GRIM19通过调节炎症性白脂肪褐变和促进Th17/Treg平衡防止肥胖
，1,† ，1,† ，2 ，1 ，三 ，4 ，1 ，1 ，1 ，5 ，5 ，6 ，4,7 ，1,8和1,8,*
7韩国天主教大学医学院首尔圣玛丽医院内科，韩国首尔137-040
8韩国首尔天主教大学医学院首尔圣玛丽医院内科风湿病科，首尔137-040
†这些作者为这项工作做出了同等贡献。
2020年10月15日收到；2021年1月14日验收。
摘要
肥胖是一种以身体脂肪过度堆积为特征的疾病，是一种与慢性炎症风险增加相关的代谢紊乱。肥胖由信号转导子和转录激活子（STAT）3介导，STAT由与维甲酸-干扰素诱导死亡率（GRIM）19相关的基因调节，GRIM是一种在各种人体组织中普遍表达的蛋白质。在本研究中，我们通过静脉或肌肉注射编码GRIM19的质粒，研究了GRIM19在饮食诱导肥胖C57BL/6小鼠中的作用。使用酶联免疫分析、实时聚合酶链反应、Western blotting、流式细胞术和组织学分析比较野生型和GRIM19过度表达小鼠的脾细胞。GRIM19通过调节STAT3活性和增强棕色脂肪组织（BAT）分化来减轻肥胖的进展。GRIM19调节小鼠源性3T3-L1前脂肪细胞向脂肪细胞的分化，同时调节白色脂肪组织（WAT）和BAT中的基因表达。GRIM19过度表达可减少饮食诱导的肥胖，并增强肝脏中的糖和脂代谢。此外，GRIM19过度表达降低了肥胖小鼠WAT分化和诱导BAT分化。GRIM19转基因小鼠表现出线粒体超氧化物水平降低，Th17和Treg细胞之间相互平衡。这些结果表明，GRIM19通过控制脂肪细胞分化来减轻肥胖的进展。
关键词：肥胖、GRIM19、STAT3、Th17
1.简介
肥胖是一种复杂的代谢性疾病，与多种病因有关，包括营养、药物和遗传因素[1]. 肥胖是一个公共卫生问题，它导致了心血管疾病、糖尿病和高血压等代谢紊乱的广泛发生[2，三，4]. 与健康对照组相比，肥胖患者的血液胆固醇、葡萄糖和甘油三酯水平显著升高，这与多种疾病有关[5，6]. 肥胖预防和治疗对于减少这些疾病的发生率至关重要。肥胖介导线粒体功能障碍并破坏各种代谢特征。基因可能与维甲酸-干扰素诱导死亡率（GRIM）19有关，GRIM是一种16-kDa蛋白，主要被认为是与凋亡相关的核蛋白[7]. GRIM19活性与线粒体呼吸有关。GRIM19缺陷与线粒体呼吸链活性恶化有关[8，9]。
过度脂肪生成与肥胖进展相关，抑制白色脂肪细胞分化对防止肥胖进展至关重要。抑制3T3-L1细胞的分化可减少脂肪组织的积累并降低体外代谢参数[10，11]. 在3T3-L1细胞中，信号转导子和转录激活子（STAT）3通过诱导脂肪细胞分化在脂肪生成中起关键作用[12，13]. 肥胖的特征是炎症反应增强和致病性T细胞分化，如T辅助细胞（Th）17[14]. T细胞中STAT3的缺失降低了肥胖小鼠模型中Th17和调节性T（Treg）细胞的数量[15]. 此外，T细胞中STAT3缺乏可能在改善过度炎症、糖耐量和胰岛素敏感性方面提供治疗效果[15]. 值得注意的是，STAT5缺乏会促进肥胖并维持脂质稳态[16]. 此外，白脂肪组织（WAT）中STAT5的缺失改善了葡萄糖代谢参数[16]. 因此，STAT3和STAT5的相互调节对WAT代谢很重要。
然而，GRIM19对STAT3活性具有抑制作用并可能抑制其激活[17]. GRIM19在mRNA水平上降低了各种STAT3应答基因的激活；此外，GRIM19的缺失促进了STAT3应答基因的表达[18]. 最近的出版物也表明GRIM19在Th17/Treg细胞中诱导了相互平衡[19]。
在这里，我们假设GRIM19通过抑制脂肪生成来减轻肥胖。本研究探讨GRIM19是否可以改善肥胖的进展。我们研究了GRIM19在体内外脂肪生成中的作用。我们还检测了GRIM19在高脂饮食（HFD）诱导的肥胖小鼠模型中的体内治疗活性。最后，我们在我们的肥胖小鼠模型中检测了GRIM19对Th17/Treg平衡的影响，Th17/Teg平衡由STAT3通路调节。
2.材料和方法
2.1. 道德声明
韩国天主教大学动物护理委员会批准了实验方案（许可证编号：CUMC-2014-0017-01）。所有动物处理程序和协议均遵循韩国天主教大学动物研究伦理委员会和美国国立卫生研究院指南。
2.2. 动物
四周龄C57BL/6小鼠（Orient Bio，Seongnam，韩国；n个=10只小鼠）维持在特定的无病原体条件下，并喂食由标准实验室小鼠食物（美国密苏里州圣路易斯市Ralston Purina）组成的饮食，该食物含有60千卡脂肪衍生的热量和水随意所有手术均在异氟醚麻醉下进行，并尽一切可能减少痛苦。
2.3. 转基因（Tg）DNA样品的制备及Tg小鼠的产生
为了生成GRIM19-Tg小鼠，GenScript Corporation（美国新泽西州皮斯卡塔韦）合成了一个GRIM19片段（基于小鼠的开放阅读框），并对其密码子进行了优化，以便在哺乳动物细胞中表达。将该片段插入含有巨细胞病毒启动子的pcDNA3.1+载体（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）。插入点位于后面的III和Xho公司I限制性位点位于巨细胞病毒启动子上游。在细菌表达系中获得足够数量的DNA后，通过凝胶萃取去除约3.8 kb的主干片段，并使用约2.0 kb的片段进行微量注射。在C57BL/6背景下产生过表达GRIM19的Tg小鼠，并由Macrogen Inc.（韩国首尔）通过使用微操作器将4 ng/µL转基因DNA直接微量注射到受精卵的雄性原核中来维持。微注射胚胎在37°C下孵育1–2小时。然后，将14–16个注射的单细胞胚胎通过手术移植到假妊娠受体小鼠的输卵管中。F0代出生后，对尾部切割样本进行基因分型，以确定是否存在转基因，并使用聚合酶链反应（PCR）分析进行确认。基因组DNA确认的GRIM19-Tg创始小鼠随后与C57BL/6小鼠交配。
2.4. GRIM19载体处理
C57BL/6小鼠接受100µg GRIM19-过表达载体或模拟载体的流体动力注射。每隔2周通过电穿孔将100µg的载体肌肉注射到大腿区域[20]. 使用31-G胰岛素注射器进行肌肉注射。
2.5. RNA干扰
为了抑制GRIM19的表达，使用X-tremeGENE HP转染试剂（德国曼海姆罗氏）对GRIM19（sc-60766，Santa Cruz Biotechnology，Dallas，TX，USA）或打乱siRNA（sc-37007，Santa Cruz Bietechnologies）特异的小干扰RNA（siRNA）进行核孔。根据制造商的建议转染siRNA（50 nM）（序列）或干扰siRNA。转染后，3T3L-1细胞在37°C下培养3天，并用分化培养基刺激。
2.6. 免疫印迹法
使用RIPA裂解和提取缓冲液（89901，Thermo Fisher，Waltham，MA，USA）（包括Halt）对细胞进行裂解TM公司蛋白酶抑制剂鸡尾酒（78410，Thermo Fisher）和蛋白质浓度采用Bradford方法（美国宾夕法尼亚州唐宁镇分子器件公司）测定。使用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质样品，并转移至Hybond膜（Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ，USA）。蛋白质与抗GRIM19（ab110240，Abcam，Cambridge，MA，USA）、磷酸化-STAT3（Tyr705；9145，Cell Signaling，Danvers，MA）、磷酸酯化-STAT3（Ser727；9134，Cell Signaling）、STAT3（Cell 9139，Signaling）和β-肌动蛋白（sc-47778，Santa Cruz Biotechnology）的抗体孵育。然后使用增强化学发光检测试剂盒（美国伊利诺伊州罗克福德市皮尔斯）和HyperFilm（比利时莫特塞尔市Agfa）对其进行检测，并将β-actin用作负荷控制。
2.7. 实时PCR的基因表达分析
使用4.0版软件在LightCycler 2.0系统（Roche Diagnostics，Mannheim，Germany）上进行PCR扩增和分析。根据制造商的说明，使用LightCycler Fast Start DNA母版SYBR green I（日本志贺县高原市）进行所有反应。使用了以下引物：CCAAT/增强子结合蛋白α（正向：CAAGAACAGCAACAGTACCG，反向：GTCACTGGTCAACTCACAGCAC）；血管紧张素原（正面：AACACCAGATCCAGTTCAA，反面：GGTTCAGTAGGCACTTCCTC）；脂联素（正面：GTCAGTGGATCTGGACGACACAA，反面：ATGCCTGCCATCCAACCTG）；抵抗素（正面：AAGAACCTTTCTCATTCCCTCCT，反面：GTCCAGCAATTAAGCCATGTT）；脂肪细胞蛋白2（正面：GATGCCTTGTGGGACCT，反面：CTGTCGTCTGCGGTGATTT）；泛酸激酶3（前：TGCTGTAGTGTCCCATTCTGCCT，后：AGCTGGAACAGCACACCTAGAA）；PRDM16项目（正面：GACATTCCAATCCACC，反面：CACCTCGTATCCGTCAGCA）；成纤维细胞生长因子21（正面：CCTCTAGGTTTTTTGCCAACAG，反面：AAGCTGCAGGCCTCAGGAT）；细胞色素C氧化酶多肽7A1（Cox7a1）（正面：AGAAACCGTGTGGCAGAGA，反面：CAGCGTCATGGTCAGTGTT）；脂蛋白脂肪酶（正面：GGAAGAGATTTCTCAGACATCG，反面：CTACAATGACATTGGAGTCAGG）；瘦素（正面：CCTCATCAAGACACATTGCACC，反面：TCTCCAGGTCATTGGCTATCG）；细胞死亡诱导DNA断裂因子α样效应物A（正面：GCCGTGTTAAGGAATCTGCTGG，反面：TGCTCTTCTGTATCGCCAGT）；脂肪酸伸长酶3（正面：CGGGTTAAAAAATGGACCTGA，反面：CCAACACACGAGCACAG）；过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活物1-α（PGC1a）（正面：GTCAACAGACAAAAGCCACAA，反面：TCTGGGGTCAGAGAGAGAGA）；解偶联蛋白1（UCP1）（前：CTTTGCCTCACTCACGATGG，后：ACTGCCACCTCCAGTCATT）；细胞色素C1（正面：GCTACCAATGGTCTCATCGT，反面：CATCATCATTAGGGCCATCC）；和第53页（前：CACGTACTCCTCCCCTCA，后：CTCCGTCATGTGCTGTGACT）。
2.8. 流式细胞术
通过以下抗体的细胞内染色来评估小鼠的细胞因子表达：异硫氰酸荧光素结合抗白细胞介素17（Ebio17b7；eBioscience，加利福尼亚州圣地亚哥，美国）、藻红蛋白结合抗Foxp3（FJK-16s；Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州沃尔瑟姆）、PerCP-Cyanine 5.5结合抗CD4（RM4-5；Thermo Fisher Scientific）和别藻蓝蛋白偶联抗CD25（PC61；BioLegend，加利福尼亚州圣地亚哥，美国）。用佛波酯和离子霉素刺激细胞4小时，然后添加GolgiStop（BD Biosciences，San Diego，CA，USA）。培养细胞表面标记30分钟，并用Cytofix/Cytoperm溶液（BD Biosciences）渗透。在用荧光激活细胞分选流式细胞术（即FACSCalibur）进行分析之前，用荧光抗体对细胞进行细胞内染色。为了测量线粒体活性氧物种，细胞在37°C下用MitoSOX红染色15分钟，并用磷酸盐缓冲盐水清洗，然后使用荧光激活细胞分选进行分析。使用FlowJo软件（Tree Star，阿什兰，俄勒冈州，美国）收集和分析数据。接受活细胞成像的细胞在培养条件下保持，并用MitoSOX染色。活细胞成像使用基于荧光的活细胞成像系统（LSM 510 Meta；卡尔蔡司，德国Oberkochen）和适当的过滤器和激光器进行。
2.9. 共焦显微镜
为了进行免疫染色，使用藻红蛋白结合的抗CD4抗体（GK1.5；BioLegend）、荧光素异硫氰酸盐结合的抗-CD4抗体（RM4-5；BD Biosciences）、藻红蛋白联合的抗白细胞介素17抗体（Ebio17B7；eBioscision）、别藻蓝蛋白结合的CD25抗体（PC61；BioRegend）对脾脏的7µm组织切片进行染色，藻红蛋白缀合的抗Foxp3（FJ-16s；赛默飞世尔科学公司）、藻红蛋白缀合的抗pSTAT3（Tyr705，4/P-STAT3；BD Biosciences）、藻红蛋白缀合的抗pSTAT3（Tyr727，49/P-STAT3；BD Biosciences）和别藻蓝蛋白缀合的抗pSTAT5（SRBCZX；赛默飞世尔科学公司）。使用蔡司显微镜（LSM 510 Meta；Carl Zeiss）在400倍放大率下检查染色切片。
2.10. 葡萄糖和胰岛素耐受性试验
将小鼠禁食过夜，并腹膜内注射葡萄糖（1g/kg体重）。使用Accu-Chek Performa仪器（瑞士巴塞尔罗氏公司）测量血糖水平，该仪器在注射葡萄糖前以及注射葡萄糖后30、60、90和120分钟从切尾尖采集全血（美国密苏里州圣路易斯Sigma-Aldrich）。通过腹腔注射胰岛素（1 U/kg体重；美国印第安纳州印第安纳波利斯的礼来公司）对未进食的小鼠进行胰岛素耐受性试验。使用Accu-Chek Performa仪器测量胰岛素注射前和注射后30、60、90和120分钟的血糖水平。
2.11. 生化分析用血清样品的制备
在14周时从治疗组和对照组小鼠的血清管中收集血样，并在使用前储存在−70°C的温度下。使用商业试剂盒（日本大阪Wako公司）测量血清总胆固醇水平。使用Asan Pharmaceutical Co.（韩国华盛）的商业试剂盒测量天冬氨酸转氨酶、丙氨酸转氨酶，葡萄糖，游离脂肪酸，甘油三酯，高密度脂蛋白胆固醇和低密度脂蛋白-胆固醇水平。使用日立7600分析仪（日立，日本东京）测量血清水平。为了研究禁食对小鼠血糖水平的影响，从小鼠尾部采集血液样本。然后使用Accu-Chek仪器（罗氏）测量血糖水平。从实验小鼠中随机测量血糖。
2.12。饮食和温度研究
服用HFD随意从断奶到指示。冷暴露包括在单个房屋内的动物在4°C下喂养HFD 1天，然后分离出单个脂肪组织。
2.13. 细胞培养和诱导分化
3T3-L1和C2C12细胞从韩国细胞系库购买，并保存在含有10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基中，培养箱中含有5%CO237°C时。小鼠3T3-L1前脂肪细胞在前脂肪细胞培养基（PM-1-L1，ZenBio，Durham，NC，USA，24孔板，1.2×104细胞/孔），并允许达到100%的汇合。然后，在开始分化之前，将细胞再培养48小时。随后，将细胞在适当体积的3T3-L1细胞分化培养基（DM2-L1，ZenBio）中培养3天，然后用3T3-LI脂肪细胞维持培养基（AM-1-L1，ZenBio。对于C2C12细胞，将T3和胰岛素分别以1和20 nM的浓度添加到培养基中，直到细胞达到75–80%的融合。接下来，将3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（500μM）、地塞米松（2 mM）和吲哚美辛（125μM）加入培养基过夜以诱导分化。细胞在含有T3和胰岛素的生长培养基中培养，每隔48小时更换培养基。
2.14. DNA转染
按照制造商的说明，使用X-treme GENE HP转染试剂（Roche）将GRIM19过表达载体或模拟载体转染到3T3-L1和C2C12细胞中。
2.15. 脂肪和肝组织的免疫组织化学染色
脂肪和肝组织在10%福尔马林中固定24小时，包埋在石蜡中，并切割成5µm的切片。脱蜡切片和脱水切片用油红O、苏木精和伊红染色。
2.16. 细胞内甘油三酯含量的测量
在1 M NaCl中均质肝组织，并以2:1的比例提取两次(v（v）/v（v）)氯仿/甲醇溶液。用5%Triton X-100提取肝脏脂质。离心上清液后，将其转移到干净的试管中，并在−80°C下保存，直至使用。根据制造商的说明，使用EnzyChrom™甘油三酯检测试剂盒（Bioassay Systems，Hayward，CA，USA）测量甘油三酸酯水平。数据以µg脂质/mg细胞蛋白表示[21]。
2.17. 统计分析
所有数据均表示为平均值±标准偏差（SD）。实验值表示为三份培养物的平均值±标准偏差，是三次实验的代表。通过Mann–Whitney U检验或方差分析，然后使用GraphPad Prism进行Bonferroni事后检验（5.01版；美国加利福尼亚州拉霍亚市GraphPad-Software），确定统计显著性。的值第页<0.05表示有统计学意义。
3.结果
3.1. GRIM19过表达降低3T3-L1细胞白脂肪基因表达并诱导WAT褐变
由于WAT转化为棕色脂肪组织（BAT）是肥胖治疗的关键因素[22]，我们研究了GRIM19在脂肪细胞分化以及WAT和BAT相关基因表达中的作用。在本研究中，用编码GRIM19的质粒转染3T3-L1细胞。GRIM19的过度表达导致体外3T3-L1细胞的分化增强，如A.此外，GRIM19下调了WAT相关基因的mRNA水平，包括CCAAT/增强子结合蛋白α，血管紧张素原，脂联素，抵抗素，脂肪细胞蛋白2、和泛酸激酶3，如所示B、 而它促进BAT相关基因的mRNA表达水平，如PRDM16项目，成纤维细胞生长因子21、和考克斯7a1，如所示C.此外脂蛋白脂肪酶和瘦素GRIM19过度表达的细胞中减少，GRIM19缺失的细胞中升高，如D.这些数据表明GRIM19是WAT褐变的关键因素。
与维甲酸-干扰素诱导死亡率19相关的基因（GRIM19）调节与白色脂肪组织（WAT）和棕色脂肪组织（BAT）相关的基因转录水平。比例尺，100µm。(一个)油红O染色3T3-L1细胞的代表性图像。用油红O染色Mock和GRIM19过度表达的3T3-L1细胞(B类，C类)WAT相关基因的转录水平(B类)和BAT(C类)表达对照质粒（MOCK）和编码GRIM19的质粒（GRIM19）的3T3-L1细胞。(D类)成绩单等级瘦素和脂蛋白脂肪酶(低密度脂蛋白)在表达对照质粒（MOCK）的3T3-L1细胞中，编码GRIM19（GRIM19）或GRIM19缺失siRNA（siGrim19。(E类)网格19用实时聚合酶链反应测定mRNA水平。GAPDH被用作内部控制。数据表示为三个独立实验的平均值±标准偏差（SD）*第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页<0.001，且ns=不显著。
3.2. GRIM19调节BAT差异化
为了研究GRIM19对BAT分化的影响，用编码GRIM19或靶向GRIM19的siRNA质粒转染C2C12细胞。如A.BAT相关基因的转录水平在过度表达GRIM19的C2C12细胞中增加，而BAT相关的基因转录水平在GRIM19缺失的C2C11细胞中下调，如B、 C.此外，GRIM19的过度表达导致第53页和PRDM16项目，如所示D.这些数据表明，GRIM19通过以下途径调节棕色脂肪分化第53页和PRDM16项目.
GRIM19调节BAT分化。(一个)油红O染色C2C12细胞的代表性图像。用100µm的油红O比例尺对模型、GRIM19过度表达的对照siRNA（siRNA Con）或GRIM19 siRNA C2C12细胞进行染色。条形图显示了油红O-染色区域的平均百分比。(B类)成绩单等级细胞死亡诱导DNA断裂因子α样效应物A(西迪亚),细胞色素C氧化酶多肽7A1（Cox7a1），脂肪酸伸长酶3(埃洛夫l3),前列腺素C1a、和UCP1（UCP1）模拟载体（mock）和GRIM19过度表达C2C12细胞。(C类)成绩单等级西迪亚，考克斯7a1，埃洛夫l3，前列腺素C1a、和UCP1（UCP1）在对照组和GRIM19缺失的C2C12细胞中。(D类)p53和p53的转录水平PRDM16项目模拟载体和GRIM19-过度表达C2C12细胞。GAPDH被用作内部控制。数据表示为三个独立实验的平均值±标准偏差*第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页<0.001，ns=不显著。
3.3. GRIM19过度表达抑制HFD诱导肥胖的进展
为了确定GRIM19在肥胖发展中的作用，我们给模拟向量和GRIM19过度表达的小鼠喂食HFD以诱导肥胖。将控制质粒和编码GRIM19的质粒注射到喂食HFD的C57BL/6小鼠体内。喂食HFD的模拟病毒小鼠体重逐渐增加。相反，喂食HFD的小鼠过度表达GRIM19（GRIM19 HFD）比模拟HFD小鼠体重增加更少，如A.此外，GRIM19 HFD小鼠在葡萄糖耐量和胰岛素耐量测试期间，血清中的葡萄糖水平显著降低，如图所示B、 然而，与模拟HFD小鼠相比，GRIM19 HFD小鼠的血清天冬氨酸转氨酶和丙氨酸转氨酶水平下调，如C.我们发现，与野生型（WT）小鼠相比，GRIM19-Tg小鼠脾细胞中GRIM19的表达水平升高，如D.HFD喂养的GRIM19Tg（GRIM19Tg-HFD）小鼠表现出与GRIM19HFD小鼠相似的表型。GRIM19-Tg HFD小鼠体重增加较少，如E、 与喂食HFD的WT（WT HFD）小鼠相比，其肥胖代谢指标（如血糖、天冬氨酸转氨酶和丙氨酸转氨酶）水平较低，如F、。
通过两种不同的策略过度表达GRIM19导致高脂饮食（HFD）诱导的肥胖减轻。(一个)在三个独立实验中，喂食HFD的对照组和喂食GRIM19的小鼠的体重变化动力学（左）和体重增加率（右）。(B类)喂食HFD的对照组和喂食GRIM19的小鼠的葡萄糖耐量试验（GTT，左）和胰岛素耐量测试（ITT，右）结果(n个= 5). (C类)在喂食HFD的对照组和喂食GRIM19的小鼠中，测量血清天冬氨酸转氨酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白（LDL）胆固醇和游离脂肪酸水平(n个= 5). (D类)脾细胞取自野生型（WT）和GRIM19-Tg小鼠。制备细胞以检测GRIM19的表达。条形图显示相对强度。(E类)喂食HFD的对照组和GRIM19-Tg小鼠体重变化的动力学。条形图显示了喂食HFD的WT和GRIM19-Tg小鼠在10周时的平均体重(n个= 5–7). (F类)喂食HFD的对照小鼠和GRIM19-Tg小鼠血清中葡萄糖、AST和ALT水平的测量(n个= 5–7). 数据以平均值±标准偏差表示*第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页<0.001，ns=不显著。
3.4. GRIM19过度表达改善肥胖小鼠肝功能
肝功能异常与肥胖的进展有关，因为肥胖加剧了脂肪肝的发展[23]. GRIM19通过调节脂肪酸生物合成相关基因的表达改善细胞内脂质积累[24]. 我们使用WT HFD和GRIM19-Tg HFD小鼠的血清进行了肝功能实验。与WT HFD小鼠相比，GRIM19 Tg HFD小鼠的免疫细胞向肝脏的浸润和脂肪肝的诱导减弱。此外，与WT HFD小鼠的肝脏相比，GRIM19-Tg HFD小鼠肝脏中肝甘油三酯的生成减少，如A.电子显微镜显示GRIM19-Tg HFD小鼠肝脏中的脂滴较小，如B.组织学分析显示，与WT小鼠相比，GRIM19-Tg HFD小鼠附睾脂肪中的脂肪细胞较小，如C.与WT HFD小鼠相比，GRIM19-Tg HFD小鼠的附睾脂肪重量减轻，如D.此外，GRIM19-Tg HFD小鼠棕色脂肪中的脂质小泡较小。与WT HFD小鼠相比，GRIM19-Tg HFD小鼠BAT相关基因的表达水平升高，例如UCP1（UCP1），克里斯塔，前列腺素C1a、和考克斯7a1，如所示E.公司。
GRIM19可预防饮食诱导的肥胖和肝脂肪变性，并调节脂肪分布。(一个)HFD喂养的WT和GRIM19Tg小鼠的肝组织的代表性苏木精和伊红（H&E）和油红O染色图像。条形图显示了肝脏甘油三酯的平均水平。比例尺，200µm。(B类)喂食HFD的WT和GRIM19小鼠肝组织的典型电子显微镜图像。比例尺，2µm。(C类)喂食HFD的WT和GRIM19-Tg小鼠（×200）附睾脂肪垫的典型H&E染色图像。(D类)正常脂肪饮食（NFD）喂养的WT小鼠和HFD喂养的GRIM19-Tg小鼠附睾脂肪的代表性图像。条形图显示了喂食HFD的WT和GRIM19-Tg小鼠的平均附睾脂肪重量。(E类)HFD喂养的WT和GRIM19-Tg小鼠肩胛间棕色脂肪的代表性电子显微镜图像。比例尺，2µm。条形图显示了UCP1（UCP1），西迪亚，前列腺素C1a、和考克斯7a1转录水平标准化为GAPDH的转录水平。数据以平均值±标准偏差表示*第页<0.05和**第页< 0.01.
3.5. GRIM19对肥胖小鼠Th17和Treg相互平衡的调节
与WT小鼠相比，GRIM19-Tg小鼠脾组织中白细胞介素-17和pSTAT3的表达水平受到抑制。然而，与WT小鼠相比，GRIM19-Tg小鼠脾脏组织中的Treg细胞数量和pSTAT5表达水平显著升高，如A.GRIM19-Tg小鼠中pSTAT3（Tyr705）和pSTAT3（Ser727）的表达水平略有降低，如B。
GRIM19对肥胖小鼠Th17/Treg细胞调节的影响。(一个)显示CD4频率的典型流式细胞仪图+pSTAT3（Tyr705）+和CD4+pSTAT3（727系列）+HFD喂养的WT和GRIM19-Tg小鼠脾脏中的细胞。条形图显示了每种细胞类型的频率。(B类)CD4的典型共焦显微镜图像+白介素-17+细胞和CD4+CD25型+Foxp3系列+以及CD4+pSTAT3（Tyr705）+，CD4+pSTAT3（727系列）+和CD4+pSTAT5型+HFD喂养的WT和GRIM19-Tg小鼠脾脏中的细胞。条形图在四个独立的象限中显示每种细胞类型的数量。数据表示为三个独立实验的平均值±标准偏差。比例尺，20µm*第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页< 0.001.
3.6. GRIM19过度表达导致肥胖的热原效应
我们检测了肥胖小鼠肩胛间棕色和白色脂肪垫的比例。与WT HFD小鼠相比，GRIM19-Tg HFD小鼠肩胛间棕色脂肪垫较多，但肩胛间白脂肪垫较少，如A.我们还测量了暴露于4°C 16 h的肥胖小鼠附睾脂肪中BAT相关基因的表达水平。与WT HFD小鼠相比，GRIM19-Tg HFD小鼠附睾炎中BAT有关基因的转录水平显著升高，如B。
GRIM19-介导GRIM19-Tg和WT小鼠的抗脂肪生成和产热作用。(一个)HFD喂养的WT和GRIM19-Tg小鼠肩胛间白色脂肪和肩胛间棕色脂肪的代表性图像（顶部）。柱状图显示肩胛间脂肪垫中肩胛白脂肪和肩胛棕色脂肪的平均重量，以及肩胛间白脂肪重量与肩胛之间棕色脂肪重量的比率（底部）。(B类)成绩单等级UCP1（UCP1），埃洛夫l3，前列腺素C1a，考克斯7a1，细胞色素C1，成纤维细胞生长因子（FGF）21、和PRDM16项目在HFD喂养的WT和GRIM19-Tg小鼠的附睾脂肪垫中。转录水平标准化为GAPDH的转录水平。实验前，将小鼠置于4°C的环境中1天。数据表示为三个独立实验的平均值±标准偏差*第页<0.05和**第页< 0.01.
4.讨论
GRIM19的活性在细胞凋亡的背景下被广泛研究[7]，最近的研究报道了其与炎症性自身免疫疾病的关系[19]. 然而，很少有研究调查GRIM19在肥胖中的作用。在此，我们检测了GRIM19对肥胖的治疗作用。
体外观察到的BAT/WAT分化效应与体内GRIM19对体重的影响有关。WAT的失调积累可能与肥胖的发展有关，在肥胖状态下激活炎症过程[25，26]. 相比之下，各种报告都强调BAT是设计用于治疗肥胖的药物的潜在治疗靶点，从而改善代谢状况[27，28，29]. 以前的报告表明，抑制3T3-L1细胞的分化有助于显著减轻肥胖[10，11]. WAT转化为BAT在治疗肥胖中具有明显作用[22]. 我们的结果表明，GRIM19控制C2C12细胞的分化并抑制3T3-L1细胞的分化，从而调节WAT/BAT平衡的相互调节。这些发现表明，GRIM19集中治疗可能是治疗肥胖的一种新的治疗策略。
肥胖会导致慢性严重炎症。肥胖患者的脂肪细胞通过调节脂肪细胞因子的释放导致代谢综合征和炎症反应[30]. 此外，Th17细胞分化和炎症过程在肥胖状态下上调[14]. STAT3转录活性是致病性Th17细胞的关键因子，控制炎症反应，而STAT5控制向Treg细胞的分化[31，32]. GRIM19减少STAT3激活并改善STAT3介导的实验性自身免疫性疾病[17，19]. 在这项研究中，GRIM19降低了Th17分化和pSTAT3表达，而它增强了Treg分化，从而在HFD喂养的肥胖小鼠中上调了pSTAT5。这些结果表明，GRIM19可以通过抑制STAT3表达和诱导STAT5表达来调节Th17/Treg的相互平衡，从而阻止肥胖的进展。
BAT的诱导可用于治疗肥胖。白色脂肪的褐变对肥胖的发展有治疗作用[22]. 棕色和米色脂肪细胞因其抵抗肥胖和2型糖尿病等代谢性疾病的能力而引起了人们对健康科学研究的兴趣。虽然一些代谢紊乱和肥胖通常与2型糖尿病有关，但BAT可抑制2型糖尿病的特征。此外，GRIM19缺陷可降低p53水平，这对饮食诱导肥胖中BAT的分化至关重要[33，34]。PRDM16项目受p53调控，在BAT的发展中起重要作用[35，36]. 有人建议脂肪酸伸长酶3对BAT的发病至关重要PGC1α，考克斯7a1，UCP1（UCP1）、和成纤维细胞生长因子21BAT中也升高[37]. 在本研究中，GRIM19促进BAT分化和基因表达第53页和PRDM16项目.的mRNA水平脂肪酸伸长酶3，PGC1α，考克斯7a1，UCP1（UCP1）、和成纤维细胞生长因子21在GRIM19-Tg小鼠中上调。因此，GRIM19可能是治疗肥胖的重要分子。
因为与肥胖有关的代谢变异会增加脂肪肝和脂肪在体内积聚的风险[38，39]脂肪肝和代谢状况是肥胖发生的关键因素。肥胖促进甘油三酯、天冬氨酸转氨酶和丙氨酸转氨酶水平的升高，同时降低高密度脂蛋白的产生[40，41，42]. 抑制低密度脂蛋白、甘油三酯和血糖也能改善肥胖介导的代谢紊乱[43，44]. 我们的研究表明，各种代谢状况，包括甘油三酯、天冬氨酸转氨酶、血糖、低密度脂蛋白胆固醇和肝脏脂肪堆积水平都有所降低，而克里斯塔与WT小鼠相比，GRIM19-Tg小鼠上调。这些结果表明，GRIM19可以通过减轻肥胖诱导的脂肪肝和代谢功能障碍来阻止肥胖的发展。GRIM19通过调节BAT分化和Th17/Treg平衡抑制肥胖进展。由于GRIM19减少STAT3激活和炎症，WAT转化为BAT可能参与促进p53和减轻线粒体功能障碍。需要进行体外和体内研究，以进一步验证STAT3抑制介导的白色脂肪褐变。我们的观察结果表明，GRIM19的治疗效果通过BAT诱导和通过pSTAT3抑制Th17细胞来改善肥胖。这项研究的结果表明，GRIM19可能是治疗肥胖的一个有希望的候选治疗方案。
作者贡献
J.J.和S.H.L.：参与研究设计和数据解释，并撰写了手稿。J.S.W.、J.-H.J.、K.J.、W.H.、S.-Y.L.、J.Y.R.、Y.J.J.和Y.M.M.：进行动物实验、获取数据并进行统计分析。M.-L.C.、K.Y.S.、K.C.、S.K.Y.和S.-H.P.：为研究设计和数据解释做出贡献。M.-L.C.：设计研究，解释数据，批判性地修改手稿中的重要知识内容。所有作者都已阅读并同意手稿的出版版本。
基金
这项工作得到了韩国政府（MSIT）资助的韩国国家研究基金会（NRF）拨款（编号：NRF-2018R1C1B6005854）的支持。本研究还得到了基础科学研究计划的支持，该计划由韩国教育部资助的国家研究基金会（NRF）资助（编号：2020R1I1A1A01072520）。最后，本研究得到了基础科学研究计划（No.2020R1I1A1A01072547）的支持，该计划由教育部资助的韩国国家研究基金会（NRF）资助。
机构审查委员会声明
本研究根据赫尔辛基宣言的指导方针进行，并经韩国天主教大学机构审查委员会批准（CUMC-2014-0017-01和2014年2月5日）。
脚注
出版商备注：MDPI在公布的地图和机构隶属关系中对管辖权主张保持中立。
工具书类
1Ahima R.S.，Flier J.S.脂肪组织作为内分泌器官。内分泌学趋势。Metab公司。2000;11:327–332. doi:10.1016/S1043-2760（00）00301-5。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 2现代科学与肥胖的耻辱。自然医学。2004;10:563–569. doi:10.1038/nm0604-563。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 三。Flegal K.M.、Carroll M.D.、Ogden C.L.、Curtin L.R.1999-2008年美国成年人肥胖流行率和趋势。JAMA公司。2010;303:235–241. doi:10.1001/jama.2009.2014。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 4Kopelman P.G.肥胖是一个医学问题。自然。2000;404:635–643. doi:10.1038/35007508。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 5Grundy S.M.肥胖、代谢综合征和心血管疾病。临床杂志。内分泌。Metab公司。2004;89:2595–2600. doi:10.1210/jc.2004-0372。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 6Need A.G.、O'Loughlin P.D.、Horowitz M.、Nordin B.E.绝经后妇女空腹血糖、年龄、体重指数和血清25-羟基维生素D之间的关系。临床。内分泌学。2005;62:738–741. doi:10.1111/j.1365-2265.2005.02288.x。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 7Angell J.E.、Lindner D.J.、Shapiro P.S.、Hofmann E.R.、Kalvakolanu D.V.使用遗传方法鉴定由干扰素-β和维甲酸组合诱导的新型细胞死亡调节基因GRIM-19。生物学杂志。化学。2000;275:33416–33426. doi:10.1074/jbc。M003929200。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 8Huang G.、Lu H.、Hao A.、Ng D.C.、Ponniah S.、Guo K.、Lufei C.、Zeng Q.、Cao X.GRIM-19是一种细胞死亡调节蛋白，对线粒体复合物I的组装和功能至关重要。摩尔细胞。生物。2004;24:8447–8456. doi:10.1128/MCB.24.19.8447-8456.2004。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 9Kalakonda S.、Nallar S.C.、Jaber S.，Keay S.K.、Rorke E.、Munivenkatappa R.、Lindner D.J.、Fiskum G.M.、Kalvakolanu D.V.肿瘤抑制因子GRIM-19的单等位缺失促进小鼠肿瘤发生。程序。国家。阿卡德。科学。美国。2013;110：E4213–4222。doi:10.1073/pnas.1303760110。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 10Ji E.、Jung M.Y.、Park J.H.、Kim S.、Seo C.R.、Park K.W.、Lee E.K.、Yeom C.H.、Lee S.透明质酸下调后对3T3-L1细胞脂肪生成的抑制和对高脂饮食喂养C57BL/6J小鼠腹部脂肪积聚的抑制。国际J.Obes。2014;38:1035–1043. doi:10.1038/ijo.2013.202。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 11Song Y.、Park H.J.、Kang S.N.、Jang S.H.、Lee S.J.、Ko Y.G.、Kim G.S.、Cho J.H.蓝莓皮提取物抑制3T3-L1细胞中的脂肪生成，并减少高脂饮食诱导的肥胖。《公共科学图书馆·综合》。2013;8：e69925.doi:10.1371/journal.pone.0069925。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 12Zhang K.，Guo W.，Yang Y.，Wu J.JAK2/STAT3通路通过调节C/EBPbeta转录参与脂肪生成的早期阶段。J.细胞。生物化学。2011;112:488–497. doi:10.1002/jcb.22936。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 13王丹、周瑜、雷伟、张凯、史杰、胡瑜、舒刚、宋杰。信号转导子和转录激活子3（STAT3）通过过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARgamma）调节脂肪细胞分化生物细胞。2010;102：1-12.doi:10.1042/BC20090070。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 14Endo Y.、Asou H.K.、Matsugae N.、Hirahara K.、Shinoda K.、Tumes D.J.、Tokuyama H.、Yokote K.、Nakayama T.肥胖通过诱导脂代谢激酶ACC1来驱动Th17细胞分化。单元格代表。2015;12:1042–1055. doi:10.1016/j.celrep.2015.07.014。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 15Priceman S.J.、Kujawski M.、Shen S.、Cherryholmes G.A.、Lee H.、Zhang C.、Kruper L.、Mortimer J.、Jove R.、Riggs A.D.等。Stat3对脂肪组织T细胞亚群的调节对于饮食诱导的肥胖和胰岛素抵抗至关重要。程序。国家。阿卡德。科学。美国。2013;110:13079–13084. doi:10.1073/pnas.1311557110。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 16Kaltenecker D.、Mueller K.M.、Benedikt P.、Feiler U.、Themanns M.、Schlederer M.、Kenner L.、Schweiger M.、Haemmerle G.、Moriggl R.脂肪细胞STAT5缺乏症会促进小鼠肥胖并损害脂质动员。糖尿病。2017;60:296–305. doi:10.1007/s00125-016-4152-8。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 17Zhang J.、Yang J.、Roy S.K.、Tininii S.、Hu J.、Bromberg J.F.、Poli V.、Stark G.R.、Kalvakolanu D.V.。细胞死亡调节因子GRIM-19是信号转导抑制剂和转录激活剂3。程序。国家。阿卡德。科学。美国。2003;100:9342–9347. doi:10.1073/pnas.1633516100。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 18Okamoto T.、Inozume T.、Mitsui H.、Kanzaki M.、Harada K.、Shibagaki N.、Shimada S.癌细胞中GRIM-19的过度表达抑制STAT3介导的信号转导和肿瘤生长。摩尔癌症治疗。2010;9:2333–2343. doi:10.1158/1535-7163.MCT-09-1147。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 19Moon Y.M.、Lee J.、Lee S.Y.、Her Y.M、Ryu J.G.、Kim E.K.、Son H.J.、Kwok S.K.、Ju J.H.、Yang C.W.等。与维甲酸-干扰素诱导的死亡率相关的基因19通过调节th17和treg细胞来减轻小鼠自身免疫性关节炎。风湿性关节炎。2014;66:569–578. doi:10.1002/art.38267。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 20Bettan M.、Emmanuel F.、Darteil R.、Caillaud J.M.、Soubrier F.、Delaere P.、Branelec D.、Mahfoudi A.、Duverger N.、Scherman D.。电脉冲介导基因转移到骨骼肌后，血液循环中的高水平蛋白质分泌。摩尔-热。2000;2:204–210. doi:10.1006/mthe.2000.0117。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 21Wang Y.X.、Lee C.H.、Tiep S.、Yu R.T.、Ham J.、Kang H.、Evans R.M.过氧化物酶体-增殖物激活受体δ激活脂肪代谢以防止肥胖。单元格。2003;113:159–170. doi:10.1016/S0092-8674（03）00269-1。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 22Qiang L.、Wang L.、Kon N.、Zhao W.、Lee S.、Zhang Y.、Rosenbaum M.、Zhoo Y.、Gu W.、Farmer S.R.等。通过Ppargamma的SirT1-依赖性脱乙酰化对白色脂肪组织进行棕色重塑。单元格。2012;150:620–632. doi:10.1016/j.cell.2012.06.027。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 23Yilmaz Y.，Younossi Z.M.肥胖相关非酒精性脂肪性肝病。临床。肝脏疾病。2014;18:19–31. doi:10.1016/j.cd.2013.09.018。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 24Kim J.H.、Sung P.S.、Lee E.B.、Hur W.、Park D.J.、Shin E.C.、Windisch M.P.、Yoon S.K.GRIM-19通过减少细胞内脂质积累限制HCV复制。前面。微生物。2017;8：576.doi:10.3389/fmicb.2017.00576。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 25Balistreri C.R.、Caruso C.、Candore G.脂肪组织和脂肪因子在肥胖相关炎症疾病中的作用。调解。燃烧。2010;2010：802078.文件名：10.1155/2010/802078。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 26Cancello R.、Tordjman J.、Poitou C.、Guilhem G.、Bouillot J.L.、Hugol D.、Coussieu C.、Basdevant A.、Bar Hen A.、Bedossa P.等。网膜脂肪组织中巨噬细胞浸润增加与人类病态肥胖症中显著的肝损伤有关。糖尿病。2006;55:1554–1561. doi:10.2337/db06-0133。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 27Fruhbeck G.、Becerril S.、Sainz N.、Garrastachu P.、Garcia-Velloso M.J.BAT：人类肥胖的新目标？趋势药理学。科学。2009;30:387–396. doi:10.1016/j.tips.2009.05.003。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 28Virtanen K.A.、Lidell M.E.、Orava J.、Heglind M.、Westergren R.、Niemi T.、Taittonen M.、Laine J.、Savisto N.J.、Enerback S.等。健康成年人的功能性棕色脂肪组织。北英格兰。医学杂志。2009;360:1518–1525. doi:10.1056/NEJMoa0808949。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 29Cypess A.M.，Kahn C.R.Brown脂肪治疗肥胖和糖尿病。货币。操作。内分泌。糖尿病肥胖。2010;17:143–149. doi:10.1097/MED.0b013e328337a81f。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 30Maury E.、Brichard S.M.脂肪因子失调、脂肪组织炎症和代谢综合征。分子细胞内分泌。2010;314：1–16.doi:10.1016/j.mce.2009.07.031。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 31O'Shea J.J.，Paul W.E.辅助CD4+T细胞的谱系承诺和可塑性的机制。科学。2010;327:1098–1102. doi:10.1126/science.1178334。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 32Hodge D.R.、Hurt E.M.、Farrar W.L.《IL-6和STAT3在炎症和癌症中的作用》。《欧洲癌症杂志》。2005;41:2502–2512. doi:10.1016/j.ejca.2005.08.016。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 33周瑜，魏瑜，朱杰，王琦，鲍立，马瑜，陈瑜，冯迪，张安，孙杰等。GRIM-19破坏E6/E6AP复合物以拯救p53并诱导宫颈癌细胞凋亡。《公共科学图书馆·综合》。2011;6：e22065.doi:10.1371/journal.pone.0022065。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 34Molchadsky A.、Ezra O.、Amendola P.G.、Krantz D.、Kogan-Sakin I.、Buganim Y.、Rivlin N.、Goldfinger N.、Folgiero V.、Falcioni R.等。P53是棕色脂肪分化所必需的，对饮食诱导的肥胖具有保护作用。细胞死亡不同。2013;20:774–783. doi:10.1038/cdd.2013.9。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 35Seale P.、Bjork B.、Yang W.、Kajimura S.、Chin S.、Kuang S.，Scime A.、Devarakonda S.、Conroe H.M.、Erdjument-Bromage H.等。PRDM16控制棕色脂肪/骨骼肌转换。自然。2008;454：961–967。doi:10.1038/nature07182。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 36Kajimura S.、Seale P.、Tomaru T.、Erdjument-Bromage H.、Cooper M.P.、Ruas J.L.、Chin S.、Tempst P.、Lazar M.A.、Spiegelman B.M.通过PRDM16/CtBP转录复合物调节棕色和白色脂肪基因程序。基因开发。2008;22：1397–1409。doi:10.1101/gad.1666108。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 37Kim E.K.、Lee S.H.、Jhun J.Y.、Byun J.K.、Jeong J.H.、Lee S.Y.、Kim J.K.和Cho M.L.二甲双胍通过诱导FGF21预防肥胖小鼠模型中的脂肪肝并改善白/棕色脂肪的平衡。调解。燃烧。2016;2016：5813030.doi:10.1155/2016/5813030。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 38Fabbrini E.、Sullivan S.、Klein S.肥胖和非酒精性脂肪肝：生化、代谢和临床意义。肝病学。2010;51:679–689. doi:10.1002/hep.23280。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 39Deurenberg P.、Deurenbeg Yap M.、Wang J.、Lin F.P.、Schmidt G.体重指数与体脂百分比之间关系的体重影响。国际J.Obes。1999;23：537–542。doi:10.1038/sj.ijo.0800868。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 40Tchernof A.、Lamarche B.、Prud'Homme D.、Nadeau A.、Moorjani S.、Labrie F.、Lupien P.J.、Despres J.P.密集低密度脂蛋白表型。男性血浆脂蛋白水平、内脏肥胖和高胰岛素血症的相关性。糖尿病护理。1996;19:629–637. doi:10.2337/diacare.19.6.629。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 41Erbey J.R.、Silberman C.、Lydick E.肥胖患者和2型糖尿病患者血清丙氨酸氨基转移酶水平异常的患病率。美国医学杂志。2000;109:588–590. doi:10.1016/S0002-9343（00）00602-1。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 42Kang K.S.肝功能试验异常。儿科。胃肠病学。肝素。螺母。2013;16:225–232. doi:10.5223/pghn.2013.16.4.225。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 43Fan S.，Zhang Y.，Sun Q.，Yu L.，Li M.，Zheng B.，Wu X.，Yang B.，Li Y.，Huang C.秋葵提取物降低高脂饮食诱导肥胖C57BL/6小鼠的血糖和血脂。《营养学杂志》。生物化学。2014;25:702–709. doi:10.1016/j.jnutbio.2014.02.010。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 44Dashti H.M.、Al-Zaid N.S.、Mathew T.C.、Al-Mousawi M.、Talib H.、Asfar S.K.、Behbahani A.I.生酮饮食对高胆固醇肥胖受试者的长期影响。摩尔细胞。生物化学。2006;286：1–9.数字对象标识代码：10.1007/s11010-005-9001-x。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 
