制药（巴塞尔）。2020年11月；13(11): 340.
在锂-皮罗卡品癫痫模型中，Anakinra减少癫痫的发生，提供神经保护，并减轻大鼠的行为损伤
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接收日期：2020年9月28日；2020年10月22日验收。
摘要
颞叶癫痫是一种广泛存在的慢性疾病，表现为自发发作，通常以药物治疗无效为特征。颞叶癫痫可由原发性脑损伤引起；因此，预防原发性癫痫发作被认为是最佳治疗方案之一。然而，癫痫的预防性治疗仍然不存在。神经炎症直接参与癫痫发生和神经退行性变，导致癫痫状态和认知功能下降。在本研究中，我们旨在阐明重组形式的白细胞介素-1受体拮抗剂（anakinra）治疗对使用锂-匹罗卡品模型的大鼠癫痫发生和行为损伤的影响。我们发现，在模型潜伏期服用anakinra显著抑制了慢性期自发反复发作的持续时间和频率。此外，在潜伏期和慢性期，阿那金拉给药可预防一些行为障碍，包括运动多动和社交障碍。组织学分析显示，服用anakinra可减少海马CA1和CA3区的神经元丢失，但不能防止星形胶质细胞和微胶质细胞增生。治疗增加了溶质载体家族1成员2基因的表达水平(Slc1a2，在海马体中编码兴奋性氨基酸转运蛋白2（EAAT2），可能导致神经保护作用。然而，促炎细胞因子基因（白细胞介素-1β(伊尔1b)和肿瘤坏死因子α(Tnfa公司))和星形胶质细胞标记基因（胶质纤维酸性蛋白(Gfap公司)和肌醇1,4,5-三磷酸受体2型(Itpr2号机组))在实验大鼠中，anakinra治疗对其无影响。因此，我们的数据表明，在癫痫发生期间服用阿那金拉具有一些有益的疾病改善作用。
关键词：颞叶癫痫，无激惹，锂-匹罗卡品模型，行为，癫痫发生，海马，自发复发性癫痫，神经胶质增生，伊尔1b,Tnfa公司,Gfap公司,Itpr2号机组,Slc1a2公司,信使核糖核酸
1.简介
癫痫是一种广泛存在的慢性疾病，表现为自发发作[1]. 这种疾病会导致教育、职业和行动（如驾驶）的限制、创伤和死亡率的增加[2]. 通常，进行性癫痫变得难治，近30%的病例对药物治疗无效[三]. 此外，癫痫可能伴有精神病共病，如抑郁、焦虑、精神病、认知障碍、睡眠障碍和偏头痛[4]这也降低了生活质量和复杂的治疗。
创伤因素（感染和损伤）、肿瘤、癫痫持续状态（SE）和围生期并发症经常会导致后天性癫痫[5]. 在这些情况下，癫痫发作通常在潜伏期后发生。因此，潜伏期的抗癫痫治疗被认为是预防癫痫的最佳选择[6,7]. 然而，癫痫的预防性治疗仍然不存在[8]. 合理预防治疗的发展需要了解癫痫发生的确切机制。癫痫发生涉及多种致病机制，其中之一是神经炎症[9,10]. 因此，对易感人群进行抗炎治疗可以降低癫痫发生的风险。
抗炎治疗有几个潜在的靶点，包括炎症细胞内和细胞外介质（细胞因子、高迁移率组蛋白1（HMGB1）、前列腺素、一氧化氮和补体系统）及其受体、酶（环氧合酶-2（COX-2）），和转录因子（活化B细胞的核因子-κ-轻链增强子（NF-кB）和激活蛋白1（AP-1））[11]. 在大脑中，细胞外介质不仅与免疫细胞和血管细胞相互作用，还改变神经元兴奋和突触活动。因此，它们可能导致癫痫发生和相关的病理过程，包括神经元损伤和兴奋/抑制失衡[12].
白细胞介素-1（IL-1）家族包括11种细胞因子，在神经炎症和神经活动调节中起着重要作用。IL-1α（IL-1α）和β（IL-1β）是该家族中研究最多的成员，它们具有强大的促炎作用，由膜IL-1受体I型（IL-1R1）实现[13]. IL-1受体拮抗剂（IL-1Ra）通过与IL-1R1结合位点竞争来调节IL-1α和IL-1β的促炎活性[14].
癫痫患者IL-1β基因表达增强，其增加与癫痫动物模型中癫痫发作的严重程度相关[15,16,17]. 在癫痫模型中，外源性应用IL-1β以IL-1R1介导的方式延长癫痫发作[18]. 据推测，IL-1β/IL-1R1轴提供了慢性癫痫发作的复发特征，并促进了脑损伤后癫痫发作[19]. IL-1Ra可能是一种潜在的癫痫预防治疗方法。Noe等人之前的研究[20]研究表明，两种抗炎药，人重组IL-1Ra（anakinra）和VX-765（一种IL-1β切割和释放的特异性非肽抑制剂）的组合，显著降低了星形胶质细胞中IL-1β的表达和大鼠前脑中的细胞损失。然而，这种治疗并没有阻止匹罗卡品或电诱导SE癫痫模型中癫痫的发展[20]. 在另一项研究中，IL-1Ra治疗改善了小鼠的认知功能，降低了儿童脑损伤后的癫痫易感性[21].
本研究旨在通过锂-匹罗卡品模型阐明阿那金拉治疗对大鼠癫痫发生和共病行为损伤的影响。之所以选择这种模型，是因为它是再现癫痫发生最有效的模型之一[22]. 在匹罗卡品诱导的SE后给予阿那金拉10天。为了评估治疗的疗效，我们评估了自发复发性癫痫（SRS）的频率和持续时间，分析了治疗对星形胶质细胞增生症和神经元丢失的影响，并评估了Il-1β、，α）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）。我们还研究了anakinra治疗是否能改善实验动物的运动和探索行为、认知功能和社会交往障碍。
2.结果
2.1. SE后的存活率和体重动态
Anakina治疗并没有改变SE后14天大鼠的存活率(A） ●●●●。我们发现两组大鼠的死亡率相同；大多数大鼠在SE后的前三天死亡。治疗不影响SE后大鼠体重的动态(B） ●●●●。在对照组中，动物的体重在整个观察期内都有所增加，而在SE后组中，无论接受何种治疗，SE后的第一天体重都有所下降。SE后3-4天体重开始回升。
匹罗卡品诱发癫痫持续状态（SE）后的存活率和体重动态。(A类)Kaplan–Meier生存曲线显示，anakinra治疗对大鼠生存无影响。(B类)体重动力学。红色箭头表示诱发SE的日期。用Tukey的诚实显著性差异（HSD）事后检验重复测量方差分析。F类(20,58)= 2.33,第页< 0.007. **第页对照组和两个SE后组之间均<0.01。Pilo-LAT：在潜伏期观察到毛果芸香碱诱导SE的大鼠；治疗-LAT：SE后大鼠在潜伏期接受anakinra治疗。
2.2. Anakina治疗降低了SRS的频率和持续时间
在约50%的Pilo-CHRO大鼠中观察到SRS，而在接受治疗的动物中仅为约20%(A） ●●●●。治疗组每天SRS的数量也较低（χ2= 6.24,第页= 0.04). 阿那金拉治疗使每天的总发作持续时间缩短了近五倍(B） 治疗组每次发作的平均持续时间缩短了三倍(C） ●●●●。因此，潜伏期的anakinra疗法具有有益的抗癫痫作用。
阿那金拉治疗降低了锂-匹罗卡品模型慢性期自发反复发作（SRS）的频率和持续时间。(A类)SRS大鼠百分比。罕见SRS：1-2次发作；频繁SRS：3集或更多。(B类)治疗组每24小时的SRS总持续时间较短。(C类)治疗组动物每次SRS发作的平均时间较短。Pilo-CHRO：慢性期毛果芸香碱诱导SE大鼠；治疗-CHRO：SE后大鼠在慢性期接受anakinra治疗*第页<0.05英寸t吨-测试。
2.3. Anakina治疗可减少神经丢失但不能预防神经胶质增生
接下来，我们检查了anakinra给药是否具有神经保护作用。尼塞尔染色显示毛果芸香碱诱导的SE后海马CA1和CA3区锥体层出现大量神经变性和胶质增生(，中柱）。Anakina治疗部分阻止了神经元丢失；然而，胶质细胞数量的增加并没有被阻止(，右栏）。
SE后神经变性和胶质增生（潜伏期）。尼塞尔染色显示神经变性金字塔街CA1和CA3区域的（s.p.）。销售订单：地层oriens; 序号：放射层插页显示了海马的图式和用于形态学分析的位置。Pilo-LAT：大鼠给予毛果芸香碱；治疗-LAT：大鼠服用毛果芸香碱，然后服用阿那金拉。比例尺为30µm。
为了进行定量分析，我们使用神经元标记物NeuN、星形胶质细胞标记物GFAP和小胶质细胞标记Iba1进行了免疫荧光分析。SE后CA1和CA3区NeuN-阳性神经元数量显著减少[23]，Pilo-LAT组GFAP阳性星形胶质细胞的平均数量几乎是对照组的三倍。Pilo-LAT组CA1和CA3中Iba1阳性小胶质细胞的数量约为对照组的四倍(和).
阿那金拉治疗对匹罗卡品诱导SE大鼠海马CA1和CA3区神经元（NeuN）和胶质（GFAP和Iba1）标记蛋白分布的影响。细胞核用DAPI（蓝色）染色。神经元标记物NeuN和星形胶质细胞标记物GFAP用藻红蛋白结合（FITC）二级抗体（绿色）显示。用FITC次级抗体观察小胶质细胞标记蛋白Iba。Pilo-LAT：大鼠给予毛果芸香碱；治疗-LAT：大鼠服用毛果芸香碱，然后服用阿那金拉。标准普尔：金字塔街CA1、CA3区域；销售订单：地层oriens，编号：放射层。比例尺为30µm。
anakinra治疗对神经元丢失和胶质增生的影响。图表显示了海马CA1和CA3区NeuN-阳性神经元、GFAP阳性星形胶质细胞和Iba阳性小胶质细胞的数量。每个点代表一只动物的结果；水平线显示平均值和标准偏差。组间比较采用Kruskal–Wallis检验，随后采用Dunn的事后检验。NeuN-阳性细胞：CA1（F(2,23)= 7.8,第页=0.02），CA3（F(2,23)= 9.8,第页P<0.01），GFAP阳性星形胶质细胞：CA1（F(2,23)= 15.7,第页<0.001），CA3（F(2,23)= 16.1,第页<0.001），Iba阳性小胶质细胞：CA1（F(2,23)= 16.1,第页<0.001），CA3（F(2,23)= 17.6,第页< 0.001). Pilo-LAT：大鼠给予毛果芸香碱；治疗-LAT：大鼠服用毛果芸香碱，然后服用阿那金拉*第页< 0.05; **第页< 0.01; ***第页< 0.001.
由于对照组和Treat-LAT组在CA1和CA3区域的NeuN-阳性细胞没有发现显著差异，因此Anakina治疗减少了神经元丢失(和). 然而，Treat-LAT组中GFAP阳性星形胶质细胞和Iba1阳性小胶质细胞的数量高于对照组，与Pilo-LAT组没有差异。我们得出结论，anakinra治疗具有显著的神经保护作用，但未能预防毛果芸香碱诱导的SE大鼠的胶质增生。
2.4. 细胞因子和星形胶质细胞活化标记物基因表达的变化
促炎细胞因子基因的表达(伊尔1b和Tnfa公司)和星形胶质细胞标记基因(Gfap公司,Slc1a2公司、和Itpr2号机组)在毛果芸香碱诱导SE七天后，对背海马（DH）、腹海马（VH）和颞叶皮层（TC）进行评估。此时，阿那金拉治疗正在进行中。对于实验动物，伊尔1bmRNA表达在所有被检查的脑区上调，而Tnfa公司mRNA水平仅在VH中增加(). anakinra治疗并未阻止促炎细胞因子基因的表达增加。
促炎细胞因子基因的相对表达(伊尔1b和Tnfα)毛果芸香碱诱导SE后7天，未经（Pilo-LAT）和（Treat-LAT）anakinra治疗的大鼠背海马（DH）、腹海马（VH）和颞叶皮层（TC）。每个点代表一只动物；水平线显示平均值和标准偏差*第页< 0.05; **第页在Tukey的事后检验的方差分析中<0.01。伊尔1b：DH:F(2,18)= 5,第页= 0.02; VH:F（沃尔沃汽车公司）(2,21)= 7.1,第页= 0.004; TC:F型(2,19)= 5,第页= 0.02.Tnfa公司：VH:F(2,18)= 23.5,第页< 0.001.
接下来，我们分析了星形胶质细胞标记物的基因表达Gfap公司,Slc1a2公司、和Itpr2号机组(). 增加了Gfap公司mRNA在所有受试脑区均有表达。Anakina治疗增强了两个海马区的这些变化，但不影响TC。Slc1a2公司和Itpr2号机组毛果芸香碱诱导SE后，未经治疗的动物的基因表达保持在基础水平。Anakinra治疗上调Itpr2号机组所有受检脑区的基因表达Slc1a2公司VH表达下调Slc1a2公司TC中的基因表达().
星形胶质细胞标记基因的相对表达(Gfap公司,Slc1a2公司,Itpr2号机组)毛果芸香碱诱导癫痫发作（Pilo-LAT）7天后和阿那金拉治疗（Treat-LAT）后SE后大鼠的背海马（DH）、腹海马（VH）和颞叶皮层（TC）。每个点代表一只动物；水平线显示平均值和标准偏差*第页< 0.05; **第页在Tukey的事后检验的方差分析中<0.01。Gfap公司：DH:F(2,23)= 18.3,第页<0.001；VH:F（沃尔沃汽车公司）(2,21)= 37.4,第页<0.001；TC:F型(2,22)= 12.5,第页< 0.001.Slc1a2公司：VH:F(2,23)= 12.5第页<0.001；TC:F型(2,19)= 34.7,第页< 0.001.Itpr2号机组：DH:F(2,23)= 8.3,第页= 0.002; VH:F（沃尔沃汽车公司）（2,24）= 13.8,第页<0.001；TC:F型(2,22)= 12.9,第页< 0.001.
2.5. 行为改变
在潜伏期和慢性期的大多数测试中，SE后动物的行为受到显著干扰[24]. 因此，我们研究了anakinra治疗是否能改善这两个时期动物的结果。
2.5.1. 野外测试（OFT）中的运动活动
Pilo大鼠在露天竞技场更活跃；他们花在竞技场上的时间比对照动物多(A） ●●●●。Pilo-CHRO大鼠比对照组大鼠移动更快(B） ●●●●。各组之间的差异主要是由于Pilo大鼠在趋近区的活动更高。所有组的触觉运动时间相同，但SE后组的触感距离比对照组增加(C、 D）。
anakinra治疗对开放场地运动活动的影响。采用单因素方差分析和Tukey的事后检验进行统计分析。图中显示了各组之间的显著差异。(A类)野外测试（OFT）中的运动持续时间。(B类)移动的平均速度。(C类)在趋近区内的平均运动时间。(天)在趋近区内行驶的距离。Pilo-LAT和Pilo-CHRO：毛果芸香碱诱导SE大鼠在模型的潜伏期和慢性期进行了相应的研究；Treat-LAT和Treat-CHRO：SE后大鼠接受anakinra治疗，并在模型的潜伏期和慢性期进行研究*第页< 0.05, **第页< 0.01.
Anakina治疗有效地预防了潜伏期的大鼠多动。然而，它并不影响慢性期的运动活动特性().
2.5.2. OFT中的探索行为
接下来，我们分析了OFT中的探索行为。我们观察到Pilo-LAT组的探索活动减少，这是由探索孔洞所花费的时间减少引起的(A） 和养育(B） ●●●●。Anakina治疗使探索行为恢复到典型值。相反，在模型的慢性阶段，我们观察到攀爬增加，这是探索活动的另一个参数(C） ●●●●。癫痫动物探索洞穴和饲养的时间不受影响。Anakina治疗对这两个参数均无影响。
anakinra治疗对SE后大鼠探索活动特征的影响。采用单因素方差分析和Tukey的事后检验进行统计分析。图中显示了各组之间的显著差异。图表显示了平均花费的时间(A类)勘探孔(B类)饲养，以及(C类)为不同组的老鼠爬山。Pilo-LAT和Pilo-CHRO：毛果芸香碱诱导SE大鼠在模型的潜伏期和慢性期进行了相应的研究；Treat-LAT和Treat-CHRO：SE后大鼠接受anakinra治疗，并在模型的潜伏期和慢性期进行研究*第页<0.05，Tukey的事后检验。
2.5.3. 认知功能与记忆
使用Y迷宫测试和恐惧条件反射范式，对模型慢性期的认知功能和记忆进行了研究。在Y迷宫中，我们没有观察到交替系数的任何变化，这表明空间工作记忆不受SE或anakinra治疗的影响(A） ●●●●。我们确实观察到癫痫动物的手臂数量增加（F(2,27)= 6.8,第页<0.01），这支持了OFT关于这些大鼠运动活动增加的发现。阿纳金拉治疗并没有改变被访武器的数量(B） ●●●●。
Anakina治疗没有改变SE后大鼠在Y迷宫中的行为。采用单因素方差分析和Tukey的事后检验进行统计分析。图表显示了(A类)交替和(B类)不同组大鼠Y迷宫中访问的手臂数量。Pilo-CHRO：在模型慢性期对毛果芸香碱诱导SE大鼠进行相应研究；治疗-CHRO：SE后大鼠接受anakinra治疗*第页ANOVA Tukey事后检验中<0.05。
恐惧记忆是通过基于对疼痛相关刺激的反应而冻结的时间的恐惧条件反射测试来评估的。在第1天，我们观察到Pilo-CHRO组的恐惧反应受到干扰；足部电击后的冻结时间（第1-3次和第1-5次子测试）小于对照组(A） ●●●●。在用anakinra治疗的组中，冷冻时间介于对照组和癫痫组之间。这些结果表明，anakinra疗法对恐惧条件反射范式中的短期记忆有积极影响。
恐惧调节测试。采用Tukey事后检验的单因素重复测量方差分析进行统计分析。图表显示了不同子试验期间对照组和SE后大鼠的相对冷冻时间(A类)训练日子测验：1–2（F(2,36)= 9.0,第页<0.001），1-3（F(2,34)= 9.4,第页<0.001），1-4（F(2,33)= 6.2,第页<0.01），1-5（F(2,37)= 13.8,第页< 0.001); 和(B类)笼A中的测试日（子测试2–1 F(2,32)= 9.4,第页<0.001）和新的笼B子测验：2–2（F(2,35)= 7.7,第页<0.01），2–3（F(2,34)= 25,第页<0.001）和2-4（F(2,35)= 8.9,第页< 0.001). *第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页<0.001：根据Tukey的事后检验，各组之间的差异。
第二天，我们检查了上下文和条件记忆(B） ●●●●。与对照组大鼠相比，Pilo-CHRO组和Treat-CHRO组的动物在放置在笼子a后没有表现出恐惧反应，前一天它们在笼子中受到了脚电击。在新的笼子B中，有条件的声音不会在癫痫动物中引起冻结反应，而对照动物表现出长时间的冻结。这些结果表明，这两种类型的记忆都显著受损，阿那基拉治疗对纠正与厌恶性刺激相关的长期记忆没有益处，因为冷冻时间比对照组动物短得多(B） ●●●●。
2.5.4. 社交互动
使用社会互动测试范式，我们发现SE后大鼠在潜伏期和慢性期的积极社会互动时间减少。Anakina疗法显著改善了模型两个阶段的交流行为(A） ●●●●。然而，交际行为的持续时间并没有得到控制值。
Anakina治疗可减轻SE后大鼠的社会行为损伤。Tukey's或Games的单向方差分析——Howell的事后检验用于统计分析。(A类)图中显示了社交互动测试中大鼠的平均交流时间（模型的潜伏期：F(2,30)= 12.7,第页<0.001，慢性期：F（2,29）= 27.0,第页< 0.001). (B类)不同组大鼠的自我梳理总时间相似*第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页< 0.001.
通过这项测试，我们没有发现用总的自我打扮时间来衡量焦虑水平的差异(B） ●●●●。
2.5.5. 蔗糖偏好测试
蔗糖偏好测试未显示任何受试组的享乐行为。SE后大鼠的蔗糖偏好与对照组相比没有显著差异(). 因此，我们的结果表明，毛果芸香碱诱导的SE和anakinra治疗均未导致抑郁样行为。
不同组大鼠的蔗糖溶液消耗百分比相似。Pilo-LAT和Pilo-CHRO：毛果芸香碱诱导SE大鼠在模型的潜伏期和慢性期进行了相应的研究；Treat-LAT和Treat-CHRO：SE后大鼠接受anakinra治疗，并在模型的潜伏期和慢性期进行研究。
3.讨论
我们的结果表明，SE后的anakinra治疗显著抑制了锂-匹罗卡品模型慢性期SRS的持续时间和频率。它还具有神经保护作用。然而，治疗并没有降低治疗组的死亡率；此外，神经炎症和胶质增生也没有受到明显抑制。行为测试结果表明，anakinra治疗可以防止模型潜伏期的运动、探索和社交活动受到干扰。在慢性期，该疗法对社会行为和恐惧反应表现出积极的长期影响；然而，它并没有改善运动和探索活动或长期记忆。
3.1. 方法考虑因素
Anakina是一种小分子量的人类重组蛋白。这种药物目前在临床上广泛使用，因为它影响各种慢性炎症疾病的主要机制。由于其天然来源、高结合亲和力和靶向特异性以及低毒性，被认为具有显著的治疗潜力。然而，anakinra的效率可能受到两个特征的限制：低脑摄取和短生物半衰期（4-6小时）[25,26].
在临床实践中，anakinra通常用于治疗自身炎症性疾病，但有几篇报道称anakinra用于难治性癫痫[27]. 在一名患有发热感染相关癫痫综合征的儿童中，阿那金拉疗法降低了癫痫发作的频率，并将脑脊液中的促炎细胞因子恢复到正常水平[28]. 另一项研究显示，在整个治疗过程中，阿那金拉治疗减少甚至终止了患者顽固性慢性癫痫发作[29]. anakinra的抗惊厥作用已在急性SE动物模型中显示[18,30,31,32]. 然而，anakinra治疗的抗癫痫活性和疾病改善效果尚不清楚。
在这项研究中，我们在静脉注射中使用了高剂量的阿那金拉（50–100 mg/kg），因为已经证明大脑中的治疗浓度很低，只能通过外周注射高剂量来实现[33,34]. 我们研究的另一个可能的局限性是，阿那金拉每天只服用一次。因此，药物作用很可能是脉动性的，如果使用其他给药方案，效果可能会有所不同。
3.2. Anakina治疗抗癫痫作用的潜在机制：基因表达和组织学研究
在这项研究中，我们假设服用阿那金拉会减弱IL-1β介导的促炎途径，从而减少神经炎症并防止癫痫发生。然而，我们的假设仅得到部分证实。我们发现，服用anakinra不会影响DH、VH或TC潜伏期IL-1β和TNFα基因的表达，这是锂-匹罗卡品模型中癫痫发生最显著的结构。我们认为，治疗的主要效果主要是由于IL-1β/IL-1Ra比率的变化，而不是由于IL-1α或其他促炎细胞因子水平的直接降低。
anakinra治疗的神经保护作用可以通过其对谷氨酸能神经传递特性的影响来解释。在神经元中，Il-1R1s广泛与NMDA受体共定位[35]尤其是其GluN2B亚单位[36]. 神经元中Il-1R/TLR4信号的激活导致神经酰胺/src激酶介导的含有GluN2B的NMDA受体的磷酸化[37]. 在海马神经元培养中应用Il-1β后，NMDA电流增加50%[38]. 通过NMDA受体增加钙内流导致兴奋毒性和细胞丢失[39]. 因此，anakinra的存在可以防止含有GluN2B的NMDA受体的过度激活和兴奋性毒性。
另一个可能与anakinra治疗的抗癫痫作用有关的重要发现是Slc1a2公司VH中的基因Slc1a2公司基因编码EAAT2，一种星形细胞谷氨酸转运体，提供约90%的突触间隙谷氨酸再摄取[40]. 细胞外谷氨酸在癫痫发作中起关键作用[41]. EAAT2的高表达在不同模型中阻止或减弱了癫痫发作[42,43,44,45]有神经保护作用[46]. 事实上，我们发现anakinra治疗部分阻止了海马体的神经元损失。然而，应注意的是，在TC中，Slc1a2公司anakinra治疗后基因表达略有下降。
然而，anakinra治疗并不能预防胶质增生症。我们观察到Gfap公司和Itpr2号机组毛果芸香碱诱导SE后的基因在治疗组和非治疗组中均存在。根据分子数据，我们观察到星形胶质细胞和小胶质细胞的数量显著增加。
3.3. 行为数据
炎症过程被发现与癫痫的多种共病相关，如认知功能障碍[47,48]，抑郁症[49,50]和精神病[51]. 有人认为神经炎症可能是癫痫及其精神共病之间的主要联系[52,53]. 因此，抗炎治疗在预防癫痫相关的认知和情绪障碍方面是有益的。
我们之前详细描述了锂-匹罗卡品模型中的行为障碍[24]. 主要障碍是运动过度活跃、社交交流减少和记忆功能改变。基于这些结果，我们选择了一组主要与受损行为形式相关的行为测试：运动和探索活动的OFT测试，沟通的社交互动测试，不同记忆形式的Y迷宫和恐惧条件反射测试，以及抑郁样行为的蔗糖偏好测试。
在anakinra治疗期间，SE后大鼠没有表现出过度活动。他们的社交行为与对照组大鼠相似。此外，我们没有观察到治疗的任何不良副作用。anakinra治疗对大鼠行为的长期影响较小。癫痫大鼠的运动过度活跃和长期记忆功能没有通过治疗得到改善。然而，在模型慢性期观察到的工作记忆功能和社会互动的改变，通过服用阿那金拉，得到了部分改善。
4.材料和方法
4.1. 动物
Wistar大鼠在俄罗斯科学院（俄罗斯圣彼得堡）谢谢诺夫进化生理学和生物化学研究所的动物设施中繁殖。大鼠被关在标准的家庭笼子里（每个笼子六到七只大鼠），可以自由获得食物和水，并有12小时的黑暗-光明周期（晚上8点到早上8点）。对照组和实验组的大鼠来自不同的窝，以避免任何遗传因素的影响。所有实验均根据俄罗斯科学院谢谢诺夫进化生理学和生物化学研究所有效的《实验动物治疗指南》（伦理许可证号：13-k-a，2018年2月15日）进行。这些指南符合欧盟关于动物实验的第2010/63/EU号指令。
4.2. 锂-毛果芸香碱模型与治疗
在注射匹罗卡品前1天，将127 mg/kg氯化锂（LiCl；Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA）腹腔注射给7周龄雄性大鼠。在注射匹罗卡品前1 h，给药（−）-甲基溴化东莨菪碱（1 mg/kg，i.p.；Sigma-Aldrich）以阻断外周毒蕈碱受体。根据诱导癫痫发作的强度，大鼠接受一次或多次注射毛果芸香碱（i.p.；Sigma-Aldrich）。根据Racine量表评估癫痫的严重程度：（1）面部自动症，（2）头部触碰，（3）前肢肌阵挛，（4）仰卧，（5）仰卧和摔倒，（6）狂奔，（7）全身阵挛性抽搐[54]. 第一次注射匹罗卡品的剂量为10 mg/kg。如果大鼠在30分钟内没有出现4分或以上的癫痫发作，则每隔30分钟再注射10 mg/kg匹罗卡平。第四次注射后没有出现4分或以上惊厥的大鼠（总剂量为40 mg/kg）被排除在进一步实验之外。在4分癫痫发作开始后75分钟服用安定（10 mg/kg，静脉注射；西格玛-阿尔德里奇），以停止惊厥。因此，研究中的所有大鼠都发展为SE。研究中使用的动物总数为153只。
研究的设计如所示在模型的潜伏期和慢性期，使用三组大鼠进行实验：（1）对照组（用生理盐水代替毛果芸香碱给药），（2）Pilo组（用发展为SE的毛果芸碱给药的大鼠），和（3）治疗组（SE后anakinra治疗的大鼠。
实验设计。Pilo：用匹罗卡品给药的大鼠，Treat：用匹罗卡品给药剂，然后用anakinra给药，LiCl:氯化锂，SMB:（−）-甲基溴东莨菪碱，DZ:地西泮，OFT:开放场试验，SI：社交互动试验，SP:蔗糖偏好试验，Y迷宫：Y形迷宫自发交替试验，FC：恐惧条件反射，SRS：自发复发性癫痫登记，RT-qPCR：逆转录后定量聚合酶链反应。
Anakina是使用大肠杆菌TG1（pTAC-hIL-1ra）产生菌株（俄罗斯圣彼得堡高纯生物制剂研究所）。在pH 7.0 0.14 M NaCl的0.02 M磷酸盐缓冲液中以100 mg/mL的浓度制备蛋白质（纯度99%）；0.01%聚山梨酯80。研究表明，当剂量小于IL-1β剂量的10倍时，该蛋白可将IL-1β刺激的小鼠T淋巴细胞增殖抑制50%。
注射地西泮后1小时给予阿那金拉（100 mg/kg），然后在接下来的5天内每天给药。在第6-10天，阿那金拉的剂量为50 mg/kg。剂量是根据以前的实验工作确定的[25,55,56,57].
4.3. 存活率和体重
SE后2周内监测存活率和体重。SE后第一周，每天给大鼠注射5%葡萄糖溶液（2 mL，皮下）以提高存活率[58].
4.4. 自发性反复发作
SE后6周评估SRS的存在。将每只大鼠放在一个装有水和食物的透明笼子中16小时（晚上9点至下午1点），连续3天，并进行录像。确定每个SRS发作的持续时间。然后，我们计算了SRS的总时间和平均频率。
4.5. 行为测试
在锂-匹罗卡品模型的潜伏期（匹罗卡平诱导SE后第7至10天）和慢性期（第45至52天）进行行为测试().
4.5.1. 野外测试
野外试验（OFT）[59]用于评估运动和探索活动。露天竞技场直径1米，墙高30厘米，照明8 Lx，地板上有4厘米的圆孔。老鼠被放在竞技场的中心。记录每只大鼠的运动3分钟。使用Round and Cross和Field4W软件（俄罗斯圣彼得堡实验医学研究所）离线分析记录。我们定义了不同场区中轨迹的形式和运动特征。测量在竞技场中心（竞技场半径的1/4）和靠近墙壁（距离墙壁不到20厘米，thigmotaxis）的时间，以评估焦虑水平。计算总距离、平均速度、运动时间和静止度以确定运动活动。对以下行为模式的数量和总持续时间进行了测量：洞探索、嗅探、攀爬和饲养（探索活动）以及在一个地方的运动和动作（运动活动）。
4.5.2条。Y形迷宫自发交替试验
Y迷宫[60]用于测量空间工作记忆。迷宫由三条手臂组成（每条50×10厘米），壁高30厘米，不透明。将大鼠放在中心位置，分析进入手臂的顺序8分钟。如果输入与之前的两个输入不同，例如1-2-3、2-3-1或1-3-2，则认为输入是正确的。重复的数字，如1-1，被视为两个条目。交替系数（CA类)作为手术空间记忆的指标。计算如下：CA类=N正确的/（N全部的−2），其中N正确的是新手臂的正确条目数，N全部的是条目总数。
4.5.3、。恐惧条件测试
短期和长期恐惧相关记忆的恐惧条件反射测试[61]在3天内完成。本试验中使用了两个有机玻璃笼。笼子A（45×30厘米，高=20厘米）有一个导电地板。笼子B较大（60×30厘米，高度=40厘米），没有导电地板。第0天（习惯化日），大鼠习惯于笼子A的条件作用3分钟。第1天（条件作用日），将大鼠置于笼子A中。进行五个条件作用步骤：120 s习惯化（步骤1-1），20 s听觉提示（80 dB声音），然后2 s温和（0.6 mA）脚电击过导电地板（步骤1-2）、120秒休息（步骤1-3）、重复步骤1-2（步骤1-4）和60秒休息（步1-5）。第2天（测试日），将大鼠放在笼子A中3分钟（步骤2-1），没有提示或电流来评估条件相关恐惧（情境条件反射测试）。然后，老鼠被转移到笼子B（步骤2-2至2-4），笼子B大小不同，墙上有几何图形的图片，地板上有香草醛滴，产生了一种让老鼠不熟悉的新气味。因此，笼子B与笼子A无关。在习惯化3分钟后（步骤2-2），用同样的电流相关声音持续3分钟（步骤2-3）来评估线索相关恐惧（线索条件测试）。在最后1分钟的步骤（步骤2-4）中没有刺激。
在每一步中，测量冻结的总时间，以估计对厌恶刺激的恐惧反应。由于步长不同，所以用相对冻结时间（步长的%）来测量恐惧相关记忆。在第1-3步和第1-5步（足部电击后立即）的冻结反应了短期恐惧相关记忆。
4.5.4。社交互动测试
社交互动测试用于评估社交行为[62]. 在测试前，将大鼠置于树脂玻璃笼子（60×30 cm，高度=40 cm）中30 min，以减少新环境带来的焦虑[62]. 然后，将一只陌生、成年、完整的雄性Wistar大鼠放在同一笼子里5分钟。测量了以下模式：交流（嗅闻并梳理入侵者的身体，嗅闻入侵者尾巴和生殖器）、攻击、防御、对雄性入侵者进行性行为（上马后舔生殖器，和非交流行为（自动梳理）。
4.5.5。蔗糖偏好测试
蔗糖偏好测试[63]连续2天进行评估抑郁样行为（无快感）。第1天，将装有1%蔗糖溶液的瓶子放在家里的笼子里，这样老鼠就可以习惯甜味。第2天，用两个瓶子将大鼠放入单独的笼子（30×30cm，高度=40cm，每个笼子一只大鼠）中，第一个装有普通饮用水，另一个装有1%蔗糖溶液。18小时（下午6点至12点）后，通过称重测量水和蔗糖溶液的摄入量。蔗糖偏好是通过蔗糖溶液消耗量与总液体消耗量的比率来计算的。
4.6. 组织学
毛果芸香碱诱导SE后7天，用水合氯醛（400mg/kg，腹腔注射）麻醉大鼠。在用4%的多聚甲醛（PFA）溶液在0.1 M磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4）中经心灌注后，将大脑固定在PFA中2周，然后使用冷冻切片机Leica CM 1510S（德国Wetzlar Leica Microsystems）在冠状面冷冻切片（15μM厚）。所分析的背海马（DH）组织块开始于距Bregma 3.3 mm处[64]每个大脑用于每种分析类型的六到十个部分。对于随机取样，随机选择分析序列中的第一个截面，分析截面之间的距离为60µm。
在AF7000显微镜下，使用甲酚紫（Nissl）染色切片对海马区CA1和CA3的神经元丢失进行分析（Leica Microsystems，Wetzlar，德国）。使用DFC495相机（徕卡微系统公司）对图像进行了数字化。
采用间接免疫荧光分析法分析神经元和胶质标记物的分布。切片在37°C的PBS中孵育过夜，PBS中含有2%的牛血清白蛋白、0.3%的Triton X-100（德国达姆施塔特默克）和在兔子体内开发的三种主要抗体之一：神经元标记物抗NeuN（Abcam，剑桥，英国，ab104225，1:200稀释）、星形胶质细胞标记物抗GFAP（Abcam，ab7260，1:200）、，或小胶质细胞标记物抗Iba1（Abcam，ab178846，1:100）。彻底冲洗后，将切片在37°C的荧光标记二级抗体中孵育1小时。用抗兔IgG藻红蛋白结合（FITC）二级抗体（Abcam，ab97050，1:200）显示抗-NeuN和抗-GFAP，用抗兔免疫球蛋白结合二级抗体显示抗-Iba1（Abcam，ab70071:200）。在连接到徕卡TCS SL共焦扫描仪（徕卡微系统）的徕卡DMR显微镜上进行免疫荧光研究。荧光染料由波长为488nm的He/Ar激光激发。FITC荧光信号的波长范围为496–537 nm，藻红蛋白信号的波长为652–690 nm。视频测试大师形态项目（俄罗斯莫斯科视频测试）用于计算免疫阳性细胞的数量。在CA1或CA3区域的特定地标处应用500μm的矩形窗口。如果该细胞在三个或更多点的亮度与背景不同，则认为该细胞为免疫阳性。
4.7. mRNA表达分析
SE后7天将大鼠斩首。快速提取大脑并在−80°C下冷冻。根据大鼠脑图谱，使用微型抹刀解剖DH、腹侧海马（VH）区域和颞叶皮层（TC），并将其储存在OTF5000冷冻切片机（英国卢顿Bright Instruments公司）的−20°C下[65]. 总RNA通过一步酸性硫氰酸胍-苯酚-氯仿法提取[66]根据制造商的说明使用ExtractRNA试剂（Evrogen，Moscow，Russia）。RNA样品用1单位RQ1 DNAse（美国威斯康星州麦迪逊市普罗米加）处理15分钟，然后进行氯化锂沉淀和乙醇洗涤。使用NanoDrop™Lite分光光度计（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA），根据260 nm吸光度和260/280吸光度比，分光光度法评估RNA浓度和纯度。
cDNA由1μg（VH）或2μg（TC和DH）总RNA合成，使用寡核苷酸（0.5μg/1μg RNA）和9 mer随机引物（0.25µg/1µg RNA）（DNA合成有限公司，俄罗斯莫斯科）和M-MLV逆转录酶（100单位/1µgRNA；美国威斯康星州麦迪逊市普罗米加）按照制造商的说明，总体积为25µL。简单地说，将8µL RNA溶液与引物混合，并在70°C下培养10分钟。将其快速冷却至4°C进行引物退火，然后加入含有反应混合物的混合回复酶，并将样品在42°C下孵育1小时，在65°C下孵育10分钟。在PCR步骤之前，将所有样品稀释10倍。使用0.8µL cDNA、0.75单位TaqM-聚合酶（Alkor Bio，俄罗斯圣彼得堡）和3.5 mM Mg进行总体积为10µL的qPCR2+; 特定的正向引物、反向引物和水解（TaqMan）探针以分析依赖的浓度插入（参见附录A
). 核苷酸购自DNA合成有限公司（俄罗斯莫斯科）。肌醇1,4,5-三磷酸受体2型的qPCR(Itpr2号机组)作为单丛执行。其他反应如下：伊尔1b具有Tnfa公司，胶质纤维酸性蛋白(Gfap公司)溶质载体家族1成员2基因(Slc1a2，编码兴奋性氨基酸转运体2（EAAT2）和三种参考基因的三重qPCR分析Actb+Gapdh+B2m,Rpl13a+Ppia+Sdha、和Hprt1+Pgk1+Ywhaz如前所述[67]. 用连续稀释法评估PCR效率[68]. 所有分析均显示最佳效率在90-105%范围内；复合反应显示出与单一复合物的性能兼容。PCR反应是三倍的，在C1000 Touch热循环器和CFX96 Touch™实时PCR检测系统（BioRad，Hercules，CA，USA）中同时进行，没有模板和反转录对照样品。基于使用RefFinder在线工具获得的综合排名，选择用于表达数据归一化的参考基因(https://www.heartcure.com.au/reffinder/)与GeNorm合并[69]、NormFinder[70]，最佳守护者[71]和比较增量CT[72]算法。
Gfap的相对表达式，Slc1a2公司,Itpr2号机组,伊尔1b、和Tnfa公司使用2-ΔΔCt方法计算基因，该方法根据三个最稳定的分析脑区参考基因的几何平均值进行标准化[73]以下为：Ppia公司,伊瓦兹、和第1页在DH和VH中Gapdh公司,第1页、和卢比13a在TC中。
4.8. 统计分析
使用SPSS Statistics 23（IBM，Armonk，New York，NY，USA）和StatSoft Statistica 8（TIBCO，Palo Alto，CA，USA，TIBCO）进行统计分析。在生存分析中，我们使用Kaplan–Meier程序和Breslow标准来检验分布均匀性。
Iglewicz和Hoaglin对多个离群值的稳健检验用于识别和拒绝离群值。Kolmogorov–Smirnov和Shapiro–Wilk检验用于检验分布的正态性。学生的t吨-正态分布数据采用检验、单向和重复测量方差分析和Tukey的事后检验。如果违反方差同质性假设，则使用Welch方差分析和Games–Howell事后检验。使用非参数Kruskal–Wallis检验和Dunn的事后检验来比较不同实验组中免疫阳性细胞的数量。在所有测试中，组间差异在第页<0.05级。除非另有规定，否则所有直方图均表示平均值±SEM。
5.结论
这项研究表明，阿那金拉是一种很有希望的药物候选，可作为癫痫的预防治疗。虽然阿那金拉在锂-匹罗卡品模型中表现出不完美的功效，但它没有任何明显的副作用。阿那金拉与另一种兼容疗法的联合是否可以提高其治疗效率还需要进一步研究。这项研究是朝着寻找预防癫痫发作风险患者癫痫的治疗方法迈出的一步[6].
致谢
我们感谢Natalia Leonidovna Tumanova对组织学研究的帮助。
作者贡献
概念化，O.E.Z.和A.V.Z。；数据管理、A.V.D.、D.S.V.、M.V.Z.、A.A.K.和A.P.S。；形式分析、A.V.D.、O.E.Z.、I.V.S.、D.S.V.、A.A.K.和A.V.Z。；融资收购，A.V.Z。；调查、A.V.D.、O.E.Z.、I.V.S.、D.S.V.、M.V.Z.、A.A.K.、A.P.S.和A.M.I。；方法、A.V.D.、O.E.Z.、A.M.I.和A.V.Z。；O.E.Z和A.V.Z项目管理。；监督、O.E.Z.和A.V.Z。；书面原稿，A.V.D.、I.V.S.、D.S.V.、M.V.Z.、A.A.K.、A.P.S.、A.M.I.和A.V.Z。；写作审查和编辑、A.V.D.、O.E.Z.、I.V.S.、A.A.K.和A.V.Z。所有作者均已阅读并同意手稿的出版版本。
基金
这项研究由俄罗斯科学基金会资助，批准号16-15-10202。
利益冲突
作者声明没有利益冲突。资助者在研究设计中没有任何作用；收集、分析或解释数据；在撰写手稿时，或在决定公布结果时。
脚注
出版商备注：MDPI对公布的地图和机构关联中的管辖权主张保持中立。
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