介绍
胶质母细胞瘤(GBM)是成人中最常见的恶性脑肿瘤,由于其浸润性生长行为,导致无法进行完全手术切除,因此具有高度致死性1,2为了启动侵袭,GBM细胞必须放松与邻近细胞和基质的连接;然后,他们面临的挑战是,在保持基底表面牵引力的同时,通过紧密的间隙空间进行谈判。入侵GBM细胞如何实现必要的机械顺应性的细胞和分子机制尚不清楚。已知GBM细胞沿着微血管和轴突纤维束侵入三,4,但影响首选迁移路径选择的分子因素尚不清楚。这种理解对于确定抑制GBM传播的分子靶点至关重要。
除了化学因子等生化信号外,细胞迁移行为还受周围环境的物理特性控制。有趣的是,当面对不同的基底硬度时,大多数细胞类型都会向较高的基底硬度迁移,这一行为被称为杜罗塔西5,6在GBM进展期间,随着肿瘤微环境逐渐变硬7GBM细胞必须减弱其硬脑膜偏向性,才能从僵硬的肿瘤体中分离出来,并侵入较软的脑实质。轴突导向分子在调节大脑发育过程中的神经迁移中起着核心作用8由于肿瘤细胞经常篡夺发育途径以促进其扩张,我们开始研究导向受体如何促进GBM侵袭。
Plexin是轴突导向受体,与信号蛋白配体结合,调节发育和成年生理过程中的多种细胞相互作用9–11Plexins通过Rap和R-Ras家族的小G蛋白发出信号,它们是细胞粘附和细胞骨架动力学的多效性调节器12–15在多种癌症中观察到丛蛋白和信号蛋白的异常表达,并与肿瘤恶性程度相关16,17Plexin-B2是GBM侵袭的一个特别强的启动子,因为它最初是由于在脑癌中上调而被发现的18随后的分析证实,根据患者数据,Plexin-B2是恶性胶质瘤的生物标志物19与GBM侵袭中的作用相吻合的还有一个事实,即丛蛋白-B2在大脑发育过程中发挥调节神经下索迁移的关键功能20,21我们自己的研究也揭示了Plexin-B2的高表达与GBM患者生存率低下之间的联系,并且Plexin B2增强了GBM细胞的迁移能力22然而,这些早期的研究主要是在含血清培养基中培养的传统GBM细胞系中进行的,即U87MG和LN229,它们在颅内移植中不显示浸润性生长,因此不适合研究GBM的侵袭性。此外,Plexin-B2如何促进GBM入侵的潜在机制尚不清楚。
有趣的是,Plexin-B2也被证明是血管生成素的入口受体,血管生成素是一种分泌的RNA-结合蛋白,具有多种致瘤作用。然而,血管生成素通过Plexin-B2的结合和内化似乎并不像典型的语义配体那样激活Plexin B2及其下游信号成分23.
在这里,我们研究了Plexin-B2如何通过利用一组患者衍生的GBM干细胞(GSC)系使GBM细胞获得侵袭性,这些细胞保留了亲代GBM的主要病理生理学,包括体内浸润性侵袭24–27我们在颅内移植模型中证明,GBM细胞沿着轴突纤维束的弥漫性浸润需要精细调节的Plexin-B2活性。值得注意的是,Plexin-B2消融不仅限制了GBM的传播,还改变了入侵模式和迁移路径。通过一系列机械敏感性分析和分子研究,我们发现GBM细胞通过篡夺Plexin-B2信号来调节细胞生物力学,从而获得侵袭力。
结果
颅内移植中GBM细胞沿轴突纤维束的弥漫浸润t吨秒
为了研究GBM细胞的弥漫侵袭机制,我们使用了一组患者源性胶质瘤干细胞系(GSCs),SD1–SD4,该细胞系已在神经干细胞培养基中建立并保持22这些GSC的分子多样性反映了GBM的高度肿瘤间异质性:例如,western blotting(WB)显示了受体酪氨酸激酶的不同表达谱,即SD1中的EGFR、SD2中的EGFR和MET、SD3和SD4中的PDGFRα,RNA-sequencing(RNA-seq)分析表明三种不同的转录亚型28(补充图1a、b). 所有GSC线均为IDH1/2野生型(补充图1亿),这是成人原发性GBM的典型情况29.
当移植到免疫功能低下小鼠的纹状体中时,所有四种GSC株都产生了侵袭性GBM,尽管它们的扩张速度有所不同。例如,虽然SD2 GSCs在植入后141天(dpi)时产生一个小肿瘤块,但SD3 GSCs形成的大肿瘤块已经相当于31 dpi(图和补充图1c个). 所有GSC品系的共同特点是它们向宿主大脑的扩散渗透。人类核抗原的免疫荧光(IF)染色显示GBM细胞不仅广泛分布于纹状体,而且沿着胼胝体深入到对侧半球(图和补充图1c–e).
颅内GSC移植中沿轴突纤维束弥漫性GBM浸润。一患者源性GSC原位移植到SCID小鼠宿主纹状体的示意图。此图形面板中的所有图像均来自植入后31天的GSC线SD3(dpi)。b条31 dpi时SD3 GSC移植的冠状脑切片免疫荧光(IF)图像显示,表达人类核抗原(hum.nuc.Ag)的肿瘤细胞在纹状体和胼胝体(CC,用虚线勾勒)中弥漫浸润。层粘连蛋白IF突出了包裹血管的基底层。c(c)放大后的中频图像显示出侵袭性GBM细胞(hum.nuc.Ag+)纹状体轴突纤维束(箭头所示),以髓磷脂碱性蛋白(MBP)IF突出显示。许多单个肿瘤细胞已经从肿瘤块中移出(星号)。定量分析表明,在肿瘤体积以外的区域,MBP中发现70%以上的浸润细胞+光纤束(n个 = 三只动物的6块田地;平均值±SEM)。d日SD3 GSC移植同侧区域的IF图像显示GBM细胞沿着胼胝体(CC)的纤维轨迹侵入。注意侵入GBM细胞的细长细胞核的方向与轴突纤维轨迹对齐,但与血管轴(层粘连蛋白+).电子来自移植有SD3 GSCs的大脑的同侧纹状体(左)和中线(右)的CC的IF图像。人类整合素β1染色的肿瘤细胞突出细胞表面,显示纹状体轴突纤维束(箭头)内弥漫分布,周围被微血管(PECAM-1)包围+). 注意,纹状体纤维束和粘附的GBM细胞的方向与冠状面垂直。还请注意CC中侵入的GBM细胞呈纺锤形,细胞轴与轴突轨迹对齐,但与微血管无关。右侧的量化表示胼胝体中与血管对齐的细胞百分比(n个 = 三只动物的6块田地;平均值±SEM)。
众所周知,GBM会侵犯血管周围30,我们检测了侵入的肿瘤细胞与血管的空间关系,通过血管内皮标记物PECAM-1或层粘连蛋白(血管基底膜的基质蛋白)的IF显示31出乎意料的是,我们在纹状体或胼胝体中没有观察到侵袭性GBM细胞的优势血管联系;相反,他们表现出对轴突纤维束的偏爱,这已被髓磷脂碱性蛋白IF证实(图). 纹状体内神经元组织中散布着轴突纤维束,GBM细胞主要位于轴突纤维丛内(图).
一贯地,在胼胝体中,侵入的GBM细胞的细胞核呈现出与轴突纤维轨迹一致的细长形态(图和补充图1c–e公司). IF对人整合素β1的细胞表面染色进一步勾勒出迁移的GBM细胞的纺锤形形状,与轴突纤维束方向相同,但与胼胝体中的血管轴方向不同(图). 同样,在纹状体中,迁移GBM细胞的细胞核主要与垂直于冠状面的轴突纤维束对齐(图). 用同型对照抗体染色证实了IF对人整合素β1的特异性(补充图2). 综上所述,在原位GSC移植中,侵入的GBM细胞广泛扩散,并通过紧密的间质间隙进行迁移,形成纺锤状形态,并沿着轴突纤维束粘附优先的迁移路径。
GSC中Plexin-B2和semaphorin 4的表达
为了了解Plexin-B2对GBM入侵的贡献,我们首先检测了其在GSC中的表达,发现所有四个GSC株系都大量表达Plexin B2(图和补充图3a年)与之前关于胶质瘤中Plexin-B2上调的报道一致19,22第4类信号素是Plexin-B的假定配体,我们通过WB检测了培养的GSC中SEMA4B和SEMA4C的表达,表明Plexin B2的旁分泌刺激的可能性(补充图3亿). 其他4类语义素也在GSC中表达,如RNA-seq分析所示(补充图3立方厘米),尽管SEMA4B公司和SEMA4C公司具有最高的mRNA水平,但不同GSC品系之间的水平不同,这可能是Plexin-B2功能的细胞系特异性差异的基础。Sema4基因也在小鼠脑中由多种细胞类型以各种组合表达32,33从而为Plexin-B2提供了额外的配体来源。值得注意的是,最近的一项研究表明,Plexin-D1可以以独立于语义的方式作为一种机械感受器34因此,并非所有的Plexins功能都需要信号素配体激活。
Plexin-B2消融限制GBM扩散。一Plexin-B2前体和成熟形式的结构示意图(在成熟过程中,Plexin-B2被裂解为α链和β链的非共价连接复合物)。带有Plexin-B2胞外区抗体的WB显示Plexin B2在SD2和SD3 GSC中的稳健表达。注意,细胞通常同时表达Plexin-B2的前体和成熟形式,因此具有双带模式。b条培养的GSC的IF图像显示,CRISPR KO细胞中缺乏Plexin-B2(PB2)的表面表达。底部面板显示了用同型IgG对照物染色的细胞的IF图像。c(c)注射后147天(dpi)SD2 GSC移植的冠状脑切片IF图像。注意肿瘤细胞的弥漫浸润(hum.nuc.Ag+)对照移植组纹状体和胼胝体(CC)(箭头)中,而PB2-KO GBM细胞主要局限于注射部位附近。还应注意PB2-KO移植(箭头)中肿瘤周围聚集迁移流中的肿瘤细胞聚集,与对照移植中的弥漫浸润模式相反。右侧的定量显示了GBM细胞(标准化为肿瘤核心)在距离肿瘤核心半径增加的环中的相对密度。n个 = 每个基因型3只小鼠。双向方差分析***P(P) < 0.001.d日CC区的IF图像显示丰富的肿瘤细胞(hum.nuc.Ag+)209dpi时,对照移植组跨越中线(虚线),但PB2-KO移植组对侧CC中检测到的肿瘤细胞要少得多。定量结果显示,在对侧CC中增量为0.3 mm的节段中发现了相对丰富的GBM细胞。n个 = 每个基因型4只小鼠。双向方差分析**P(P) < 0.01.电子移植有对照或PB2-KO SD2 GSC的小鼠的Kaplan–Meier生存曲线。两组小鼠均未死亡209 dpi(n个 = 每队列7只小鼠),反映了体内SD2 GSC的缓慢肿瘤扩展。(f)29 dpi下移植SD3 GSCs小鼠冠状脑切片的IF图像。含有PB2-KO的GBM细胞的浸润比对照细胞受到更多限制。右侧的定量显示了GBM细胞(归一化为肿瘤核心)在肿瘤核心半径增大的环中的相对密度。n个 = 每个基因型3只小鼠。双向方差分析***P(P) < 0.001.克SD3移植显示对侧CC的放大图像。中线用虚线表示。定量结果显示,在对侧CC中增量为0.3 mm的节段中发现了相对丰富的GBM细胞。n个 = 每个基因型3只小鼠。双向方差分析*P(P) < 0.05.小时Kaplan–Meier生存分析表明,接受PB2-KO SD3 GSCs颅内移植的小鼠存活时间显著长于接受对照GSCs移植的小鼠:n个 = 每组6只小鼠;中位生存期74.5天vs.49.5天*P(P) = 0.014,对数秩检验。
通过CRISPR/Cas9测定GSC中的Plexin-B2 KO
为了研究Plexin-B2在GBM侵袭中的作用,我们通过靶向第二编码外显子,在GSC中产生了CRISPR/Cas9-介导的Plexin-B2敲除(KO)PLXNB2系列我们分别利用基于质粒和慢病毒的递送方法建立克隆和群体KO系(补充图S3d、e)利用其互补特征:克隆系具有特定突变的单细胞起源优势,而群体系则更忠实地保持肿瘤内异质性,并具有稳定的生长特性,因为克隆选择过程中施加的细胞压力得以避免。事实上,我们观察到来自同一亲本GSC的克隆系颅内移植中肿瘤扩展的高度可变性,因此我们使用群体KO系进行了大多数体内分析。我们通过WB和IF验证了所有KO品系中成熟Plexin-B2的损失(图和补充图3英尺-小时).
我们首先在标准2D细胞培养条件下比较了Plexin-B2 KO和对照GSC,但在划痕试验中发现细胞形态、增殖动力学和伤口闭合能力没有明显差异(补充图4a–c类). 神经球形成测定中GSCs的自我更新能力也没有显著差异(补充图第4天).
Plexin-B2缺失限制GBM渗透
为了研究Plexin-B2消融对体内GBM浸润的影响,我们植入了PLXNB2系列KO和控制GSC进入SCID小鼠纹状体,重点关注人群PLXNB2系列SD2和SD3的KO系分别代表间充质和前脑GBM亚型(参见补充图1亿). 如上所述,SD2移植的扩张速度慢于SD3,但都表现出广泛传播;值得注意的是,Plexin-B2 KO限制了肿瘤在SD2和SD3移植中的扩散(图). 具体而言,在对照SD2队列中,肿瘤细胞以147dpi或209dpi的速度扩散到整个纹状体并沿着胼胝体深入对侧半球,而在Plexin-B2-KO队列中,我们观察到肿瘤细胞仍然靠近植入部位,很少有细胞穿透对侧半球(图). 此外,尽管在对照组中,侵入的肿瘤细胞主要以单个细胞的形式散布在纹状体各处,但在Plexin-B2 KO组中,它们倾向于在肿瘤边缘聚集成束流,这通过量化显示肿瘤周边GBM细胞密度降低得到了证实(图). 因此,Plexin-B2缺失不仅限制了GBM的传播,而且改变了入侵模式。由于SD2移植的扩张速度较慢,对照组或KO组小鼠在209dpi的时间内均未死亡,这是我们研究的终点(图).
在SD3移植中观察到类似的肿瘤侵袭表型:到29dpi时,对照组的肿瘤细胞已弥漫性浸润纹状体,并沿胼胝体深入对侧半球;但在KO队列中,肿瘤扩散更为有限(图). 与传播减少一致,SD3中Plexin-B2缺失导致存活时间显著延长,KO小鼠的中位存活时间从50天增加到74天(图).
接下来,我们用Plexin-B2的强制过表达(OE)检测移植GSC的肿瘤侵袭性,WB表明,OE细胞中Plexin B2的水平达到对照细胞的约1.7-2.4倍(参见补充图S8a、b)). 有趣的是,Plexin-B2 OE也减少了GBM的扩散,肿瘤细胞仍然聚集在植入部位(补充图5a级)这表明成功的GBM入侵需要精细调节和平衡的Plexin-B2活性。
Plexin-B2缺失改变入侵GBM细胞的迁移路径
Plexin-B2 KO移植中GBM细胞浸润模式的改变表明迁移路径可能发生改变。因此,我们根据轴突束和血管轴检查了入侵GBM细胞的核取向和细胞形态。在对照移植中,侵袭的肿瘤细胞表现出对轴突纤维束的偏爱,而在Plexin-B2 KO队列中,它们更倾向于沿着微血管迁移,核方向与血管轴对齐(图和补充图5b、c). 定量分析表明,与对照组相比,KO移植中粘附在微血管上的肿瘤细胞数量是对照组的两倍(SD2分别为82.2%和55.8%,SD3移植分别为64.0%和33.5%)(图和补充图5厘米). 与对照组纹状体轴突束的排列相比,人整合素β1的IF在Plexin-B2 KO移植中勾画出了迁移的GBM细胞在肿瘤边缘的方向,与血管轴紧密对齐(图和补充图5亿). 此外,它还强调了侵袭肿瘤细胞沿血管系统的迁移链,这让人想起在Plexin-B2 KO小鼠中观察到的迁移表型,在嗅球中发现了迁移神经祖细胞的异常链35.
Plexin-B2缺失将优先迁移路径从轴突束转移到微血管。一147 dpi下SD2移植脑冠状切片的典型IF图像(虚线箭头表示注射道)。而肿瘤细胞(hum.nuc.Ag+)在对照组中,纹状体以单个细胞的形式广泛浸润,在PB2-KO组中,这些细胞主要局限于移植部位,显示出聚集性增加,并以束(箭头)的形式集体浸润邻近脑组织。底部框状区域的放大图像显示,对照移植中侵入的GBM细胞偏爱纹状体纤维束(箭头),而PB2-KO细胞则偏爱血管周围浸润(箭头)。注意,迁移的PB2-KO细胞的核取向与血管轴紧密对齐(PECAM-1+). 条形图显示了沿着血管系统侵入的肿瘤细胞的数量,定义为与血管相距一个或一个以下细胞直径的细胞。n个 = 三个独立移植的9个区域;未配对的t吨测试**P(P) < 0.01.b条147 dpi下移植PB2-KO SD3 GSCs的小鼠纹状体附近邻近脑切片的IF图像。左图:在侵袭前沿,突变GBM细胞表现出明显的血管周侵袭倾向(PECAM-1),其核取向与血管轴对齐(箭头)。右图:人特异性整合素β1的IF显示PB2-KO细胞以束(箭头)的形式集体链迁移,明显避开纹状体纤维束,背景荧光信号可见。请注意,迁移的GBM细胞在侵袭前沿紧密粘附在血管上(比较左侧和右侧面板中的图像)。c(c)三维血管网络培养的图像(包含人脑微血管内皮细胞(GFP+)、周细胞和星形胶质细胞),接种有表达mCherry的PB2-KO SD2 GSCs。细胞接种后14天拍摄照片。PB2-KO细胞倾向于血管粘附(箭头)。右侧的定量显示了血管附近肿瘤细胞的相对丰度(0–20µm距离)。n个 = 每组4个独立实验。未配对的t吨测试*P(P) < 0.05.
为了进一步研究Plexin-B2缺乏的GSC对血管周侵袭的偏好,我们在纤维蛋白基质中构建了血管网络的3D培养模型,其中包含GFP标记的人脑微血管内皮细胞(hBMVECs),以及人原代周细胞和星形胶质细胞,支持管腔形成和血管稳定性。我们将对照组和Plexin-B2 KO GSC嵌入3D血管模型中,确实发现KO细胞显示血管周围粘附的比例明显高于对照细胞,并且它们也呈现出与血管轴对齐的细长形态,重现了体内表型(图).
Plexin-B2调节GSC的细胞-细胞粘附
接下来,我们研究了可能影响GSC侵袭性的Plexin-B2功能的细胞机制。由于标准2D培养或刮伤试验未显示Plexin-B2 KO GSC中的显著变化,因此我们转向在3D条件下结合细胞-细胞/细胞-基质相互作用的试验。肿瘤细胞迁移流的体内Plexin-B2 KO表型表明细胞间粘附性增加。我们通过设计细胞分散试验来研究这种可能性,以测量细胞脱离3D细胞聚集物的能力,这需要在获得2D层粘连蛋白涂层表面的牵引力的同时降低细胞间粘附。为此,首先允许GSC形成3D聚集物,然后将其镀到层粘连蛋白涂层皿上,并分析2-4小时内从聚集物中分散的细胞数量。事实上,与对照组相比,对于SD2和SD3 GSC,Plexin-B2 KO细胞的分散率明显更低,但Plexin-B2 OE细胞的扩散率更高(图和补充图第6页). 这支持Plexin-B2通过促进GSC与邻近细胞的分离来增强侵袭性的模型。
Plexin-B2降低GSC中的细胞粘附性。一左图是将3D聚集体镀在层粘连蛋白涂层表面上并在4小时后分析细胞从聚集体中分散的细胞分散测定图。中心,DAPI染色聚集物和周围分散细胞的显微照片(箭头)。右,细胞分散的量化,标准化为控制条件的平均值。方框图和胡须表示四分位数,中心线表示中值。n个 = 每组18–34个球体;单因素方差分析(ANOVA),每组与对照组进行Dunnett多重比较试验*P(P) < 0.05, **P(P) < 0.01, ***P(P) < 0.001.b条图中显示了悬滴细胞聚集分析。水滴的照片显示,播种96小时后,SD2 GSC通过所示的Plexin-B2操作形成聚集体。对,24小时和96小时时骨料数量和尺寸的量化。n个 = 每组5-11滴悬挂液;单因素方差分析(ANOVA),每组与对照组进行Dunnett多重比较试验*P(P) < 0.05, ***P(P) < 0.001.c(c)左图为不同基因型的GSC用绿色或红色CellTracker染料标记并在播种前1:1混合后的差异悬滴细胞聚集分析图。右图,24小时后SD2聚集的荧光图像显示,PB2-KO细胞聚集在中心(箭头),而对照细胞主要聚集在外围,说明PB2-KO细胞之间的粘附性更强。具有相同基因型(Ctrl+Ctrl或KO+KO)的GSC的混合物导致聚集物均匀分布。d日表达mCherry的SD2 GSCs的荧光图像,其作为聚集物嵌入3D纤维蛋白凝胶基质中。注意27天后生长/侵袭模式的显著差异:对照细胞作为单个细胞(箭头)扩散侵袭,而PB2-KO GSC以束状迁移流的形式共同侵入周围基质(箭头所示)。
接下来,我们使用3D细胞聚集分析直接评估细胞粘附性36将分离的GSC以高密度悬浮液滴播种,并对24-96小时内形成的细胞聚集物的数量和大小进行量化。引人注目的是,Plexin-B2 KO导致SD2和SD3 GSC的细胞聚集较少但较大;相反,Plexin-B2 OE导致SD2和SD3在24小时时具有可比大小的聚集物数量增加,而在48小时时,只有SD3表现出与对照相比数量增加和较小的细胞聚集物(图和补充图6b条). 为了进一步检测细胞间粘附性,我们使用了差异细胞聚集试验36用不同的染料标记GSC。我们观察到同一基因型的SD2 GSC混合均匀,但当对照组和PB2-KO SD2 GSCs混合在一起时,PB2-KO细胞聚集在中心,而对照组细胞聚集在外围,这表明Plexin-B2 KO细胞之间的细胞粘附性较高(图). 值得注意的是,由于SD3 GSC的聚集速度更快,这种差异细胞粘附试验不适用于SD3 GSCs,因此很难在较大的聚集物中识别荧光模式(补充图第6页c).
与在3D环境中控制细胞粘附性的作用一致,Plexin-B2还规定了三维纤维蛋白凝胶中GSC聚集体的细胞浸润模式。培养27天后,对照组SD2 GSC以单个细胞的形式向周围扩散,但Plexin-B2 KO细胞以流的形式集体穿透周围基质(图),反映了体内侵袭表型。综上所述,一系列实验有力地支持了Plexin-B2调节细胞粘附的模型,这可能是Plexin B2 KO GBM细胞在体内外分散率降低和链迁移模式增加的原因。
Plexin-B2影响细胞-基质生物力学相互作用一作用与强迫行为
侵袭的肿瘤细胞暴露在不断变化的机械环境中,因此迁移的GBM细胞不仅需要调整与邻近细胞的粘附性,还需要调整它们与可能具有不同物理特性的迁移路径上的基质基质的机械相互作用。因此,我们研究了Plexin-B2对迁移的GSCs与不同硬度基质的生物力学相互作用的影响。大多数粘附细胞向更高的基底硬度迁移,这种行为称为硬膜外变性5这给GBM细胞带来了机械挑战,这些细胞试图从僵硬的肿瘤体中分离出来并侵入较软的脑实质37为了测试Plexin-B2是否会影响杜氏行为,我们将游离的GSC接种在软质和硬质基质的交替条纹上,并检查其扩散情况。令人惊讶的是,培养10天后,对照组SD2 GSC在软条纹和硬条纹上均有分布,而Plexin-B2 KO细胞仅聚集在较硬的条纹上,在较软的条纹上没有显著分布(图). SD3 GSC也观察到类似但较弱的影响(补充图6天). 由于Plexin-B2在GSC中高度表达,我们的数据表明,Plexin B2可对抗扭转趋势,并具有迁移能力,而与基底硬度无关。这种能力对于GBM细胞脱离坚硬的肿瘤体积并开始侵入较软的脑组织可能至关重要。
Plexin-B2可对抗趋化作用,增强细胞运动和肌动球蛋白网络。一Durotaxis条带分析。表达mCherry的SD2 GSC在软(~25 kPa)和硬(~30 kPa)PEG底物的交替条纹上培养10天。当对照组GSC分布在软条纹和硬条纹上时,PB2-KO细胞仅聚集在较硬的条纹上。放大的图像显示在右侧。量化测量软条纹与硬条纹的樱桃荧光信号。n个 = 每组3个独立实验*P(P) < 0.05,未配对t吨测试。b条从GSC的延时实时成像中捕获的静止帧,用Hoechst核染料跟踪(彩色线跟踪单个核)。量化结果显示,与对照组相比,PB2-KO GSC的迁移距离缩短了90分钟(见补充视频)。SD2 PB2-OE GSC也降低了运动速度,但未检测到SD3的显著变化。n个 = 每种情况下90个追踪核;单因素方差分析与Dunnett多比较检验*P(P) < 0.05; **P(P) < 0.01.c(c)顶部,使用CellMask膜染料标记的指示SD2 GSC的延时实时成像的静止帧。底部,每组中的三个选定细胞以重叠等高线图显示,间隔30分钟,超过90分钟。注意与PB2-KO和-OE条件相比,控制细胞的动态移动(参见补充视频)。d日IF图像显示与对照细胞相比,PB2-OE SD2 GSC中磷酸肌球蛋白轻链2(pMLC2,箭头)的水平增加。对,定量显示每个细胞pMLC2的IF强度水平增加(校正的总荧光定量;a.u.,任意单位)。n个 > 每种情况下30个细胞。用Dunnett的多元比较检验进行单因素方差分析*P(P) < 0.05. SD3 GSC的差异没有达到统计学意义。电子F-actin染料SPY-actin染色GSC的活细胞成像。SD2和SD3 GSC中PB2的过度表达导致肌动蛋白丝形成增加(箭头)。定量表示校正的总细胞荧光;a.u.,任意单位。n个 > 每种情况下30个细胞。用Dunnett的多元比较检验进行单因素方差分析*P(P) < 0.05.(f)工作模式。Plexin-B2控制着动肌球蛋白的动态以及入侵GBM细胞与迁移路径上的相邻细胞和基质基质的相互作用。
丛蛋白B2影响细胞运动和肌动球蛋白网络分布
侵入的GBM细胞通过呈现梭形形态并紧密粘附于迁移表面,可以成功地通过紧密的间隙。为了研究Plexin-B2对细胞运动的依赖性,我们对GSC进行了延时活细胞成像。我们通过使用CellMask膜染料追踪细胞核或细胞轮廓来分析细胞运动,这表明与对照细胞相比,SD2和SD3 PB2-KO GSC的细胞运动减少(图以及补充视频1-4)。值得注意的是,SD2 Plexin-B2 OE GSC的运动速度也慢于对照GSC,这表明Plexin B2的强制过度表达也对其运动行为产生了负面影响。
为了研究Plexin-B2是否影响肌动球蛋白的收缩性,我们检测了肌动球酶收缩起始物磷酸肌球蛋白轻链II(pMLC2)的表达38事实上,IF显示Plexin-B2 OE GSC的pMLC2皮质网络增加,而Plexin-B2 KO细胞相对于对照组表现出减少的趋势(图). 我们进一步对肌动蛋白丝染色的GSC进行了活细胞成像,这证实了PB2-OE GSC中F-actin形成增加(图). 总之,Plexin-B2通过降低细胞粘附性、赋予在软基质上传播的能力(即抗硬膜外渗透)以及调整肌动球蛋白网络分布和细胞运动,增强了GBM在复杂机械环境中的侵袭能力(图).
Plexin-B2相关转录本o个nal特征指向生物力学功能
为了检测GBM中丛蛋白B2相关的分子特征,我们首先查阅了TCGA(癌症基因组图谱)GBM患者数据库,并提取了表达水平与PLXNB2系列GBM中的水平(Spearman的rho>0,FDR<10%)。系统生物学分析表明PLXNB2系列-相关基因在细胞粘附、细胞-基质连接和肌动球蛋白途径方面显著丰富(图)从而为Plexin-B2与细胞生物力学的联系提供分子支持。
基因表达分析将Plexin-B2与GBM中的生物力学基因特征联系起来。一与PLXNB2系列GBM患者的表达水平(Spearman相关性FDR<10%,TCGA数据库)丰富了与细胞粘附、细胞基底连接和肌动球蛋白有关的通路。左侧显示了前10个重要功能术语(MSigDB)。右,共调控基因与PLXNB2系列在人类GBM中,筛选与细胞粘附、运动/侵袭和EMT有关的基因。b条RNA-seq读取轨迹示例PLXNB2系列SD4 GSC野生型和PB2-KO基因型三个GSC克隆系的mRNA。PB2-KO株的移码突变导致PLXNB2系列非传感介导衰变(NMD)的mRNA水平。c(c)Plexin-B2 KO对上调和下调DEG的通路富集分析(四个GSC品系的所有DEG的结合;FDR<20%)。显示了前十个显著丰富的术语(MSigDB)。黄色虚线表示−log10(已调整P(P)值)=0.05。d日PB2-KO与对照组GSC表达变化的GSEA显示Matrisome基因集丰富(Naba等人。39)用于所有四条GSC线路。富集分数的正弦形状(绿线)表示上调和下调基因的富集。
接下来,我们通过进行RNA-seq分析来检测GSCs对丛蛋白B2缺失的基因表达变化。RNA-seq数据的质量首先被突变体水平的降低所证实PLXNB2系列PB2-KO GSC中由于非传感介导的衰变而发生移码突变的转录物(图). 我们鉴定了差异表达基因(DEGs,adj。P(P) < 与对照品相比,Plexin-B2 KO GSCs中SD1-SD4系的基因范围为7到950个(补充图第7页). 不同组DEG的重叠较小,反映了Plexin-B2缺失时细胞对生物力学变化的特异性转录反应。对上调和下调的二甘醇的通路富集分析表明,它们参与运动行为、上皮-间充质转化(EMT)和Matrisome,Matisome由细胞外基质(ECM)和细胞粘附蛋白组成39(图). 离子转运基因也在DEG中富集,DEG可以通过调节细胞室内的流体动力学压力来支持细胞运动三一致地,基因集富集分析(GSEA)将排名基因列表与功能基因集相匹配,揭示了所有四个GSC中Matrisome基因集(在Plexin-B2 KO的上调和下调谱中)的富集,包括所有Matrisome-亚群(图和补充图6b条). 综上所述,Plexin-B2 KO与对照组GSC的转录谱分析显示了与PLXNB2系列-TCGA患者数据集中的共同调控基因,都表明Plexin-B2与涉及细胞运动和生物力学特性的基因通路有着密切的联系。
Plexin-B2参与细胞内GAP结构域调节细胞生物力学特性
Plexins可以通过Ras和/或Rho小G蛋白发出信号来调节细胞骨架动力学12,40据报道,Plexins高度保守的细胞内Ras-GAP结构域可使小G蛋白如R-Ras、M-Ras和Rap1/2失活41–43,而Plexin Bs的C末端含有PDZ结合基序,用于PDZ-Rho-GEF和LARG的对接,这两种鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)可以激活RhoA44此外,Plexins还包含一个Rho结合域(RBD),其中Rac1或Rnd1/2/3可以结合,可能用于调节Plexin活性41,45,46.
为了确定参与控制GSC细胞生物力学的Plexin-B2结构域,我们通过将一系列Plexin B2信号突变体(在sgRNA靶位点有额外突变,使其对CRISPR介导的KO耐药)引入Plexin-B2 KO GSC进行结构-功能分析,以进行救援实验(图和补充图第8页a).
Plexin-B2信号传导参与Ras-GAP域。一Plexin-B2域结构的卡通。细胞膜呈灰条状;虚线表示蛋白质分解成α链和β链。Sema,Sema域;PSI,plexin-semaphorin-整合素结构域;IPT,丛蛋白和转录因子共享的类Ig折叠;RBD,Rho结合域;GAP、GTPase激活蛋白;四个C端氨基酸形成的VTDL、PDZ域结合位点,用于PDZ-Rho-GEF或LARG蛋白的对接。b条编码Plexin-B2野生型或信号突变体cDNA的慢病毒载体图。PB2*是CRISPR抗性cDNA,由于sgRNA靶位点的同义突变(X)。dEcto缺乏胞外结构域,mGAP突变了GTPase激活域,mRBD突变了Rho结合域,dVTDL删除了PDZ结合基序。c(c)用于Plexin-B2(PB2)救援实验的悬挂液中的细胞聚集试验。照片和放大图显示,96小时后,由GSC形成的聚集物在悬挂液滴中显示出Plexin-B2突变。24小时或96小时悬挂液滴的聚集物数量和大小的定量如下所示。mGAP和dEcto Plexin-B2突变体未能拯救KO表型(标记为蓝色)。n个 = 每组5-11滴;单因素方差分析,每组的Dunnett多重比较检验与SD2-Ctrl*P(P) < 0.05, ***0.001.d日左图为表达突变Plexin-B2救援结构的GSC细胞分散分析的代表性显微照片。用DAPI核染色在4h时观察聚集物中分散的细胞。底部,量化显示了在控制条件下从标准化为平均值的球体上分离的核数。PB2 mGAP突变体未能拯救KO表型(标记为蓝色)。方框图和胡须表示四分位数,中心线表示中值。n个 = 每组18-34个球体;单因素方差分析(ANOVA),每组与对照组进行Dunnett多重比较试验*P(P) < 0.05, ***P(P) < 0.001.电子描述通过Ras-GAP域传递Plexin-B2信号以影响GBM侵袭期间细胞生物力学的模型。
使用悬滴细胞聚集试验,我们发现Plexin-B2在Ras-GAP域(mGAP)突变或胞外域(dEcto)缺失时通常无法拯救KO表型,这些突变系的较大细胞聚集证明了这一点(图和补充图第8页c). 这表明这两个结构域在降低细胞粘附中起着重要作用。值得注意的是,我们观察到了一定程度的可变性,特别是在96小时时,并且在某些情况下,GAP死亡的Plexin-B2仍有可能部分取代Plexin-B2的功能,可能是通过接合Plexin-B2细胞内结构域的其他部分,如VTDL PDZ结合基序。
在细胞聚集物分散分析中,只有Ras-GAP,而不是外结构域似乎是必需的,因为用mGAP从3D细胞聚集物中分散的细胞较少(图). dEcto突变体的拯救表明,Plexin-B2可能具有非信号素依赖性的功能,用于介导细胞分散,细胞内结构域可能就足够了。在此背景下,有趣的是,Plexin-A的dEcto突变体可以激活细胞崩溃47,48总之,我们的结构-功能分析指出了Plexin-B2的Ras-GAP活性在控制细胞生物力学特性中的中心作用(图).
Plexin-B2影响Rap1/2和YAP ac(c)GSC中的活动
鉴于Plexin-B2的Ras-GAP结构域在介导粘附性能和细胞分散中的关键作用,我们进一步研究了Plexin B2对Ras活化的影响,重点是假定的靶点Rap1和Rap243我们通过WB证实,Rap1和Rap2在GSC中表达,Plexin-B2 KO或OE似乎没有改变Rap1/2的总蛋白水平(补充图第九章; “输入”)。然后,我们测量了3D GSC聚集物中活性Rap1和Rap2(即GTP-结合)的水平,这些聚集物被forskolin短暂刺激以增强基线Rap1/2的激活49Plexin-B2 KO导致SD2和SD3中的活性Rap1和Rap2水平增加,尽管SD2中的活性更稳定。出乎意料的是,Plexin-B2 OE并没有降低SD2中活性Rap1/2的水平,甚至导致SD3 GSC中活性Rap 1/2的水平升高(补充图第九章)这表明Plexin-B2可能不足以降低Rap1/2活性,并且Plexin B2以细胞系特异性方式参与Rap1/2和其他Ras GTPase的复杂性尚不清楚。需要注意的是,Rap1/2激活的变化可能与Plexin-B2 GAP活性无关,但由于其他成分对Plexin-B2操作的反应发生了变化。未来需要对Rap活性水平(包括信号突变体)进行灵敏度更高的分析,以解决这些问题。
最近的一项研究表明,Rap2可以通过转录因子YAP/TAZ将底物刚性信息传递给机械敏感性细胞活性50,我们测试了Plexin-B2活性是否会影响YAP/TAZ的核定位。我们观察到Plexin-B2 OE GSC中YAP/TAZ的核定位有增加的趋势,然而,PB2-KO细胞的结果是可变的,SD3 Plexin B2 KO显示减少,但SD2 Plexin-B2 KO细胞中YAP/TAZ的核位置略有增加(补充图9亿). 因此,尽管这很有趣,但考虑到不同品系的可变性,需要开发额外的分析和方法来检查Plexin-B2和YAP/TAZ活性之间的联系。
讨论
弥漫性浸润是GBM的病理特征51因此,确定潜在的细胞和分子机制至关重要。在这里,我们强调了入侵肿瘤细胞与其环境的复杂物理相互作用,包括邻近细胞以及基质基质。通过一系列旨在了解GBM细胞如何运作以获得侵袭性的体外试验,再加上体内原位移植研究,我们揭示了引导受体丛蛋白-B2发挥其促进GBM侵袭功能的三种潜在生物力学机制。
首先,我们证明了Plexin-B2降低细胞粘附,这是GBM细胞从肿瘤体上分离并开始侵袭的关键步骤。Plexin-B2缺乏的GSC的细胞聚集增强与Plexin B2 KO小鼠小脑发育中小脑颗粒细胞的异位聚集相呼应20有趣的是,Plexin-B2在GBM入侵的情况下起到减少细胞粘附的作用,因为Plexins最初被描述为嗜同性粘附分子52在神经母细胞瘤模型中,Plexin-a被证明是前粘附分子53需要进一步分析以解决这些不同的影响,这些影响可能与不同的癌症模型或Plexin亚类之间的差异有关。
其次,Plexin-B2指示GSC如何响应不同的基底刚度。在条纹分析中,我们发现Plexin-B2 KO GSCs主要聚集在坚硬的基质上,而对照GSCs能够在柔软和坚硬的基质上扩散。这是一个具有临床意义的重要观察结果:随着GBM的进展,肿瘤块逐渐变硬7; 然而,大多数正常的细胞类型都表现出强直行为。因此,GBM细胞必须找到一种方法来对抗Plexin-B2上调可能带来的杜氏倾向。然而,Plexin-B2如何使GBM细胞侵入较软的脑实质尚待确定,这可能与增强细胞骨架收缩性或增强基底锚定以获得足够的牵引力有关。
第三,Plexin-B2促进细胞骨架动力学,通过细胞运动、皮质肌动球蛋白网络和分子特征的延时视频成像证明。我们的发现也与早期关于肌动球蛋白收缩作为迁移树突状细胞中丛蛋白功能的介体的报道相一致54有趣的是,Plexins因暴露于信号蛋白后生长锥崩溃而闻名,这归因于F-actin解聚。急性塌陷反应可能不同于持续Plexin-B2激活和强制过表达对肌动蛋白网络再分配的影响,后者可能通过信号素非依赖性机制发生,这与我们的观察结果一致,即dEcto Plexin-B2可以挽救细胞分散(见图). 细胞固有的生物力学特性对于迁移细胞在基质表面保持牵引力的同时通过紧密的间隙至关重要;在这种情况下,平衡的Plexin-B2活性似乎至关重要,因为Plexin B2缺乏或强制过度表达都会阻碍GBM在颅内移植中的传播。这呼应了神经发育过程中平衡的信号蛋白/丛蛋白活性水平的要求,在这种情况下,功能丧失和获得都可能导致类似的轴突导向缺陷55.
我们之前对GBM基因表达数据库的分析表明,GBM中Plexin-B2的高转录与患者生存率低有关22; 在本研究中,我们观察到Plexin-B2的强制过表达阻碍了GBM的渗透。这些数据可能不会相互冲突,因为GBM细胞可能能够通过反馈调节机制到内源性PLXNB2系列这与我们目前的实验范式不同,即在5′和3′UTR中没有调控序列的复合启动子下,慢病毒强制过表达Plexin-B2 cDNA。
为了揭示Plexin-B2的生物力学功能,我们的研究强调了使用旨在反映3D条件下生物力学挑战的分析的重要性,因为传统的2D培养分析没有揭示表型变化。因此,丛蛋白的一个基本功能在于调节细胞接触,可能涉及通过语义蛋白激活旁分泌。Plexin-B2的替代激活也可能通过作为机械传感器的潜在信号素无关功能实现34还必须考虑到Plexin-B2作为血管生成素进入受体的作用可能有助于胶质瘤的生长23但我们关于Plexin-B2的细胞内Ras-GAP结构域在介导GSC生物力学特性方面的重要性的功能数据使得这种可能性较小。
Plexin-B2消融将侵袭GBM细胞的首选迁移路径从轴突纤维束转移到血管周围。在这种情况下,值得注意的是,包裹大脑微血管的基底层具有相对较高的刚度56因此,血管周围迁移的偏向可能反映了Plexin-B2缺乏的GBM细胞的杜氏偏好。未来的研究需要解决迁移表面的其他化学和物理属性,这些属性决定了首选迁移路径的选择。同样重要的是要注意潜在的阶段依赖性侵袭行为:在我们之前对SD2移植的早期肿瘤扩散的研究中,我们发现14dpi时肿瘤细胞存在显著的血管联系,Plexin-B2的敲除似乎降低了这种联系22在GBM扩散更晚期的研究中(即~150至200dpi),我们发现浸润的GBM细胞更倾向于轴突束。还需要进一步的研究来探索Plexin-B2在GBM细胞中的操作是否会影响肿瘤血管形成模式。
GBM的高度肿瘤间异质性反映在不同患者来源的GSC株对Plexin-B2操作在表型特征、差异调节基因和Rap1/2激活方面的不同反应。然而,我们的数据也强调了不同GSC株系中Plexin-B2信号在细胞运动、细胞粘附性和基质调节方面的功能趋同。从治疗的角度来看,刺激性的新策略可以阻断丛蛋白功能,例如环状肽57和针对信号素的功能阻断抗体58值得未来探索。
我们确定Ras-GAP结构域的参与对Plexin-B2介导的细胞生物力学至关重要,这一发现与我们最近的系统发育分析一致,该分析揭示了Ras-GAP结构域是Plexin在整个动物进化过程中最保守的部分59开发针对Plexin-B2的Ras-GAP结构域的特异性小分子抑制剂(尚不可用),因此代表了抑制GBM传播的另一个有希望的方向。还需要进一步研究来阐明Plexin-B2、Rap或其他Ras GTPases以及YAP/TAZ在调节机械敏感性细胞活动中的联系。
总之,我们的研究强调了肿瘤侵袭的复杂性以及侵袭GBM细胞与环境的物理相互作用的重要性,这些物理相互作用是由适当水平的Plexin-B2活性控制的生物力学特性决定的。我们的数据支持这样一种模型,即Plexin-B2被GBM细胞篡夺,以增强侵袭力,对抗硬膜外基质,通过血管与轴突基质的相互作用,并对其所动员的基质的不同性质作出反应。对细胞生物力学的新理解可以开辟抑制GBM侵袭的新途径。
方法
老鼠
成年雄性免疫功能低下的SCID小鼠(IcrTac:ICR-Prkdc公司科学情报部)颅内移植研究从Taconic Biosciences购买。所有动物程序均按照西奈山伊坎医学院动物护理和使用委员会(IACUC)批准的方案进行。
人GBM细胞系
Kesari博士和Pingle博士从圣地亚哥加州大学GBM患者切除的肿瘤组织中建立了未经鉴定的人类GBM干细胞(GSC)系SD1–SD422GSC在神经干细胞培养基(Neurocult NS-A增殖试剂盒(人类),Stemcell Technologies)中增殖,并补充bFGF(10 ng/ml;肽基),EGF(20 ng/ml;Peprotech)、肝素(0.0002%;Stemcell Technologies)和青霉素-链霉素(1:100;Gibco),并在涂有层粘连蛋白(PBS中10µg/ml;37°C温度下1小时;Invitrogen)。对于传代,细胞与Accutase(BD Biosciences)分离。通过分析EGFR、PDGRA和MET的独特表达模式,通过WB和RNA测序鉴定GSC株系。本研究中的细胞系通过IMAPCT I PCR图谱分析(IDEXX BioAnalytics)检测支原体污染和病毒感染,结果为阴性。
颅内GCS移植
颅内移植1×105将2µl Opti-MEM(Gibco 31985070)中的GSC立体定向注射到成年免疫缺陷ICR-SCID小鼠(IcrTac:ICR-Prkdc公司科学情报部; 塔康生物科学公司)。在生存研究中,当出现神经症状时对小鼠实施安乐死,并使用GraphPad PRISM软件计算Kaplan–Meier生存曲线。用免疫荧光法对颅内肿瘤进行组织学分析。
脑切片和培养细胞的免疫荧光(IF)
将携带颅内GSC移植的小鼠心内灌注PBS,然后在PBS中灌注4%多聚甲醛(PFA)。将大脑解剖并在4°C的4%PFA/PBS中过夜固定,然后在12.5%和25%蔗糖/PBS中4°C连续孵育过夜进行冷冻保护。将大脑嵌入TissueTek OCT复合物(樱花)中,将组织块冷冻在干冰上并储存在−80°C。以25µm的厚度切割恒冷器部分,并将其作为浮动部分存储在4°C的PBS中。为了进行免疫荧光染色,将切片在封闭缓冲液(含5%驴血清和0.3%Triton X-100的PBS)中封闭1h,然后在4°C下与抗体稀释缓冲液中的一级抗体孵育过夜(含1%BSA和0.3%特里顿X-100的PBS),然后用Alexa二级抗体染色(Jackson ImmunoResearch)2hr,用DAPI(Invitrogen)进行核复染。切片在PBS中清洗,并用Fluoromount G(Southern Biotech)安装在玻璃载玻片上。图像是用蔡司AXIO成像仪拍摄的。A2显微镜,配备AxioCamMRc摄像头和AxioVision软件。
通过在ImageJ中绘制显微照片,对GBM细胞散射进行量化,将肿瘤核心的轮廓作为连续细胞密度最高的区域。这个形状被扩大了四倍,每个轮廓是原来尺寸的1.5倍。计算轮廓之间每个环内的细胞数。将细胞密度标准化为肿瘤核心内的密度。
对于培养细胞的IF,将GSC以低密度接种在层粘连蛋白涂层的室载玻片(Thermo Fisher)中,并在适当的培养期(>24小时)后用室温下PBS中3.7%的甲醛固定10分钟。然后将室载玻片上的细胞封闭1分钟在封闭缓冲液(含5%驴血清和0.3%Triton X-100的PBS)中培养h,并在4°C下与抗体稀释缓冲液中的一级抗体(含1%BSA和0.3%Triton X-100的PBS)孵育过夜,然后用Alexa结合二级抗体染色(Jackson ImmunoResearch)2h.用同一物种(Jackson ImmunoResearch)在相应稀释度下纯化的全IgG替换一级抗体进行同位素对照染色。用罗丹明-球蛋白(Invitrogen)对F-actin进行染色,用DAPI(Invitorgen)进行核复染。
蛋白质印迹
为了通过蛋白质印迹法检测蛋白质,用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液(Sigma)制备细胞裂解液。通过SDS-PAGE在4–12%NuPAGE双三梯度凝胶(Invitrogen)上解析裂解产物,并使用Novex凝胶系统(Invit罗gen)将其转移到硝化纤维素膜上。将膜与一级抗体在4°C下孵育过夜,然后与二级驴抗体IRDye 680和800(Li-Cor)孵育1小时,用奥德赛红外成像系统(Li-Cor)检测条带。补充图中显示了Western blot膜扫描的未截取图像10和11.
初级抗体
用于western blot分析(WB)或免疫荧光(IF)的抗体如下:
抗β-肌动蛋白,西格玛A1978(宿主物种:小鼠),WB稀释度1:10000
抗EGFR,细胞信号技术4267(兔子),1:1000用于WB
抗人核抗原(HNA),Millipore MAB1281(小鼠),1:250用于IF
抗整合素β1(人特异性克隆TS2/16),Santa Cruz sc-53711(小鼠),1:300用于IF
抗层粘连蛋白,Millipore MAB1905(大鼠),1:200用于IF
抗MBP,CST 78896(兔子),IF 1:100
抗MET,细胞信号技术8198(兔子),1:1000用于WB
抗pMLC2(Ser19),细胞信号技术3671(兔子),1:100用于IF
抗PDGFRα,细胞信号技术3174(兔子),1:1000用于WB
抗PECAM-1/CD31,BD Biosciences 553370(大鼠),1:300用于IF
抗Plexin-B1,研发系统AF3749(山羊),1:400用于WB
抗Plexin-B2,胞外结构域,研发系统AF5329(绵羊),1:400用于WB,1:100用于IF
抗Plexin-B2,胞内结构域,Abcam ab193355(兔子),WB为1:1000
抗Plexin-B3,研发系统AF4958(绵羊),1:400用于WB
抗Sema4B,Proteintech 16934-1-AP(兔子),1:400用于WB
抗Sema4C、LSBio C150056(绵羊)、1:400(WB)
anti-YAP/TAZ,Santa Cruz sc101199(小鼠),IF为1:100。
对于同型对照IF染色,我们使用来自相同宿主物种的血清纯化IgG组分作为类似浓度的一级抗体(Chromepure IgG,Jackson ImmunoResearch)。
CRISPR/Cas9第页我用于Plexin-B2 KO的asmid和慢病毒载体
基于质粒的CRISPR/Cas9突变PLXNB2系列,产生质粒pX459-sgPLXNB2,该质粒表达Cas9和针对第二个编码外显子的小引导RNAPLXNB2系列(sgPB2,GTTCTCGGCGCGACCGTCA),使用pX459作为主干60.
对于基于慢病毒的CRISPR/Cas9突变,以pLentiCRISPRv2为骨架,生成了表达sgPB2的质粒pLentiCRISPRv2-sgPLXNB261使用表达针对EGFP编码序列的sgRNA的质粒pLentiCRISPv2-sgEGFP生成对照细胞(sgEGF,GGGCGAGGAGCTGTTCACCG)。慢病毒质粒、包膜质粒pMD2.G和包装质粒psPAX2(Addgene 12259和12260;由Didier Trono,EPFL Lausanne保存)共同转染293T细胞,产生慢病毒颗粒。转染48小时后收集细胞上清液,通过超速离心浓缩病毒颗粒,然后用于细胞感染过夜。
Plexin-B2 KO细胞的产生
对于基于质粒的CRISPR/Cas9突变,GSC的细胞悬浮液用Neon转染系统(Invitrogen)电穿孔,使用以下参数:1×106细胞/试管,10µg pX459-sgPLXNB2质粒DNA(见上文),3个脉冲,1300V,10 ms。细胞在层粘连蛋白涂层的六孔板上电穿孔后,以106每孔细胞数,24小时后更换培养基。两天后,收集细胞并以10个细胞/ml的浓度接种在超低附着96-well板(Corning 3474)中,每孔使用100µl。10天后,目视鉴定微孔中的克隆球,并将其转移至层粘连蛋白涂层的24孔板,然后通过sgPLXNB2靶点突变测序和Plexin-B2蛋白表达的western blot进行扩增和分析。无突变的克隆系PLXNB2系列在随后的实验中用作匹配对照。
对于基于慢病毒的CRISPR/Cas9突变,GSC贴壁培养物隔夜感染LentiCRISPRv2-sgPLXNB2和polybrene(8µg/ml;Sigma)在六孔培养皿(2×105每个孔的细胞数)。从感染后2天开始,用1µg/ml嘌呤霉素筛选细胞7天,并通过western blot证实Plexin-B2 KO的效率。使用LentiCRISPRv2-sgEGFP转导的GSC作为匹配对照。
慢病毒Plexin-B2 cDNA载体秒
通过定点突变(Phusion SDM试剂盒,Invitrogen)对人类Plexin-B2 cDNA(克隆号HsCD00399262,哈佛医学院DNA资源核心)进行修饰,以产生CRISPR抗性同义cDNA变体。接下来,SDM在Plexin-B2的特定域中产生如下突变:mGAP(GAP域突变:R1391A,R1392G),mRBD(RBD域突变:LSK 1558–1560−>GGA),∆VTDL(PDZ结合基序C末端氨基酸缺失),和∆Ecto(通过缺失氨基酸30–1189而缺乏胞外结构域的截断变体)。然后通过Gateway将这些构建体克隆到慢病毒载体骨架pLENTI PGK Neo-DEST(Addgene 19067;由Eric Campeau和Paul Kaufman保藏)中。如上所述,用Plexin-B2 cDNA慢病毒感染GSC,并用150µg/ml G418(Gibco)筛选转导细胞。
悬滴细胞聚集试验
对于细胞聚集分析,我们使用悬滴法,其中2×104将分离的GSC接种在神经干细胞培养基中的10µl液滴中,置于6 cm组织培养皿的倒置盖上。将盖子放回相应的6厘米培养皿中,培养皿中装满5毫升PBS,以在培养期间保持湿度。每24小时用立体显微镜拍摄一次悬挂液滴的照片。使用ImageJ测量每滴中球体的数量和大小。对每个实验中的三滴/细胞系进行量化,并进行三个独立实验。
细胞分散试验
将GSC细胞以2×10的密度接种在超低附着U形底部96-well板(Corning 7007)中三每个孔的细胞数。5天后,每个U型孔内形成单个胶质瘤球。将球体转移到涂有10µg/ml层粘连蛋白(Invitrogen)的玻璃室载玻片(Falcon 354118)中,每个室5-8个球体,并在细胞培养箱中培养2-4小时,然后用3.7%甲醛固定,然后进行DAPI(Invit罗gen)染色。用蔡司AXIO成像仪拍摄了聚焦于每个腔室底部的照片,以捕捉迁移的GSC。A2荧光显微镜。对从每个球体移出的所有细胞进行计数,确定为从主球体分离的DAPI细胞核。每个实验中最多八个球体/细胞系的细胞被量化,实验在三个独立的重复中进行。
划痕试验
细胞以1×10的密度接种在6孔板中6每个孔的细胞数。培养一天后,用200µl大小的微移液管尖端划破培养皿中心(t吨 = 0 h),闭合速度之后是相同区域的显微照片t吨 = 划伤后24小时和48小时。
Durotaxis条纹分析
将聚乙二醇二丙烯酸酯(Laysan Bio,3.4 kDa)以10%w/v与光致敏剂LAP(16 mM;Tocris)和纤维连接蛋白(100μg/ml;康宁)。将前体溶液通过0.22μm注射器过滤器。然后用移液管将无菌溶液移到0.5 mm厚的模具中,并暴露于准直紫外线(365 nm,10 mW/cm2)30秒。将条纹光掩模置于顶部,并将凝胶暴露于第二轮紫外线下一分钟。使用活检冲头将水凝胶切割成圆形,然后将水凝胶放入孔板中进行细胞接种。将SD2对照细胞和PB2-KO细胞稀疏接种在凝胶上,然后在NeuroCult增殖培养基(Stemcell Technologies)中培养10天。
三维纤维蛋白凝胶和三维血管系统中的GSC培养
SD2 GSC用表达mCherry慢病毒(pLV-mCherry;Addgene质粒36084)标记,然后在3D纤维蛋白凝胶(10 mg/ml纤维蛋白原+3 U/ml凝血酶;Sigma-Aldrich),培养27天后拍摄图像。首次将表达EGFP的原代人脑微血管内皮细胞(bEC;Cell Systems)培养在带有内皮细胞生长介质2(EGM2;Promocell)的层粘连蛋白涂层组织培养瓶上。对于bEC球状体的形成,bEC在悬滴条件下与0.0625%甲基纤维素(Sigma)在培养基中培养。每一个含有1000个内皮细胞的悬液培养24-36小时。人星形胶质细胞和脑血管周细胞用星形胶质细胞培养基和周细胞培养基(来自Sciencell的细胞和培养基)培养。为了创造一个3D脑微环境来检测GSC侵袭,将三种细胞类型(星形胶质细胞、周细胞和bEC球体)嵌入纤维蛋白基质中(10 mg/ml纤维蛋白原+3 U/ml凝血酶;Sigma-Aldrich)以及稀疏分布的GSC。星形胶质细胞和周细胞的细胞接种密度为300万个/ml,bEC为600万个/ml,GSC为25000个/ml。具有四种细胞类型的3D构建物在EGM2培养基中培养14天,然后使用荧光显微镜(Nikon Eclipse Ti2)成像。
GSC的RNA-seq
从对照组或Plexin-B2 KO GSC(SD1–SD4)中收集RNA,培养在带有RNeasy(QIAGEN)的层粘连蛋白涂层培养皿上,并使用NEB下一代超定向RNA文库制备试剂盒(NEB E7420)制备Illumina下一代测序文库。测序是在Macrogen公司和纽约基因组中心的HiSeq2000和HiSeq2500机器上进行的。使用fastQC评估测序读取的质量63使用ContextMap版本2.7.9对照人类基因组(hg19)和人类rRNA序列绘制读数64(使用BWA65作为短读取对准器和默认参数)。每个基因的阅读片段数量是通过使用featureCounts(链特异性的是链文库,非链特异性除外)从映射的RNA-seq读取中确定的66对于SD2和SD3,准备独立的三重文库进行测序。对于SD1和SD4,从三个野生型和PB2-KO基因型克隆系为每个克隆系制备文库。
基因表达变化的路径分析
使用DESeq2进行差异基因表达分析67对于每个细胞系,在FDR<20%时调用DEGs。去除细胞系间不一致的二甘醇后,每个细胞系中识别的所有二甘醇的结合被编译为最终的1289个二甘醇集合(448个下调,841个上调),并使用基因本体(GO)进行功能注释68,分子特征数据库(MSigDB)69,70和WikiPathways71数据于2018年3月获得。
为了分析与TCGA GBM数据相关的基因,从Broad GDAC Firehose下载了3级TCGA GBM-RNA-seqV2(标准化)和Affymetrix mRNA数据。对于这两个数据集,非原发性肿瘤均被切除。对于RNA-seq和Affymetrix数据集中存在的样本,仅使用RNA-seq数据。RNA-seq数据经过log2(x+1)转换,分位数正常化,并根据年龄、性别和批次进行校正。Affymetrix微阵列数据进行了分位数标准化,并根据年龄、性别和批次进行了校正。对于这两个数据集,通过层次聚类检测出离群值样本并将其删除,最终得到的数据集为n个 = 150(RNA-seq)和n个 = 378(Affymetrix)和低方差基因被删除。使用MyGene.info R包更新所有基因符号72。如果多个基因ID映射到单个基因符号,则只保留最高方差条目。在每个数据集中PLXNB2系列计算与所有其他基因的相关性,并调整与Benjamini–Hochberg的相关性P(P)值<0.10称为显著。十字路口PLXNB2系列-RNA-seq和Affymetrix数据集中的相关基因被称为共识PLXNB2系列-相关基因并用于GO功能注释68,MSigDB69,70和WikiPathway数据集71数据于2018年3月获得。所有分析均在R统计计算环境中进行。
对所有表达基因进行基因集富集分析(GSEA),根据其差异表达(Plexin-B2 KO与对照)进行排序,并与h.all标志基因集、c2.all策展基因集和与基质基因集相关的基因集矩阵进行比较(http://software.broadinstitute.org/gsea/index.jsp; 2018年4月访问69).
Rap1/2 GTP负载分析
为了测量GSC中活性Rap1和Rap2的GTP负荷,将分离的细胞接种(2×105每个孔的细胞)。细胞在培养箱内的水平摇床上48小时后形成聚集体。在37°C下用100µM forskolin(Cayman Chemical)对骨料进行30分钟的裂解前刺激。对于每种情况,基于Rap1/2 GTP与RalGDS的Rap-GTP结合域的下拉,使用活性Rap1检测试剂盒(细胞信号技术#8818)收集来自12个孔的细胞聚集物进行蛋白质裂解。用抗Rap1(宿主:兔子;CST#8825)和抗Rap2(宿主:小鼠;BD Biosciences#610215)检测Western blot膜上的Rap蛋白。
CellMask和Hoechst染色显示的时间跨度活细胞成像
SD2和SD3 GSC孵育10min,用绿色荧光染料CellMask标记细胞质膜(Thermo Fisher)和Hoechst 33342(1:10000;BD Pharmingen)在四室玻璃底皿(Cellvis)中进行核标记,该底皿涂有层粘连蛋白,并使用Leica DMi8成像,用于对90分钟。每3分钟采集一次帧。使用ImageJ分析视频帧,并使用Filmora9(Wondershare)生成合成视频。
pMLC2、SPY-actin和YAP信号分析
用ImageJ校正的全细胞荧光定量(CTCF)方法测量相对pMLC2 IF强度。在显微照片上手动选择细胞,并计算每个细胞的pMLC2 CTCF(pMLC2免疫信号积分密度)−(细胞面积×平均荧光背景读数)。对活体F-actin成像的SPY-actin信号也采用了类似的程序。为此,我们用SPY-actin 555对细胞染色一小时(细胞骨架),然后更换培养基,用共聚焦蔡司LSM 780倒置显微镜对细胞成像。
为了分析YAP定位,将细胞以大约50%的密度接种到层粘连蛋白涂层的8孔室载玻片(Falcon)中,24小时后用3.7%的甲醛在PBS中固定。细胞用IF染色以检测YAP/TAZ(见“初级抗体”一节)。YAP信号的定量是通过手动将显微照片图像的选定区域中的细胞分别评分为核信号>细胞质(N>C)、N<C或N=C来进行的。
统计和再现性
使用Graphpad Prism v8.0软件进行统计分析。对两组患者进行实验分析t吨采用单因素方差分析(ANOVA)对多组进行检验和分析,然后进行Dunnett的多重比较检验。样本大小在图图例中指定。误差条显示平均值的标准误差。
没有对任何数据或受试者使用特定的纳入和排除标准。没有使用任何方法来确定数据是否符合统计方法的假设。对于所有分析*P(P) < 0.05; **P(P) < 0.01; ***P(P) < 0.001; ns,不显著。