCR和ELLA细胞因子小组检测SARS-CoV-2病毒感染状态，并获得常规实验室测量和血液计数，作为标准医疗的一部分。为了验证目的，我们还从一个独立队列中获得了数据，该队列中的临床注释SARS-CoV-2 PCR阳性的西奈山住院患者在2020年4月22日至6月16日期间进行了细胞因子测试(n个=231；中位随访时间11.6天，最长53天）。患者通过查询病理科电子数据库中的SARS-CoV-2 PCR-based检测和ELLA细胞因子小组的个人来确定。细胞因子数据来自病理科电子数据库，临床和人口统计数据由西奈山数据仓库的信息补充。

向Mount Sinai Data Warehouse提供了病理科电子数据库中同时具有SARS-CoV-2 PCR结果和ELLA细胞因子小组结果的患者的病历编号列表。随后，通过连接Oracle（18c Enterprise Edition Release 18.0.0.0.0），使用Epic Hyperspace（2019年8月）、Epic Clarity（2020年2月）和Epic Caboodle（2020年二月）数据库，从Epic电子健康记录中提取已确定患者的人口统计学和临床数据和SQL server（Microsoft SQL server 2016（SP2-CU11）（KB4527378）-13.0.5598.27（X64））数据库。其他数据元素包括实验室结果、生命体征、O2治疗、胸部影像放射学报告、诊断结果和药物。使用R版本3.6.1合并来自不同数据源的数据。大表是使用R包tidyverse（v.1.3.0）、restorhe2（v.1.4.4）和readxl（v.1.3.1）读入和写入的

针对主要队列收集了截至2020年5月7日的临床随访数据，针对验证队列收集了截止2020年6月23日的临床跟踪数据。两名研究人员（D.M.D.V.和S.G.）独立汇编了这些不同来源的所有临床和实验室信息，并将其与几乎完全匹配的数据进行了比较。根据个人病历回顾判断差异，并通过数据仓库中缺失或更新的信息进行解释。

变量。

我们的数据集包括三大类变量：1）人口统计学变量（年龄、性别、种族、民族和吸烟状况）；2） 每天在医院就诊的临床变量（BMI、心率、体温、呼吸频率、O2饱和度、收缩压、舒张压、入院状态、出院状态和死亡人数；和3）合并疾病（CKD、哮喘、COPD、高血压、肥胖、糖尿病、HIV、睡眠呼吸暂停和癌症）。所有三类都是从患者的电子病历中获得的，共病条件定义为有效的国际疾病分类（ICD）-10代码，并记录每个患者的特定遭遇的生命体征。尽管ICD-10代码代表了一个国际分类变量系统，在从业者和医疗系统之间是一致的，但我们承认，从观察或回顾队列中获取这些数据可能不如集中于特定数据元素的前瞻性数据收集可靠。

确定新冠肺炎的严重程度。

西奈山的肺科医生根据文献设计了新冠肺炎的严重程度等级27和临床实践，其定义的类别如下：1）轻度/中度新冠肺炎，基于正常/异常（<94%）O2分别为饱和度或肺炎；2） 重度新冠肺炎，基于使用高流量鼻插管（HFNC）、非再呼吸面罩（NRB）、双水平气道正压通气（BIPAP）或机械通气且不使用血管升压药，基于CrCl大于30和丙氨酸转氨酶（ALT）小于5倍正常上限；和3）严重冠状病毒肺炎伴终末器官损害，基于使用HFNC、NRB、BIPAP或使用血管加压剂进行机械通气，或基于CrCl小于30，新的肾脏替代治疗（血液透析/持续静脉-静脉血液滤过）或ALT大于正常上限的5倍。回顾了临床笔记和影像学报告，以确定患者的新冠肺炎病情严重程度。使用纸袋法对临床笔记和图像报告进行矢量化，矢量来自胸部X射线成像报告，以反映病毒性肺炎的存在和呼吸道症状的恶化。插管状态和O2通过检查患者临床笔记获得治疗模式。使用气管插管、BIPAP、持续正压、HFNC、机械呼吸机和/或补充O2大于FiO270%与严重新冠肺炎相关。终末器官损伤定义为ALT水平大于5倍正常上限，CrCl小于30，使用血管升压药和/或新的肾脏替代治疗。

另外，由于文献中的流行情况，我们还计算了SOFA得分(https://www.mdcalc.com/sequential-organ-failure-assessment-sofa-score网站)对于每次就诊，即使它通常最适用于重症监护病房内的患者。SOFA评分与我们基于医院的严重程度评分显著相关(n个=1450双，斯皮尔曼第页=0.43,P（P）<0.0001).

统计分析。

使用标准描述性统计对患者特征进行总结：连续变量的中位数/IQR和分类变量的计数/百分比。评估细胞因子值的分布并记录2转换以呈现参数统计分析。然后将细胞因子分类为70pg ml−1，50微微克毫升−1，35微微克毫升−1，0.5微微克毫升−1，100毫克升−1，1000微克−1和1mg L−1分别检测IL-6、IL-8、TNF-α、IL-1β、CRP、铁蛋白和D-二聚体。这些细胞因子的严格限值是根据对新冠肺炎样本中各种限值的经验性测试确定的，并选择那些四舍五入到新冠肺炎分布中位数以上的限值，但TNF-α除外，因为检测范围重叠较大，我们选择了基于对照组上99个百分位值的限值，而炎症标志物升高的检测是基于正常检测上限的2-3倍。单变量分析评估了细胞因子和实验室测试与患者特征的相关性，酌情使用Mann–Whitney U检验、Kruskal–Wallis检验和Spearman秩相关检验。此外，计算了Deming回归和Spearman相关系数，以确定细胞因子与实验室测试之间的相关性。我们使用多变量线性回归模型来测试细胞因子值与患者人口统计学和合并症的相关性28进行Kaplan–Meier曲线图和log-rank检验，以评估随访时间段内每种细胞因子高水平和低水平之间的生存概率差异，这些差异是从细胞因子检测日期计算到死亡、出院或随访期结束的日期（视情况而定）29Cox比例风险模型用于估计死亡风险，并对协变量（例如，患者人口统计学、合并症和实验室测试结果）进行调整，协变量由后向消除法确定30,31。我们评估了生存模型，对活着出院和住院的患者进行了审查。竞争风险模型中，死亡是相关事件，活出院是竞争事件，住院患者被审查32,33，也被用作敏感性分析。提供了点估计值（HR）以及相应的95%置信区间、预测生存概率和累积发病率曲线。使用双面测试和GraphPad Prism 8.4.2.、SAS 9.4和R 3.6.3程序进行分析。

验证方法。

我们使用两种方法进行内部验证：1）十倍CV和2）引导验证（10000个重采样）。使用Harrell的一致性指数评估了Cox比例风险回归模型的辨别能力，表明与随机选择的生存时间较短的患者相比，随机选择的存活时间较长的患者预测的生存概率较高。目标是测试模型预测新数据的能力，标记过拟合和选择偏差等问题，并深入了解模型将如何推广到独立的外部数据集。

此外，我们使用了一个独立的验证队列(n个=231），并应用主要模型（使用人口统计学+共病数据作为混杂因素）和次要模型（使用人口学+共病+实验室数据作为混杂因子）的参数估计值计算预后指数（PI），该模型得出的线性预测值适合衍生队列。该外部验证模型的性能通过模型的识别和校准能力获得34.通过AUC测量随访时间内的辨别力，并通过统计数据进行估计c（c）（哈雷尔一致性指数）。计算95%CI和综合AUC的点估计值。使用验证队列中的实际生存概率绘制Kaplan–Meier曲线，并将其与相应的预测生存概率进行比较，以此评估校准。这两条曲线的接近度是良好校准的标志。原始队列和验证队列中的PI分布以直方图形式呈现，并总结为扩展数据图4这些分布的相似分布为验证队列的适当性提供了证据。

报告摘要。

有关研究设计的更多信息，请参阅本文链接的《自然研究报告摘要》。

扩展数据

扩展数据图1|

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ELLA平台和细胞因子水平的敏感性、特异性和再现性测试以及在新冠肺炎标本中观察到的相关性。

一Olink（n=18）和LabCorp（n=142）两个其他可溶性分析物检测平台使用CAR-T CRS或COVID-19的血浆或血清样本检测IL-6之间的Spearman r相关性。b条在使用第一组对照物进行的IL-6和TNF-α的每次分析中，在高或低浓度下使用两个重组对照物的重复物的批间和批内变异系数（CV），以及在本研究中使用的ELLA小组在28个测试日期内使用三种稀释水平的Randox重组抗原。c（c）重复性测试从CAR-T样本中复制相同的生物样本，Spearman r表示40个IL-6配对样本和8个TNF-α配对样本。d日，各细胞因子在所有测试的新冠肺炎样本中的分布如所示图1.e（电子），免疫治疗相关CRS期间新冠肺炎血浆标本（n=1949）和大肠杆菌多发性骨髓瘤标本中IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-β水平的相关矩阵（n=121）。刻度表示Spearman r相关性的值。与CAR-T CRS相比，新冠肺炎中的细胞因子水平协调性较差。

扩展数据图2|

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确定严重性的流程图。

HFNC：高流量鼻插管；NRB：非呼吸面罩；BiPAP：双水平气道正压；CPAP：持续气道正压；SpO2：血氧饱和度；CrCl：肌酐清除率。ALT：丙氨酸转氨酶；ULN：正常上限；HD/CVH：血液透析/连续静脉-静脉血液滤过；EOD：末端器官损伤。

扩展数据图3|

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个体患者临床和实验室测量结果的相关性。

一，对1069名患者的实验室测量结果进行无监督聚类，并提供足够的可用信息。y轴上是z评分后的生命体征和实验室值，x轴上是个体患者，使用与第一次ELLA细胞因子测试相对应的时间点测量的指标。图侧的灰色条表示患者或分析物的集群，其中细胞因子与已知的严重程度指标共同集群，如LDH、CRP、铁蛋白、D-二聚体，但也包括高中性粒细胞、血小板和白细胞计数。注释显示死亡的患者为橙色，最大严重程度评分为灰色。b条，基于分析和测量的患者相似性矩阵，显示了两个主要簇，在左上角死亡且患有更严重新型冠状病毒肺炎的患者中富集。c（c）细胞因子、实验室测量和生命体征的相似矩阵，显示IL-6、IL-8和IL-1β与已知炎症标记物（如LDH、CRP、铁蛋白和D-二聚体）共同聚集，而TNF-α与器官损伤标记物共同聚集。

扩展数据图4|

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在独立队列中验证模型。

模型的性能，包括人口统计学和共病(a-c公司)或另外包括实验室指标(d-f型)在231名患者的验证队列中。一和d日计算曲线下的逐点时间依赖面积（AUC）以及95%置信区间，以评估从细胞因子试验到最后随访期间模型的区分，其值远高于0.5。b条和e（电子）使用验证队列中的实际生存概率绘制Kaplan-Meier曲线，并将其与相应的预测生存概率进行比较，以此评估校准。这两条曲线的接近是良好校准的标志。c（c）和如果，以直方图显示的原始队列（红色）和验证队列（绿色）中的预后指数分布显示出类似的扩散，为验证队列的适当性提供了证据。无实验室的主要模型的中位数（IQR）：原始队列：0.2401（−0.3874，0.8168），验证队列：0.0697（−0.4785，0.7722）。模型（包括实验室）的中位数（IQR）：原始队列：-0.3671（-1.3246，0.5021），验证队列：-0.6642（-1.5348，0.3444）。

补充材料

补充表格

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致谢

作者感谢N.Fernandez对集群编程工具的帮助，感谢人类免疫监测中心的成员对样本处理的帮助。作者希望感谢Bio-Techne的R.Pande和M.Putnam在健康危机期间以最及时的方式帮助在临床实验室改进修正案环境中提供用于ELLA检测的仪器和检测试剂盒；以及来自吉列的R.Hyland，因为他允许使用雷德西韦相关数据。S.G.、D.M.D.V.、S.K.-S.、Ma.M.、H.-H.H.、P.K.、A.R.和Mi.M得到了国家癌症研究所U24拨款CA224319的支持。S.G.还获得了U01 DK124165和P01 CA190174赠款的支持。T.H.S.得到了国立卫生研究院K08AI120806的支持。A.R.由U19 AI118610和U24 AI1186441支持。Mi.M.得到了Fast Grant基金的支持。人类免疫监测中心和卫生保健交付科学研究所获得了癌症中心P30拨款CA196521的支持。S.P.获得拨款R01 CA244899的支持。

竞争性利益

S.G.报告了默克公司、Neon Therapeutics公司和OncoMed公司的咨询和/或顾问角色，以及布里斯托尔-迈尔斯施贵宝公司、基因泰克公司、免疫设计公司、阿根纳斯公司、杨森研发公司、辉瑞公司、武田公司和Regeneron公司的研究资金。S.P.报告了基金会医学的咨询费和Celgene和Karyopharm的研究经费。D.M.报告来自Janssen、Celgene、Bristol-Myers Squibb、Takeda、Legend、GlaxoSmithKline、Kinevant和Foundation Medicine的咨询和/或顾问角色。B.W.在赛诺菲Genzyme担任顾问。J.A.A.报告Gilead的拨款和个人费用、Merck的拨款和私人费用、Janssen的拨款和人员费用、Theratech的个人费用、Medicure的个人费用，Regeneron的拨款以及ViiV的拨款和人身费用，所有这些都不在提交的工作范围内，塞尔金、布里斯托尔·迈尔斯施贵宝、武田、联想和葛兰素史克。

脚注

在线内容

任何方法、附加参考、Nature Research报告摘要、源数据、扩展数据、补充信息、确认、同行评审信息；作者贡献和竞争利益的详细信息；有关数据和代码可用性的声明，请访问https://doi.org/10.1038/s41591-020-1051-9.

数据可用性

支持本出版物的数据已在ImmPort上提供(https://www.immport.org)研究中加入1662新加坡元数据集已根据《健康保险便携性和责任法案》进行了识别。ImmPort是由国家过敏和传染病研究所和过敏、免疫和移植司资助的免疫学研究社区的数据共享和数据分析门户。有关更多详细信息，请参阅ImmPort用户协议(https://www.immport.org/协议).

代码可用性

用于查询Clarity和Caboodle数据库以及统计分析的脚本已上传到GitHub存储库：https://github.com/delvad03/COVID19ELLA网站.

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补充信息这篇论文可在https://doi.org/10.1038/s41591-020-1051-9.

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