LncRNA APCDD1L-AS1通过miR-1322/miR-1972/miR-324-3p-SIRT5轴抑制EGFR自噬降解诱导肺腺癌对icotinib的耐药性 , # 1, 2 , # 三， 4, 5 , 1 , 三， 4, 5 , 三， 4, 5 , 三， 4, 5 , 三， 4, 5 , 三， 4, 5 , 1 , 6 , 三， 4, 5 , 三， 4, 5 , 三， 4, 5 和 1 吴杰 1 中国辽宁省沈阳市和平区南京北街155号中国医科大学第一医院老年呼吸与传染病科
2 中国辽宁省锦州市锦州医科大学第一附属医院肿瘤科，121000
郑春雷 三 中国辽宁省沈阳市和平区南京北街155号中国医科大学第一医院肿瘤内科，邮编：110001
4 辽宁省抗癌药物与生物治疗重点实验室，中国医科大学第一医院，沈阳，110001
5 辽宁省肿瘤临床研究中心，中国辽宁省沈阳市，110001
王一哲 1 中国辽宁省沈阳市和平区南京北街155号中国医科大学第一医院老年呼吸与传染病科，邮编110001
杨子昌 三 中国辽宁省沈阳市和平区南京北街155号中国医科大学第一医院肿瘤内科，邮编：110001
4 辽宁省抗癌药物与生物治疗重点实验室，中国医科大学第一医院，沈阳，110001
5 辽宁省肿瘤临床研究中心，中国辽宁省沈阳市，110001
策丽 三 中国辽宁省沈阳市和平区南京北街155号中国医科大学第一医院肿瘤内科，邮编：110001
4 辽宁省抗癌药物与生物治疗重点实验室，中国医科大学第一医院，沈阳，110001
5 辽宁省肿瘤临床研究中心，中国辽宁省沈阳市，110001
万霞坊 三 中国辽宁省沈阳市和平区南京北街155号中国医科大学第一医院肿瘤内科，邮编：110001
4 辽宁省抗癌药物与生物治疗重点实验室，中国医科大学第一医院，沈阳，110001
5 辽宁省肿瘤临床研究中心，中国辽宁省沈阳市，110001
岳进 三 中国辽宁省沈阳市和平区南京北街155号中国医科大学第一医院肿瘤内科，邮编：110001
4 辽宁省抗癌药物与生物治疗重点实验室，中国医科大学第一医院，沈阳，110001
5 辽宁省肿瘤临床研究中心，中国辽宁省沈阳市，110001
侯可佐 三 中国辽宁省沈阳市和平区南京北街155号中国医科大学第一医院肿瘤内科110001
4 辽宁省抗癌药物与生物治疗重点实验室，中国医科大学第一医院，沈阳，110001
5 辽宁省肿瘤临床研究中心，中国辽宁省沈阳市，110001
杨成 1 中国辽宁省沈阳市和平区南京北街155号中国医科大学第一医院老年呼吸与传染病科，邮编110001
齐剑飞 6 美国马里兰州大学巴尔的摩分校Marlene和Stewart Greenebaum综合癌症中心
曲秀娟 三 中国辽宁省沈阳市和平区南京北街155号中国医科大学第一医院肿瘤内科，邮编：110001
4 辽宁省抗癌药物与生物治疗重点实验室，中国医科大学第一医院，沈阳，110001
5 辽宁省肿瘤临床研究中心，中国辽宁省沈阳市，110001
刘云鹏 三 中国辽宁省沈阳市和平区南京北街155号中国医科大学第一医院肿瘤内科，邮编：110001
4 辽宁省抗癌药物与生物治疗重点实验室，中国医科大学第一医院，沈阳，110001
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小方车 三 中国辽宁省沈阳市和平区南京北街155号中国医科大学第一医院肿瘤内科110001
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胡学军 1 中国辽宁省沈阳市和平区南京北街155号中国医科大学第一医院老年呼吸与传染病科
1 中国辽宁省沈阳市和平区南京北街155号中国医科大学第一医院老年呼吸与传染病科
2 中国辽宁省锦州市锦州医科大学第一附属医院肿瘤科，121000
三 中国辽宁省沈阳市和平区南京北街155号中国医科大学第一医院肿瘤内科，邮编：110001
4 辽宁省抗癌药物与生物治疗重点实验室，中国医科大学第一医院，沈阳，110001
5 辽宁省肿瘤临床研究中心，中国辽宁省沈阳市，110001
6 美国马里兰州大学巴尔的摩分校Marlene和Stewart Greenebaum综合癌症中心
通讯作者。 # 贡献均等。
2020年12月17日收到； 2021年1月18日接受。
版权所有 ©The Author（s）2021，修订版2021年4月
补充资料 附加文件1：图S1 APCDD1L-AS1上调衣霉素耐药LUAD细胞中EGFR的表达并抑制其凋亡。 图S2 miR-1322/miR-1972/miR-324-3p敲低和过表达的效率。 图S3 APCDD1L-AS1与miR-1322、miR-1972和miR-324-3p海绵相互抑制。 图S4 通过miR1322/miR1972/miR324-3p逆转LUAD细胞中的依替尼耐药性。 图S5 miR-1322/miR-1972/miR-324-3p对SIRT5的负调控。 图S6 在伊可替尼抗性LUAD细胞中SIRT5敲低后EGFR下调。 图S7 SIRT5击倒加速EGFR降解。 图S8 在SIRT5敲除期间，EGFR与自噬囊泡标记物LC3B共定位。 图S9 APCDD1L-AS1对SIRT5的负调控。 表S1。 qRT-PCR引物、siRNA和shRNA序列的信息。
GUID:2D6308A8-C01B-427D-82BE-59BE5620EC06
数据可用性声明 将共享数据和材料。
摘要 背景 表皮生长因子受体酪氨酸酶激酶抑制剂（EGFR-TKI）耐药是治疗EGFR-敏感突变肺腺癌（LUAD）患者的主要障碍。 然而，与EGFR-TKIs耐药性相关的长非编码RNA（lncRNAs）及其功能机制尚不清楚。 本研究旨在探讨lncRNA APCDD1L-AS1在肺癌耐烟碱中的作用及其调控机制。
方法 分子方法包括qRT-PCR、MTT分析、集落形成、RNA干扰和细胞转染、RNA免疫沉淀（RIP）、双荧光素酶报告基因分析、RNA荧光原位杂交、TUNEL分析、流式细胞术、免疫印迹， 利用异种移植模型和转录组测序研究APCDD1L-AS1在烟碱类抗生素耐药中的作用机制。
结果 通过转录组测序和差异lncRNA表达分析，发现一种新的lncRNA，APCDD1L-AS1是耐烟碱LUAD细胞中最显著上调的lncRNA。 我们发现APCDD1L-AS1不仅促进了对烟碱的抗性，而且上调了EGFR的蛋白表达水平。 从机制上讲，APCDD1L-AS1通过用miR-1322/miR-1972/miR-324-3p海绵清除SIRT5的转录抑制，促进了对icotinib的抗性和EGFR的上调。 此外，SIRT5通过抑制EGFR的自噬降解提高了EGFR的表达和激活，最终促进了对烟碱的抵抗。 自噬起始剂雷帕霉素可以降低EGFR水平，并提高耐烟碱LUAD细胞对烟碱的敏感性。
结论 APCDD1L-AS1可以通过miR-1322/miR-1972/miR-324-3p-SIRT5轴抑制EGFR的自噬降解，从而提高对icotinib的耐药性。 自噬起始剂和EGFR-TKIs的结合可能成为克服LUAD患者EGFR-TKIs耐药性的潜在新策略。
补充信息 在线版本包含补充材料，请访问10.1186/s40364-021-00262-3。
关键词： LncRNA APCDD1L-AS1，肺腺癌，依科替尼耐药，自噬，SIRT5
背景 肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，也是癌症相关死亡的主要原因[ 1 , 2 ]. 在过去十年中，靶向治疗的发展极大地提高了肺癌患者的生存率，尤其是肺腺癌患者。 亚洲约40%的LUAD患者携带表皮生长因子受体的敏感突变( 表皮生长因子受体 ) [ 三 ]. EGFR-TKIs，如吉非替尼、埃洛替尼和依托替尼，已被世界各地推荐为标准一线方案。 然而，由于大多数患者在10至16个月内对EGFR-TKIs产生初步反应后产生耐药性[ 4 ]EGFR-TKIs耐药已成为LUAD治疗的主要障碍。 众所周知，EGFR（T790M）突变和MET基因扩增是EGFR-TKIs耐药的主要分子机制，而第三代EGFR-TKIs（Osimertinib）或MET抑制剂组合（crizotinib）被广泛用于这些患者的治疗[ 5 ]. 我们和其他人已经报道，PI3K-AKT-mTOR或STAT3信号通路也有助于EGFR-TKIs抵抗，而mTOR和STAT3抑制可以部分逆转这一现象[ 6 —— 9 ]. 此外，我们最近报道，Grb2在耐烟碱的LUAD细胞中高表达，而与Grb2抑制剂lymecycline联合使用可以提高对烟碱的敏感性[ 6 ]. 然而，大量患者仍然没有有效的策略来克服EGFR-TKI耐药性[ 10 ]. 因此，迫切需要进一步探讨EGFR-TKIs耐药的机制，并制定更有效的治疗策略来治疗LUAD。
随着下一代测序技术的发展，众所周知，只有<2%的人类转录产物编码蛋白质，而剩下的98%是缺乏蛋白质编码潜力的非编码RNA（ncRNAs）[ 11 ]. 长非编码RNA（lncRNA）是一类长度超过200个核苷酸的新型非编码RNA[ 12 —— 14 ]. 已知LncRNAs参与多种细胞过程，如细胞分化、自噬和凋亡[ 15 ]. 迄今为止，许多lncRNA被认为是恶性肿瘤诊断和治疗中的新生物标记物和治疗靶点。 此外，越来越多的研究表明，lncRNAs在赋予抗癌药物耐药性方面发挥着关键作用[ 16 , 17 ]. LncRNA GSTM3TV2可通过在胰腺癌中吸收let-7并同时上调LAT2和OLR1来促进吉西他滨耐药性[ 18 ]; LncRNAH19诱导自噬，这可能通过H19/SAHH/DNMT3B轴促进乳腺癌对三苯氧胺的耐药性[ 19 ]; MALAT1通过海绵miR-200a和增强ZEB1表达促进吉非替尼耐药[ 20 ]. 然而，关于EGFR-TKI耐药相关lncRNAs的研究仍然有限，其功能机制尚不清楚。
在目前的研究中，我们鉴定了一种新的与烟碱抵抗相关的lncRNA，APCDD1L-AS1，并发现APCDD1L-AS1可以通过与miR-1322/miR-1972/miR-324-3pin LUAD细胞海绵结合来上调SIRT5的表达。 SIRT5抑制EGFR的自噬降解，诱导对烟碱的耐药性。 自噬起始剂可以完全逆转LUAD细胞对烟碱酯酶的耐药性。 因此，本研究揭示了一种新的lncRNA介导的icotinib耐药机制，并为克服LUAD患者的icotinob耐药提供了一种潜在的策略。
方法 耐烟碱细胞的建立及细胞培养 人肺腺癌细胞系（PC9，HCC827）购自美国型培养物收集中心（弗吉尼亚州马纳萨斯，美国）。 以梯度浓度（0.01–20 μM）作用6个月以上。 所有细胞均保存在RPMI-1640培养基中（Gibco，Waltham，MA，USA），补充10%胎牛血清（HyClone，GE Healthcare LifeSciences，Logan，UT，USA 2 自噬抑制剂氯喹（CQ）和3-甲基腺嘌呤（3-MA）分别购自美国密苏里州圣路易斯的Sigma-Aldrich和美国德克萨斯州休斯顿的Selleck Chemicals。 自噬引发剂雷帕霉素购自美国Sigma-Aldrich。蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺（CHX）和蛋白酶体抑制剂MG-132购自美国Sigma-Albrich。
RNA提取和qRT-PCR 使用Trizol试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）纯化总RNA。 根据制造商的说明，使用PARIS™试剂盒（Invitrogen，AM1921）分离细胞核和细胞质RNA。 根据协议，通过PrimeScript™RT试剂盒（日本东京Takara）和One Step PrimeScripts®miRNAcDNA合成试剂盒（东京Takara）将RNA反向转录到cDNA。 使用SYBR Premix ExTaq II试剂盒（日本TaKaRa）和Applied Biosystems 7500荧光定量PCR系统（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德Applied BiosystemsLife Technologies）进行实时定量PCR。 第2个 -ΔΔCt 方法计算相对mRNA表达的倍数变化。 U6或18S用作正常化的内部控制。 补充材料（附加文件）中提供了引物序列 1 ：表S1）。
RNA干扰与细胞转染 Ribobio（中国广州）合成了针对APCDD1L-AS1、SIRT5和阴性对照的特异性小干扰RNA，miR-1322、miR-1972和miR-324-3p的模拟物和抑制剂。 OBiotech（中国上海）构建了APCDD1L-AS1过表达质粒（pcDNA3.1-APCDD1L-AS1）和含有APCDD1L-AS1 shRNA的慢病毒载体（Lv-shRNA-APCDD1L-AS1）。 通过嘌呤霉素（4μg/ml，Sigma-Aldrich，USA）筛选Lv-shRNA-APCDD1L-AS1稳定转染细胞。 此外，根据制造商的说明，使用Jet PRIME（Polyplus转染，法国斯特拉斯堡）转染siRNA、miRNA模拟物和抑制剂、载体或阴性对照。 RNA干扰序列列于补充材料（附加文件 1 ：表S1）。
MTT法检测伊可替尼敏感性和细胞活力 将耐烟碱LUAD细胞或其亲本细胞（有或无转染）接种到96个培养板（2–3×10 三 然后使用3-（4,5-二甲基-2-噻唑基）-2,5-二苯基-2-h-四唑溴化铵（MTT，Sigma-Aldrich，USA）评估吸光度（570 nm）。 然后，如前所述，在每个细胞系中计算icotinb的50%生长抑制（IC50）值[ 21 ]. 为了进行细胞活力测定，用10μM的烟碱处理耐烟碱肺腺癌细胞24小时、48小时、72小时和96小时。还使用MTT法测定细胞活力。 所有实验均一式三份。
菌落形成 将细胞接种到标准培养基中的12孔板（600个细胞/孔）中。 第二天，将不同浓度的icotinib加入培养基中。 两周后，使用结晶紫（美国Sigma-Aldrich）对活细胞进行染色，并计算每个孔中的菌落数。
异种移植研究 耐烟酸或亲代肺腺癌细胞（150μl，约1.0×10 7 细胞）皮下注射到雌性裸鼠（4周龄，北京维他河实验动物技术有限公司）。 两周后，荷瘤小鼠每三天口服一次1%吐温-80盐水溶液中的依替尼（50 mg/kg），并评估肿瘤体积（0.5×长×宽） 2 )每周连续3周。 在所有小鼠被安乐死后，手术切除肿瘤并拍照。
为了探讨APCDD1L-AS1在体内的功能，对耐烟碱肺腺癌细胞（150μl，约1.0×10 7 将含有稳定Lv-sh RNA-APCDD1L-AS1或Lv-NC的细胞注射到小鼠皮下。 依托替尼的剂量、治疗方法和持续时间同上。 将部分肿瘤组织立即冷冻在液氮中进行RNA提取，将其他组织固定在10%缓冲福尔马林中进行免疫组织化学、免疫荧光和Tunel测定。 免疫组织化学染色的抗体为EGFR（1:100，Santa，Clara，CA，USA）、SIRT5（1:100Sigma-Aldrich，USA。 免疫荧光染色抗体为LC3B（1:200，Cell Signaling Technology，Danvers，MA，USA）。 使用图像分析仪中的默认“分析粒子”插件（image Pro Plus 6.0，Media Control）对图像进行量化，并根据自噬指南，以每个细胞的平均LC3B穿孔数表示结果[ 22 ]. 根据制造商的说明，使用一步法隧道式细胞凋亡检测试剂盒（中国江苏省Byotime）对石蜡切片进行隧道染色。 使用图像分析仪（image Pro Plus 6.0，Media Control）对Tunel的所有染色切片进行评分，结果以平均灰度值表示[ 23 ]. 本研究在中国医科大学动物实验中心进行，并获得了中国医科大机构审查委员会的批准（IACUC编号：2019067）。
RNA免疫沉淀（RIP） 根据制造商的协议，使用Magna RNA结合蛋白免疫沉淀试剂盒（Millipore，Billerica，MA，USA）执行该程序。 RIP使用人类抗AGO2抗体（美国剑桥Abcam）和抗兔IgG（美国密理博）。 分离免疫沉淀RNA并用qRT-PCR检测。 用于RIP分析的qRT-PCR的基因特异性引物序列列于补充材料（附加文件 1 ：表S1）。
双荧光素酶报告分析 OBiotech（中国上海）分别构建了野生型和突变型荧光素酶报告质粒APCDD1L-AS1（Luc-APCDD1L-AS1-wt和Luc-APDD1L-AS1-mut）和SIRT5（Luc-SIRT5-wt和Luc-SIRT5-mut）。 将96周平板中的HEK-293细胞（每孔4000个细胞）与合成的双荧光素酶报告物和miRNA模拟物质粒共转染48小时，并根据制造商的说明使用双荧光素酶报告物检测系统试剂盒（美国威斯康星州麦迪逊市普罗米加）检测双荧光酶活性。 萤火虫荧光素酶活性归一化为肾小球荧光素酶活性。
RNA荧光原位杂交 Cy3-标记的APCDD1L-AS1购自ServiceBio（中国武汉）。 按照制造商的说明，使用荧光原位杂交试剂盒（ServiceBio，中国），按照前面所述进行RNA FISH。 用荧光显微镜（Eclipse Ti-SR，Nikon）观察载玻片的免疫荧光。 U6和18S探针（ServiceBio，中国）被用作核和细胞质RNA的内部参考。
流式细胞术检测细胞凋亡 用伊可替尼（5μM或10μM）处理耐伊可替尼的LUAD细胞72 h，然后收集漂浮细胞和附着细胞，并用Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒进行染色。 通过FACS细胞术（BD Biosciences Inc.，Franklin，NJ，USA）分析细胞凋亡。
蛋白质印迹 如前所述进行蛋白质印迹[ 24 ]. 使用了以下主要抗体：EGFR、PARP、LC3B和p62（1:1000，美国细胞信号技术）、p-EGFR（1:250，美国细胞信令技术）、SIRT5（1:1000、美国Sigma-Aldrich）和GAPDH（1:5000，美国细胞信令技术）。
统计分析 数据显示为平均值±标准偏差（SD）。 使用配对学生t检验或单向方差分析来比较两组或多组之间的差异。 一条双尾蛇 P（P） <0.05被认为具有统计学意义，而 P（P） <0.01非常显著。 所有数据分析均使用GraphPad Prism软件5.0（GraphPad-software，Inc.，加州圣地亚哥，美国）和SPSS 16.0（IBM，SPSS，芝加哥，伊利诺伊州，美国）进行。
结果 APCDD1L-AS1在耐烟碱LUAD细胞中显著上调 首先，比较了亲代（PC9和HCC827）和耐烟酸细胞系（PC9/IcoRL、PC9/Ico RH、HCC827/Ico RL和HCC82 7/Ico RH）对烟酸的敏感性。 MTT分析显示，与亲代细胞相比，依可替尼耐药细胞对伊可替尼的敏感性低得多，且呈剂量和时间依赖性（图 a-b）。 菌落形成试验还表明，经烟酸处理后，亲代细胞的菌落明显小于耐烟酸细胞的菌群（图 c） ●●●●。 类似地，经依替尼治疗后，PC9细胞组皮下异种移植瘤的大小小于PC9/IcoRL细胞组（图 d） ●●●●。 此外，与亲代细胞相比，耐烟碱细胞中EGFR的蛋白质和磷酸化水平显著升高（图 e） ●●●●。 所有这些结果都证实了我们研究中使用的LUAD细胞中的耐烟碱表型。
在耐烟碱LUAD细胞中APCDD1L-AS1显著上调。 一 采用MTT法测定了耐烟碱LUAD细胞及其亲代细胞经不同浓度烟碱处理96 h后对烟碱的敏感性。 PC9/IcoRL:PC9低剂量抗烟碱细胞； PC9/IcoRH:PC9高剂量抗烟碱细胞； HCC827/IcoRL:HCC827低剂量抗烟酸细胞； HCC827/IcoRH:HCC827高剂量抗烟碱细胞。 b条 用MTT法检测亲代细胞及其耐伊替尼细胞经伊替尼（10μM）处理24、48、72和96 h后的细胞活力。 c（c） 采用集落形成实验分析了不同浓度的烟酸对亲代细胞及其耐烟酸细胞的集落形成能力的影响。 d日 用或不用烟酸处理耐烟酸细胞及其亲代细胞的皮下肿瘤小鼠模型。 测量各组的平均肿瘤体积( n个 = 3） 。 e（电子） western blot检测亲代细胞及其抗烟碱细胞中EGFR的表达和磷酸化水平。 （f） 与PC9细胞相比，PC9/IcoRL细胞和PC9/Ico RH细胞中的火山图鉴定出四种上调的lncRNA。 克 通过转录组测序，与PC9细胞相比，PC9/IcoRL细胞和PC9/Ico RH细胞中四大上调lncRNA的列表。 小时 用qRT-PCR法测定亲代细胞及其抗烟碱细胞中lncRNA、APCDD1L-AS1、PAX8-AS1、GAS5和lnc-GSDMD的表达水平。 绘制了三次试验的平均值±SD* P（P） < 0.05, ** P（P） < 0.01, *** P（P） < 0.001，无统计意义
为了筛选与icotinib耐药性相关的lncRNA，我们对PC9、PC9/IcoRL和PC9/Ico RH细胞中lncRNA的全局表达谱进行了分析。 在差异表达的lncRNA中，与PC9细胞相比，APCDD1L-AS1是PC9/IcoRL和PC9/Ico RH细胞中上调最多的lncRNAs（图 f-g）。 qRT-PCR也验证了类似结果（图 h） ●●●●。 由于APCDD1L-AS1的显著上调，我们决定进一步研究其在烟碱类抗生素耐药性中的潜在作用。
APCDD1L-AS1促进LUAD细胞对烟碱类药物的耐药性 APCDD1L-AS1，位于染色体20q13.32，由7个外显子组成，全长2099个核苷酸（nt）（图 a） 已在LNCippedia数据库（5.2版）中确定为lncRNA。 编码潜力评估工具的预测结果进一步证实，APCDD1L-AS1仅具有极低的编码潜力（图 b） ●●●●。 为了探索APCDD1L-AS1的亚细胞定位，我们搜索了数据库lncLocator，结果预测了APCDD1L-AS1的主要细胞质定位和次要核定位（图 c） ●●●●。 这一结果通过在伊替尼抗性LUAD细胞中使用qRT-PCR和RNA荧光原位杂交（FISH）分析的细胞核/细胞质RNA分离分析得到了进一步验证（图 d-e； 其他文件 1 ：图S1A和S1B）。
APCDD1L-AS1对LUAD细胞抗烟碱的作用。 一 在LNCipedia数据库中APCDD1L-AS1在染色体上的定位和结构。 b条 利用CPAT数据库计算lncRNA（MALAT1、TUG1、APCDD1L-AS1）和mRNA（GAPDH、ACTB、SDHA）的编码电位。 c（c） 在线软件lncLocator用于预测APCDD1L-AS1的亚细胞定位。 d日 采用qRT-PCR方法检测APCDD1L-AS1在衣原体耐药细胞（PC9/IcoRH，HCC827/IcoRH）的细胞质或细胞核中的相对表达。 e（电子） 通过RNA-FISH检测APCDD1-AS1在PC9/IcoRH细胞中的定位。 蓝色，DAPI染色的细胞核； 红色，Cy3-标记阳性杂交信号（标尺，100μm）。 U6和18S作为阳性对照。 （f） 采用MTT法评估了APCDD1L-AS1 KD对icotinib耐药细胞（PC9/IcoRH、HCC827/Ico RH）中icotinin IC50值的影响。 克 western blot检测APCDD1L-AS1-KD或-OE抗烟碱细胞（PC9/IcoRH、HCC827/IcoRH）中EGFR和p-EGFR的水平。 小时 使用Kaplan-Meier绘图仪在线数据库对672例肺腺癌患者APCDD1L-AS1表达（根据APCDD1L-AS1表达中位数分为高表达组和低表达组）与OS之间的相关性进行Kaplan-Meier分析。 使用对数秩检验计算 P（P） 值。 i-j公司 用流式细胞术分析了10μM的烟碱诱导的APCDD1L-AS1-KD烟碱耐药细胞（PC9/IcoRL，PC9/Ico RH）的凋亡( 我 )western blot检测PC9/IcoRL和PC9/Ico RH细胞凋亡相关蛋白PARP( j个 ) 。 内部控制采用GAPDH。 绘制了三次试验的平均值±SD* P（P） < 0.05, ** P（P） < 0.01, *** P（P） < 0.001
为了确定APCDD1L-AS1是否与烟碱耐药有关，我们在烟碱耐药细胞中短暂敲除或过度表达APCDD1L-AS1（附加文件 1 ：图S1C和S1D）。 结果表明，APCDD1L-AS1敲除（KD）可显著提高烟碱敏感性（图 f； 其他文件 1 ：图S1E）并降低EGFR的蛋白质和磷酸化水平（图 克； 其他文件 1 ：图S1F）。 相反，APCDD1L-AS1过表达（OE）增加了EGFR的表达和激活（图 克； 其他文件 1 ：图S1F）。 吉非替尼治疗也获得了类似的结果（附加文件 1 ：图S1G）。 672例LUAD患者的Kaplan-Meier生存分析表明，APCDD1L-AS1的高表达与较差的总体生存率（OS）显著相关（对数秩检验， 第页 = 0.0048; 图 h） ●●●●。 此外，流式细胞术和蛋白质印迹分析证实，APCDD1L-AS1KD促进了icotinib诱导的icotinib耐药细胞的凋亡（图 i-j； 其他文件 1 ：图S1H和S1I）。 总的来说，这些结果支持APCDD1L-AS1在EGFR上调和衣原体耐药性中的作用。
APCDD1L-AS1海绵miR-1322/miR-1972/miR-324-3p诱导LUAD细胞对eicotinib耐药性 定位于细胞质中的LncRNAs通常通过与miRNAs（称为竞争性内源性RNA（ceRNA））擦洗来发挥其调节功能[ 25 ]. 为了预测使用APCDD1L-AS1海绵的潜在miRNAs，我们使用LncBase V2.0[ 26 ]并鉴定出三种结合分数较高的miRNAs（miR-1972、miR-1322和miR-324-3p）（图 a-b）。 这些miRNAs的假定结合位点分别位于726到787、2062到2088、2187到2207（图 b） ●●●●。 然后，通过将野生型或突变型假定结合位点APCDD1L-AS1（Luc-APCDD1L-AS1-wt或Luc-APDD1L-AS1-mut）和miR-1972/miR-1322/miR-324-3p拟态质粒共同转染到HEK293细胞中，进行双荧光素酶报告分析。 结果表明，所有三种miRNA模拟物都可以抑制APCDD1L-AS1-wt驱动的萤光素酶活性，但不能抑制APCDD1L-AS1-mut在假定的miRNA结合位点驱动的萤光素酶活性（图 c） ●●●●。 此外，RIP分析表明，Argonaute 2（Ago2）是RNA诱导沉默复合物（RISC）的基本成分，与APCDD1L-AS1、miR-1972、miR-1322和miR-324-3p的复合物相关（图 d） ●●●●。
用APCDD1L-AS1海绵化MiR-1322/MiR-1972/MiR-324-3p，提高了LUAD细胞对伊替尼的敏感性。 一 通过LncBasedatabase和转录组测序预测了使用APCDD1L-AS1海绵的潜在miRNAs（miR-1322、miR-1972和miR-324-3p）。 b条 野生型和突变型APCDD1L-AS1与miR-1322、miR-1972和miR-324-3p潜在靶向位点的序列比对。 c（c） 使用miRNA模拟物进行荧光素酶报告分析，以验证APCDD1L-AS1与miR-1322、miR-1972或miR-324-3p之间的相互作用。 d日 用AGO2抗体进行RIP检测，用qRT-PCR检测APCDD1L-AS1和miR-1322、miR-1972或miR-324-3p的免疫沉淀。 IgG用作阴性对照。 e（电子） 用qRT-PCR法测定亲代细胞及其耐烟碱细胞（PC9、PC9/IcoRL和PC9/Ico RH）中miRNA的表达水平。 （f） 通过MTT法测定miR-1322、miR-1972或miR-324-3p模拟物对PC9/IcoRL细胞对烟碱敏感性的影响。 克 用miR-1322、miR-1972或miR-324-3p抑制剂和si-RNA APCDD1L-AS1联合转染PC9/IcoRL细胞后，用MTT法测定经依替尼处理72h后的细胞存活率。 h-i型 EGFR水平，p-EGFR( 小时 )和PARP( 我 )在转染miR-1322、miR-1972或miR-324-3p模拟物的耐伊替尼b细胞（PC9/IcoRH和HCC827/IcoRH）中，通过western blot检测miR-1972和miR-324-3p模拟体。 绘制了三次试验的平均值±SD* P（P） < 0.05, ** P（P） < 0.01, *** P（P） < 0.001，无统计意义
qRT-PCR结果表明，与亲代细胞相比，耐烟酸细胞中所有三种miRNA的水平都较低（图 e； 其他文件 1 ：图S2A）。 相反，所有这些miRNAs的水平在APCDD1L-AS1-KD细胞中显著增加，而在APCDM1L-AS1-OE细胞中降低（附加文件 1 ：图S2B和S2C； 图S3A和S3B）。 另一方面，miR-1322、miR-1972和miR-324-3p的模拟物减少，而它们的抑制剂增加了APCDD1L-AS1的水平（附加文件 1 ：图S3C）。 所有这些结果表明，APCDD1L-AS1可以与miR-1322、miR-1972和miR-324-3p相互抑制的方式海绵化。
为了研究miR-1322、miR-1972和miR-324-3p是否参与icotinib抗性，将miR-1322、miR-1972或miR-324-3p的模拟物或抑制剂分别转染到icotinib抗性LUAD细胞中。 结果表明，所有模拟物都显著增强了烟碱敏感性（图 f； 其他文件 1 ：图S4A），而三种抑制剂均部分减弱了APCDD1L-AS1-KD细胞中观察到的增强的烟碱敏感性（图 克； 其他文件 1 ：图S4B）。 此外，所有三种miRNAs的模拟物不仅减轻了EGFR的蛋白和磷酸化水平，还促进了抗烟酸细胞的凋亡（图 h-i）。 总的来说，这些数据表明APCDD1L-AS1与miR-1322/miR-1972/miR-324-3p结合，有助于EGFR上调和icotinib抵抗。
MiR-1322/MiR-1972/MiR-324-3p通过靶向其3′-UTR下调SIRT5 为了筛选miR-1322、miR-1972和miR-324-3p的常见mRNA靶标，我们对测序结果进行了Targetscan预测和差异表达基因（DEG）分析。 在11种预测性mRNA中，sirtuin 5（SIRT5）、 + -依赖性III类蛋白脱乙酰酶在GEO的吉非替尼耐药非小细胞肺癌样本中的表达显著高于敏感非小细胞癌样本： {“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE80344”，“term_id”：“80344“}} GSE80344型 数据集（图 a） ●●●●。 因此，我们选择SIRT5作为inicotinib抗性的可能靶点（图 a） ●●●●。 为了测试SIRT5是否是三种miRNA的靶点，将Luc-SIRT5 3′-UTR-wt和Luc-SIRT 5 3′-UTR-mut质粒与三种miRNAs的模拟物共转染（图 b） ●●●●。 荧光素酶分析表明，所有三种miRNAs的模拟物只能抑制Luc-SIRT5 3′-UTR-wt的荧光素素酶活性，而不能抑制Luc-SSRT5 3’-UTR-mut的荧光素酶活性（图 c） 表明这三种miRNAs都可以直接与SIRT5 3′-UTRs结合。 此外，与亲代细胞相比，耐烟碱LUAD细胞中SIRT5的mRNA和蛋白水平显著升高（图 d-e； 其他文件 1 ：图S5A和S5B）。 此外，所有三种miRNA的模拟物均下调SIRT5的水平，而这些miRNA的抑制剂上调了SIRT5水平（图 f-g； 其他文件 1 ：图S5C和S5D）。 上述数据表明，SIRT5是APCDD1L-AS1-miR-1322/miR-1972/miR-324-3p轴的下游靶点。
miR-1322/miR-1972/miR-324-3p通过靶向其3′-UTR下调SIRT5。 一 通过Targetscan和转录组测序预测miR-1322、miR-1972和miR-324-3p的可能靶基因； 来自GEO数据集的SIRT5 mRNA水平 ｛“type”：“entrez geo”，“attrs”：｛“text”：“GSE80344”，“term_id”：“80344”｝ GSE80344型 在吉非替尼b耐药细胞及其敏感细胞中显示。 b条 SIRT5 3′-UTR中miR-1322、miR-1972和miR-324-3p的潜在结合位点。 c（c） 应用使用miRNA模拟物的萤光素酶报告基因分析来验证SIRT5 3′-UTR与miR-1322、miR-1972或miR-324-3p之间的相互作用。 d-e公司 用qRT-PCR检测SIRT5在亲代细胞及其耐烟碱细胞（PC9、PC9/IcoRL和PC9/Ico RH）中的表达( d日 )和western blot( e（电子） )。 f-g（胎龄） 通过qRT-PCR检测转染miRNAs模拟物或抑制剂的PC9/IcoRL和PC9/Ico RH细胞中SIRT5的表达( （f） )和western blot( 克 ). 绘制了三次试验的平均值±SD* P（P） < 0.05, ** P（P） < 0.01, *** P（P） < 0.001
SIRT5促进LUAD细胞对烟碱类抗生素的耐药性 为了验证SIRT5在衣霉素抵抗中的作用，SIRT5被敲除于衣霉素耐药的LUAD细胞中（附加文件 1 ：图S6A）。 MTT分析表明，SIRT5-KD显著降低了抗烟碱细胞中烟碱的IC50值（图 a） ●●●●。 同时，在SIRT5-KD icotinib耐药细胞中，EGFR的蛋白和磷酸化水平均显著降低（图 b； 其他文件 1 ：图S6B）。 此外，流式细胞术和western blot分析表明，SIRT5 KD显著增加了抗烟碱细胞的凋亡（图 c-d）。 这些结果表明，SIRT5有助于EGFR在抗烟碱后上调。
SIRT5对烟碱抗性的贡献。 一 采用MTT法测定抗衣原体SIRT5 KD-icotinib细胞的IC50值。 b条 western blot检测SIRT5 KD-icotinib耐药细胞（PC9/IcoRH和HCC827/IcoRH）中EGFR和p-EGFR的水平。 c-d公司 用流式细胞术分析了经烟碱处理的SIRT5 KD-icotinib耐药细胞的凋亡情况( c（c） )western blot检测凋亡相关蛋白PARP( d日 ). 绘制了三次试验的平均值±SD* P（P） < 0.05, ** P（P） < 0.01, *** P（P） < 0.001
SIRT5通过抑制自噬降解上调EGFR 下一个问题是SIRT5如何上调EGFR表达。 在SIRT5-KD细胞中未观察到EGFR mRNA水平的变化（附加文件 1 ：图S7A）表明SIRT5可能增加EGFR蛋白合成和/或抑制EGFR降解。 然后，用蛋白质合成抑制剂环己烷（CHX）处理SIRT5-KD烟碱耐药细胞后，用western blot分析EGFR蛋白水平。 结果表明，SIRT5-KD显著缩短了EGFR的半衰期（图 a； 其他文件 1 ：图S7B），表明SIRT5可能通过抑制其降解来上调EGFR。 然而，蛋白酶体抑制剂MG-132不能提高SIRT5-KD细胞中的EGFR水平，排除蛋白酶体途径可能参与这一过程（图 b； 附加文件 1 ：图S7C）。
SIRT5抑制EGFR自噬降解。 一 用蛋白质印迹法测定CHX（20μg/ml）处理0、2、4和8h后PC9/IcoRH细胞中EGFR的蛋白水平。 b条 western blot法检测MG-132（10μM）处理12 h后SIRT5 KD-PC9/IcoRH细胞EGFR蛋白水平。 c（c） western blot检测SIRT5 KD-icotinib耐药细胞（PC9/IcoRH和HCC827/IcoRH）中LC3B和p62的水平。 d-e公司 EGFR水平，p-EGFR( d日 )和PARP( e（电子） )western blot检测经CQ或3-MA处理的SIRT5 KD-icotinib耐药LUAD细胞（PC9/IcoRH和HCC827/IcoRH。 （f） 采用MTT法测定72 h内添加或不添加雷帕霉素的耐烟碱LUAD细胞（PC9/IcoRL和PC9/Ico RH）对烟碱的敏感性。 绘制了三次试验的平均值±SD* P（P） < 0.05, ** P（P） < 0.01, *** P（P） < 0.001，无统计意义
自噬是另一种众所周知的降解受损蛋白质的途径。 因此，我们决定测试EGFR是否在SIRT5-KD细胞中经历自噬降解。 我们的结果显示SIRT5-KD细胞中p62水平降低，LC3B-II水平升高（图 c、 其他文件 1 ：图S7D），表明SIRT5 KD可以促进耐烟碱LUAD细胞的自噬通量。 此外，两种自噬抑制剂CQ和3-MA部分挽救了SIRT5-KD诱导的表型，包括EGFR下调、EGFR激活减少和PARP裂解增加（图 d-e； 其他文件 1 ：图S7E和S8A）。 相反，自噬起始剂雷帕霉素与烟碱的结合部分逆转了LUAD细胞对烟碱的耐药性（图 f） ●●●●。 更重要的是，共聚焦显微镜的图像显示，在SIRT5敲除的HCC827/IcoRH细胞中，EGFR与LC3B自噬囊泡标记物部分共定位（附加文件 1 ：图S8B）。 综上所述，这些结果表明SIRT5通过抑制EGFR自噬降解促进了对烟碱类抗生素的耐药性。
APCDD1L-AS1通过海绵miR1322/miR1972/miR324-3p上调SIRT5 为了进一步证实SIRT5抑制EGFR降解是否受APCDD1L-AS1和miR1322/miR1972/miR324-3p的ceRNA网络调控，检测了APCDD1L-AS1对SIRT5和EGFR表达的影响。 结果表明，APCD1L-AS1-KD降低了SIRT5的mRNA和蛋白水平，但APCD1L-AS1-OE增加了SIRT5mRNA和蛋白质水平（图 a-d； 其他文件 1 ：图S9A-S9D）。 此外，APCDD1L-AS1-KD还抑制EGFR的表达及其激活，并促进自噬通量，这些部分被miR-1322、miR-1972和miR-324-3p抑制剂所挽救（图 e） ●●●●。 综上所述，这些结果表明，APCDD1L-AS1-miR-1322/miR-1972/miR-324-3p-SIRT5轴通过抑制EGFR的自噬降解促进了对烟碱类抗生素的耐药性。
通过使用miR-1322/miR-1972/miR-324-3p海绵，APCDD1L-AS1上调SIRT5。 a-d公司 用APCDD1L-AS1KD检测SIRT5在PC9/IcoRL和PC9/Ico RH细胞中的RNA和蛋白表达( a-b公司 )或OE( c-d公司 )qRT-PCR和western blot检测。 e（电子） 用western blot法分别测定与miR-1322、miR-1972和miR-324-3p抑制剂共转染的APCDD1L-AS1 KD-icotinib耐药LUAD细胞中p-EGFR、EGFR、SIRT5、p62和LC3B的水平。 绘制了三次试验的平均值±SD* P（P） < 0.05, ** P（P） < 0.01, *** P（P） < 0.001
APCDD1L-AS1通过抑制异种移植物小鼠模型中EGFR的自噬降解来增强icotinib耐药性 为了进一步验证APCDD1L-AS1在体内对烟碱类药物耐药的作用和机制，我们用慢病毒载体（Lv-shRNA-APCDD1L-AS1或Lv-NC）稳定转染PC9/IcoRH细胞，用于异种移植瘤模型研究。 在依替尼治疗下，Lv-shRNA-APCDD1L-AS1组的肿瘤明显小于Lv-NC组（图 a-b）。 此外，qRT-PCR检测证实，APCDD1L-AS1和SIRT5的表达较低，而miR-1322、miR-1972和miR-324-3p在Lv-shRNA-APCDD1L-AS1肿瘤组织中的表达显著高于Lv-NC肿瘤组织（图 c-d）。 免疫组化染色显示，Lv-shRNA-APCDD1L-AS1肿瘤中SIRT5和EGFR水平显著降低（图 e） ●●●●。 同时，免疫荧光染色显示，Lv-shRNA-APCDD1L-AS1肿瘤中LC3B点状和隧道阳性染色显著增加（图 f-g）。 这些数据与我们的体外结果一致，进一步支持了我们的模型，即APCDD1L-AS1通过miR-1322/miR-1972/miR-324-3p-SIRT5轴抑制EGFR的自噬降解，从而促进了icotinib耐药性（图 )。
在异种移植小鼠模型中，通过促进EGFR的自噬降解，通过APCDD1L-AS1敲除增强烟碱敏感性。 a-b公司 从皮下注射PC9/IcoRH/Lv-sh-ACDD1L-AS1或PC9/IcoRH/Lv-NC细胞的裸鼠中分离的肿瘤显示( 一 ) ( n个 = 6). 根据每周检测到的大小绘制肿瘤生长曲线( b条 )。 c-d公司 APCDD1L-AS1、SIRT5的表达( c（c） )、miR-1322、miR-1972和miR-324-3p( d日 )通过qRT-PCR分析。 e（电子） SIRT5和EGFR的表达通过免疫组织化学染色测定（标尺，50μm）。 （f） 通过免疫荧光（标尺，100μm）观察LC3B穿刺。 用DAPI对细胞核进行可视化。 图中显示了具有代表性的图像。 克 采用TUNEL法（比例尺，100μm）检测肿瘤切片细胞凋亡。 平均灰度值代表细胞凋亡状态（Lv-NC组=4.39±0.568，Lv-shRNA组=34.39±2.273）。 绘制了三次试验的平均值±SD** P（P） < 0.01, *** P（P） < 0.001
APCDD1L-AS1促进肺腺癌细胞对烟碱耐药的示意图。 在这一进展中，上调APCDD1L-AS1作为miRNA海绵，诱骗miR-1322、miR-1972和miR-324-3p，促进SIRT5的表达，抑制EGFR的自噬降解，增加EGFR磷酸化，抑制细胞凋亡，诱导icotinib耐药
讨论 在本研究中，我们发现一种新的lncRNA APCDD1L-AS1在抗烟碱酯酶LUAD细胞中上调，并提出了一个新的工作模型，其中APCDD1L-AS1通过抑制EGFR的自噬降解诱导烟碱酯类耐药，并通过miR-1322/miR-1972/miR-324-3p-SIRT5轴促进LUAD中EGFR的激活。
许多lncRNA的异常表达已被发现存在于各种癌症中，包括肺癌。 由lncRNAs-miRNA-mRNA组成的ceRNA网络是促进癌症进展的主要机制之一。 单个lncRNA可以与单个或多个miRNA相互作用，单个miRNA也可以与单个或者多个lncRNA或mRNA相互作用。 因此，ceRNA网络非常复杂[ 27 ]. 关于非小细胞肺癌EGFR-TKI耐药性的研究报告称，上调miR-31的lncRNA LOC554202可降低非小细胞肺癌细胞对吉非替尼的敏感性[ 28 ]. lncRNA RHPN1-AS1下调通过靶向非小细胞肺癌miR-299-3p/TNFSF12通路促进吉非替尼耐药[ 29 ]. 然而，这些研究只关注单个ceRNA的相互作用。 在本研究中，基于靶miRNAs和mRNAs的预测以及荧光素酶报告试验和RIP的确认，我们发现APCDD1L-AS1可以同时与三个miRNAs（miR-1972、miR-1322和miR-324-3p）海绵结合，三个miRNA以共同基因SIRT5为靶点，建立了一个稳定而强大的ceRNA网络， APCDD1L-AS1通过这种ceRNA网络发挥了强大的耐药性促进功能。
我们发现SIRT5可以促进EGFR-TKI抗性。 SIRT5是Sirtuin家族的一员，在自噬、凋亡和耐药性中起重要作用[ 30 , 31 ]，一项基于在线分析的研究表明，SIRT5与三阴性乳腺癌新辅助化疗的完全反应呈正相关，表明SIRT5可能在耐药中起抑制作用[ 32 ]. 然而，也有报道称，带有野生型KRAS的SIRT5阳性结直肠癌细胞对化疗药物或西妥昔单抗耐药[ 33 ]; SIRT5促进卵巢癌顺铂耐药。 在这项研究中，我们发现SIRT5在耐烟碱LUAD细胞和吉非替尼耐药肿瘤中上调 {“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE80344”，“term_id”：“80344“}} GSE80344型 数据集，支持SIRT5的阻力促进作用。 此外，SIRT5-KD可以促进EGFR的自噬降解并提高烟碱敏感性，这一发现进一步证明了SIRT5通过抑制自噬发挥了抵抗因子的作用。 SIRT5已被报道以上下文依赖的方式调节自噬。 SIRT5可促进CRC自噬[ 30 ]抑制人类乳腺癌细胞的自噬[ 34 ]. 我们的结果表明，SIRT5起到了自噬抑制剂的作用，并且与之前的研究一致，该研究表明SIRT5通过减少氨的生成来抑制自噬[ 34 ]. 因此，SIRT5在EGFR-TKI耐药的背景下发挥自噬抑制剂的作用。
自噬是一个保守的分解代谢过程，导致自我消化和去除功能失调的蛋白质和细胞器[ 35 ]. 越来越多的证据支持自噬作为一把双刃剑，可以诱导细胞死亡或细胞保护，因此可能与癌细胞的耐药性有关[ 36 ]. 据报道，Rab5a或CCL2的敲低可刺激自噬，逆转胃癌顺铂耐药[ 37 ]. 我们的研究结果表明，自噬抑制剂CQ和3-MA可以挽救SIRT5-KD诱导的EGFR自噬降解，并促进烟碱抵抗，这强烈表明SIRT5对烟碱抵抗的影响是通过其自噬抑制功能介导的。 据报道，靶向WEE1激酶可通过促进胃肠道间质瘤中KIT的自噬降解来增强伊马替尼的抗肿瘤活性[ 38 ]. 在我们的研究中，我们发现SIRT5的敲低可以降低EGFR的表达，并增加EGFR与自噬小泡的共定位。 此外，SIRT5敲除促进EGFR的自噬降解，表明LncRNA-miR-1322/miR-1972/miR-324-3p-SIRT5轴抑制EGFR的自噬降解。 作为EGFR-TKI在非小细胞肺癌中的关键靶点，据报道EGFR在EGFR-TKIs耐药细胞的蛋白和磷酸化水平上调[ 39 ]，这与我们的结果类似。 因此，加速EGFR的自噬降解可能是克服LUAD中EGFR-TKI耐药性的潜在策略。 在目前的研究中，mTOR抑制剂雷帕霉素也可以通过促进自噬诱导细胞死亡[ 40 ]，实际上确实增加了耐烟酸的LUAD细胞对烟酸的敏感性。 其他mTOR抑制剂，如torin2和BIBW2992）[ 8 , 9 ]也有报道通过Akt/mTOR信号负反馈调节和诱导自噬，能够诱导EGFR-TKI耐药的NSCLC细胞凋亡和抑制细胞增殖，这表明对EGFR-TKI耐药的非小细胞肺癌有很好的治疗策略。 此外，最近的一项研究报告称，双去甲氧基姜黄素和烟碱酯酶联用可通过自噬诱导增强原代EGFR-TKI耐药NSCLC细胞对烟碱酯类药物的敏感性[ 41 ]与我们的类似。 因此，我们的研究提供了强有力的证据，表明调控自噬活性可能是提高癌症药物敏感性的有效治疗策略[ 42 , 43 ]. 当然，由于自噬的复杂性，自噬在抗生素耐药性中的作用需要进一步阐明。 此外，雷帕霉素是否可以通过调节lncRNA-miR-1322/miR-1972/miR-324-3p-SIRT5轴介导的自噬来逆转EGFR-TKI耐药性，还有待进一步研究。
结论 总之，本研究证明APCDD1L-AS1可以通过同时诱骗miR-1322、miR-1972和miR-324-3p上调LUAD中SIRT5的ceRNA网络，通过抑制EGFR的自噬降解，从而诱导icotinib耐药性。 这些发现揭示了EGFR-TKI抵抗的新机制，为克服LUAD中EGFR-TKI抵抗提供了一系列新的靶点和潜在的策略。
缩写 表皮生长因子受体 表皮生长因子受体 TKI公司 酪氨酸酶激酶抑制剂 夏威夷群岛 肺腺癌 lncRNA 长非编码RNA 撕裂 rna免疫沉淀 PI3K系列 磷酸肌醇3激酶 mTOR公司 雷帕霉素的哺乳动物靶点 STAT3（状态3） 信号转导子和转录激活子3 非编码RNA 非编码RNA 鱼类 RNA荧光原位杂交 杜兰特 击倒 运行经验 过度表达 ceRNA 竞争内源性RNA 二氧化二银 Argonaute 2号机组 UTR公司 非翻译区域 第五季度 Sirtuin 5号机组 瑞士法郎 环己烷
作者的贡献 JW和CLZ进行了所有实验。 YZW、ZCY、CL、WXF、YJ、KZH和YC参与了数据分析，进行了序列比对。 XJQ和YPL提供了有益的讨论。 JW和XFC起草了手稿。 XFC和XJH设计了该项目。 JFQ修改了手稿。 所有作者阅读并批准了最终手稿。
基金 这项工作得到了国家自然科学基金【No.819721978147219】的资助； 辽宁省重点研发计划项目（2018225060）； 辽宁省科技计划项目（No.2019-ZD-0777）； 沈阳市科技计划项目（编号：19-112-4-099）。 资金来源为这项研究提供了财政支持，没有任何其他参与这项研究。
道德批准和参与同意 动物研究是根据中国医科大学动物护理和使用委员会批准的方案进行的。
脚注
出版商笔记
Springer Nature在公布的地图和机构关联中的管辖权主张方面保持中立。
吴杰和郑春雷为这项工作做出了同样的贡献。
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4/1/2021
修改了原文，将车小芳作为联合通讯作者。
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5/12/2023
本文的更正已发表：10.1186/s40364-023-00496-3
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4/14/2021
本文的更正已发表：10.1186/s40364-021-00279-8
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