肿瘤抗原在树突状细胞间突触转移的可视化研究

肿瘤抗原以离散的细胞内“包”形式到达淋巴结

当我们分析宿主tdLN时，再次在细胞内观察到ZsGreen作为puncta，（在mT+宿主中，图1D). 我们从这些tdLN中分选细胞，并通过高分辨率点阵光片显微镜（LLS）进行分析，以解决点阵并最小化背景荧光。我们发现ZsGreen信号定位于囊泡结构（ZsGreensignal被mT包围⁺薄膜如所示图1E). 图像渲染通过以z表示3D深度（细胞体积，灰色）突出显示ZsGreen putta膜封装，另请参见视频S1.ZsGreen细胞的频率⁺在tdLN中，约为迁徙和定居cDC1（迁徙CD103⁺DC和常驻CD8α⁺DC）和类似的cDC2（迁移CD11b⁺DC和常驻CD11b⁺DC）(图1F，请参阅图S1B用于门控策略），相比之下，在肿瘤中接近100%(图1B). 在患有巨大肿瘤的小鼠中，我们经常发现大量的ZsGreen⁺单核细胞，但仅鉴定出相对少量的无细胞ZsGreen⁺亚细胞大小的微粒（通过流式细胞术定义为缺乏细胞核和弱散射）(图1F). 与TME一样，大多数ZsGreen⁺puncta，包括常驻DC中的puncta也含有典型的肿瘤相关蛋白，再次证明ZsGreen准确报告了髓样细胞中的肿瘤衍生物质(图1G). 我们实验室的工作之前已经证明Langerhans细胞的抗原载量和tdLN运输相对较低(Binnewies等人，2019年)因此，本研究重点关注在tdLN肿瘤衍生传播中起主导作用的四个DC人群。

泡状细胞迁移DC介导肿瘤抗原向tdLN的转运

LN成像显示，ZsGreen始终被发现为细胞内点状信号，并且在包膜下窦中未观察到，在那里微粒或外泌体可能积聚(图2A–B类). 对来自tdLN的活细胞、分选细胞的LLS成像显示，大多数可检测的ZsGreen信号局限于囊泡结构就地细胞膜信号（mT，红色）的表面呈现为z切片和三维深度的ZsGreen信号（绿色），基本上去除了红色荧光的顶层，显示了膜的封装（白色方框，缩放1-6）(图2C). 在中所示的示例中图2C在不同的细胞内位置可以发现含有ZsGreen的膜结合小泡，其中一些小泡与细胞膜关系更密切（方框1-4），许多小泡深入细胞质空间（方框5-6）。

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图2。

肿瘤抗原通过囊泡状迁移树突状细胞转移至引流淋巴结

（A） 肿瘤引流淋巴结（tdLN）共焦成像示意图（顶部）。B16ZsGreen tdLN在低倍（左侧，比例尺=50μm）和高倍（右侧，比例栏=10μm）下的图像。LN区域的轮廓和标签。白色方框的放大倍数更高的图像缩放。代表性图像。（B） 来自A中图像的tdLN中的ZsGreen定位模式。图中为ZsGree的数量⁺完整td番茄细胞膜（细胞内）内的事件计数与未计数（待定）。（C） 分选居民CD11b的点阵光片成像⁺来自mTmG小鼠B16ZsGreen tdLN的DC。大图像显示细胞膜（红色）和肿瘤衍生的ZsGreen（绿色）的表面渲染。代表性形象。比例尺=3μm。白色方框显示编号缩放图像的位置（右）。单面膜显示ZsGreen表面的总3D体积（绿色）。（D） 来自C57BL/6 WT的tdLN的髓细胞或微粒（MP）内的肿瘤衍生的ZsGreen，或抄送7^−/−老鼠。图为平均频率+/-SEM。n=4。3个独立实验的代表。迁移CD11b⁺DC（m11b），常驻CD11b⁺DC（r11b）。（E） B16ZsGreen肿瘤和匹配tdLN中迁移DC型ZsGreen的平均荧光强度（MFI）。图为MFI+/-SEM。n=2。2个独立实验的代表。（F） 平均ZsGreen⁺肿瘤和tdLN中迁移DC亚群（CD103，m11b）中每个细胞的小泡计数。图为平均频率+/-SEM。n=13–22。在所有图表中：学生t检验，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。另请参见 图S2.

在以前的研究中，CCR7被证明是DC从肿瘤迁移到tdLN以及随后激活T细胞的能力所必需的(Roberts等人，2016年;Salmon等人，2016年). 我们在这里扩展了这一发现，表明ZsGreen⁺细胞和微粒实际上在抄送7^−/−老鼠(图2D). 相反，在抄送2^−/−单核细胞迁移缺陷的小鼠，tdLN中的ZsGreen水平与对照组相当(图S2). 在WT动物中，对tdLN迁移DC中ZsGreen水平的详细研究表明，与肿瘤常驻对应物相比，其荧光强度降低了10倍(图2E). 同样，ZsGreen⁺迁移DC中每个细胞的囊泡数量减少了一半以上(图2F). 此外，ZsGreen⁺在tdLN中，常驻DC数量更多，亮度与迁移DC相当(图1F)这些观察结果与固定数量的荧光通过单个囊泡主动重新分布到tdLN中更多的受体细胞中是一致的。虽然还可能发生额外的蛋白质降解或囊泡聚集，但我们考虑了直接切换到常驻细胞的可能性，导致迁移DC中的荧光稀释。

肿瘤抗原以膜结合囊泡的形式从迁移到常驻DC

因此，我们开发了在体外《曼卡拉化验》的灵感来源于古代游戏，玩家从一个玩家的隔间向另一个玩家播撒“种子”。该试验旨在测试“通过”抗原的囊泡性质以及控制该转移的规则。在本研究中，我们使用了从B16ZsGreen肿瘤mT的LN中筛选出的ZsGreen-loaded DC⁺小鼠同时研究ZsGreen和mT⁺膜被转移。Zs绿色⁺CD45.2型⁺百万吨⁺DC与未标记的、未分化的CD45.1共同培养16小时⁺收款DC(图3A)和CD45.1⁺Zs绿色⁺对受体DC进行分类，用抗CD45染色并用LLS成像。细胞内ZsGreen⁺点子被mT包裹⁺膜，证明含有供体膜的囊泡被传递给受体DC(图3A–B类).

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图3。

肿瘤抗原在活细胞接触点以膜囊泡的形式转移

（A） A（底部）-B的设置。共培养后，ZsGreen⁺CD45.1型⁺DC通过晶格光片（LLS）显微镜进行分类和成像。底部是ZsGreen的LLS图像⁺CD45.1型⁺数据中心。CD45内ZsGreen（绿色）囊泡被mT（红色）包围⁺（紫色）单元格显示为最大强度投影（MIP）（左）和z切片（右）。（B） A中细胞的表面效果图显示细胞膜（CD45）具有额外深度的z切片，而ZsGreen和mT信号显示为表面MIP。代表性形象。（C）体外抗原转移试验。捐赠者ZsGreen⁺DC是从B16ZsGreen tdLN中分离出来的，受体DC是从核tdTomato（nT）小鼠的LN中提取出来的。（D-E）Zs绿色⁺供体细胞（D）与单个受体DC以1:1的比例共同培养，或（E）与所有四个受体DC的等比混合共同培养。热图显示ZsGreen的平均频率⁺吨⁺共培养+/-SEM后的受体。4-5个独立实验的代表。（F） 设置如E所示，并添加3μm孔转接孔。误差条表示+/-SEM。n=3–5。3个独立实验的代表。（G） 在zVAD在场的情况下进行E中的设置。n=6–7。3个独立实验的代表。（H） tdLN中DC型的膜联蛋白V染色。n=6。图为膜联蛋白V的平均百分比⁺细胞。误差线为+/-SEM。代表3个独立实验。所有图表，Student t检验，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。另请参见 图S3.

接下来，我们使用该分析来探讨细胞-细胞囊泡转移的机制和特异性。这里是核番茄（nT）⁺之所以使用“受体”DC，是因为这种标记可以避免可能的双向膜交换引起的任何歧义(图3C). 使用单一受体细胞类型，我们观察到迁移的DC群体充当同样熟练的供体，而cDC1尤其是驻留的CD8α⁺DC始终是最佳接受者(图3D). 通过测量双倍体来评估，所有人群在相似水平上形成了接触，这表明受调控的是转移而不是接触(图S3A–B类). 我们还进行了一种竞争性的曼卡拉试验，其中所有四种受体细胞类型都出现在同一孔中，以评估优势。这里，产生最高转移程度的供体细胞类型不太一致，但常驻cDC1CD8α⁺DC总是积累了大部分材料，因此是最好的接受者(图3E). 虽然两种分析都规定了CD8α⁺DC上级接收人在体外，这可能会缓和体内其中特定DC亚群的定位和数量可能起作用，我们确实测量了常驻CD11b⁺DC是这些囊泡的重要受体体内(图1F).

接下来，我们改变了曼卡拉试验来检查机制。首先，我们发现，当种群被跨阱隔开时，转移就被废除了(图3F)这表明该系统中的抗原既不以可溶性形式传递，也不以外泌体形式传递，这与之前使用在体外生成的骨髓来源树突状细胞（BMDC）(Kleindienst和Brocker，2003年). 接下来我们应用药理学扰动。在这里，我们从受体池中清除了迁移的cDC1，因为它们以前被确定为较差的受体，而且很难净化足够数量的cDC2。我们发现二甲基氨氯（DMA），一种外泌体分泌抑制剂(Marleau等人，2012年)，对抗原传递没有影响，这表明在我们的系统中，抗原转移不需要外泌体的释放(图S3C). 我们进一步发现PI3K I类（GDC0941）或III类（VPS34-IN1）抑制，阻止吞噬，强烈抑制CD8α⁺cDC1摄取，对其他受体类型的影响较小(图S3D–E类). CD8α⁺DC先前被描述为比cDC2更具吞噬性，这可能也解释了它们在囊泡“接收”中的优势在体外(图3E) (Iyoda等人，2002年;Smith和Fazekas de St Groth，1999年;Wakim和Bevan，2011年). 这表明不同的DC可能依赖于不同的囊泡获取机制。然而，由于这些细胞生物学途径的普遍使用，我们尚未确定一种系统耐受性良好的抑制剂体内因此，需要更多的工作来定义这个过程的细微差别，并使体内审讯。

我们还通过添加zVAD（阻断半胱氨酸天冬氨酸酶活性）来研究DC凋亡在囊泡转移中的作用。我们没有看到任何组合对转移的影响(图3G)尽管供体DC亚群存活率增加(图S3F). 与先前研究中使用的BMDC不同，来自tdLN的DC也显示出较低的凋亡率，这表明DC的高死亡率体外和体内可能不代表抗原转移的主要来源体内DC人群(图3H). 最后，我们试图研究LFA-1在肿瘤抗原转移中的作用(Gurevich等人，2017年). 我们将B16ZsGreen肿瘤植入LFA1缺乏的小鼠体内，发现LFA-1对于将抗原运输到常驻DC来说是不必要的，这表明LFA1需求是上下文相关的，或者LFA1缺乏改变了DC:T细胞聚集，其他组以前使用的抗原转移读数(图S3G–H（H）).

DC在tdLN中形成紧密的动态异型相互作用

由于跨阱阻断了囊泡转移，我们探索了转移需要直接细胞接触的假设。迄今为止，髓样-髓样体相互作用尚未得到很好的记录，因此我们设计了一种实时、双光子成像策略来研究切除的tdLN的滤泡间T细胞区中的这些相互作用。这里，我们使用了携带XCR1-V基因的小鼠(Ohta等人，2016年)，CD11c-m樱桃(Khanna等人，2010年)和MacBlue(Ovchinnikov等人，2008年)转基因在很大程度上区分这里研究的关键人群，即：金星⁺m樱桃色⁺=cDC1，m樱桃⁺=cDC2，CFP⁺=单核细胞和部分mCherry⁺CFP公司⁺=常驻cDC2(图4A,图S4A). 细胞在tdLN内持续运动，因此我们测量了结合的持续时间，由一种细胞类型的荧光边缘落在另一种细胞的1μm内定义(图4A) (Cai等人，2017年). 种群间相互作用的结果时间最好用两阶段指数衰减建模。所有触点对的第一相都有T^1/2<60秒，可能代表持续运动(图4B). 第二阶段发生在DC之间约20%的接触中，并显示出更长的T^1/2约240秒，持续时间可能超过10分钟(图4B–C类)提供证据证明DC有时会进行更多实质性接触。值得注意的是，只有约5%的单核细胞：直流接触经历了第二阶段的衰退(图4B–C类).

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图4。

树突状细胞异型相互作用图谱显示建立了持久的动态突触接触

（A） 肿瘤引流淋巴结（tdLN，顶部）髓样细胞三报告基因（XCR1-Venus，CD11c-mCherry，CSF1R-CFP）表达的文氏图。B16Zs绿色荷瘤三报告小鼠tdLN外植体的代表性多光子显微镜图像（底部）。图像是ZsGreen的时间进程⁺XCR1-V菜单⁺tdLN中的细胞接触和其他髓细胞接触。带标签的箭头表示交互。（B） 髓系细胞在tdLN内的相互作用时间。Inset在视图中缩放以显示细节。灰色线是最适合2相指数衰减的线。绿色方框表示衰变的第二阶段。（C） 相互作用时间半衰期（T^1/2)DC:DC相互作用和DC:monocyte（Mono）。3个实验的代表。图为平均值T^1/2第二相衰减+/-SEM。n=5。学生t检验，*p<0.05。（D） 分选CD103交互界面点阵光片（LLS）图像⁺膜td番茄（mT）小鼠DC和CD8α⁺来自膜GFP（mG）小鼠的DC。白框是接口位置。热图表示与参考z切片的距离（深蓝色=0）。界面打开（黑色箭头）并旋转。用彩色圆点和虚线表示并列位置。（E） LLS图像显示mG的膜接近性⁺CD8α⁺常驻DC（绿色）和mT⁺CD103型⁺DC（红色）。白框是作为z切片的交互曲面（右）。比例尺=5μm。（F） E中单个细胞z切片，带膜交换（白色箭头）。比例尺=5μm。另请参见 图S4和视频S2–第5章.

为了研究这种DC-DC交互的细节，我们使用了高分辨率、实时、LLS在体外(Cai等人，2017年)使用来自小鼠的tdLN DC，在小鼠的细胞膜上用荧光标记基因。这揭示了DC-DC界面共构象的一致性，其中一些形成了稳定的接触(图4D–F类,图S4B–C类,视频S2). 在分析的6/16个突触中，我们观察到最小的膜结合，表面互补性很小（“球对球”，图S4B). 然而，10/16个突触显示了结合，如图4D,视频S2、和图S4C当分离和旋转时，其显示出“杯切”结构（即每个膜在触点中心凹陷）。在一个例子中，我们发现一个手指状的突起物伸入杯中，这可能代表额外的瞬态相互作用(图S4C). 这些图像的总和表明，当直流电相互接触时，可能会导致持续的紧密膜-膜并置(图4D–F类,图S4B–C类,视频S2–4). 值得注意的是，LLS观察到的突触也显示了膜材料交换的证据（如箭头所示图4F,视频S5,图S4D).

肿瘤抗原在突触接触处DC之间转移

因此，我们假设细胞与细胞接触可能是细胞对细胞肿瘤抗原囊泡转移的重要机制。为了研究囊泡是否确实在这些接触处转移，我们首先对囊泡进行成像在体外分析来自图3D使用具有更宽视野的传统共焦显微镜(图5A). 抗原载CD103⁺观察到DC形成接触，然后在没有分泌中间体的情况下将其部分ZsGreen货物转移到受体(图5A,视频S6). 转移是罕见的，在典型的8–10小时成像中，不到1%的接触者发生转移，但我们观察到，转移是以接触介导的囊泡交换方式发生的，适用于所有受体组合：供体（数据未显示）。我们还观察到ZsGreen负载的CD103⁺DC依次通过小泡到多个CD8α⁺直流电(视频S7)这表明该过程可以重复，并且细胞可以通过抗原，同时在通过之前和之后都保持活力。在超过48小时的总成像中，受体DC总是在细胞接触的情况下获得抗原，而从未观察到无细胞/凋亡碎片的摄取(图5B).

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图5。

接触介导的抗原切换增强逐步的肿瘤抗原级联

（A） 图像显示ZsGreen⁺CD103型⁺DC（绿色）从B16ZsGreen肿瘤引流淋巴结（tdLN）和细胞核tdTomato中分类⁺（nT）CD8α⁺常驻DC（红色）从稳态nTnG鼠标中分类。用虚线标记的2个单元格。传输事件在中间面板中。比例尺=5μm。（B） ZsGreen摄取采集模式（碎片摄取与DC:DC传输）通过实时成像进行量化，如A.n=6。（C） 来自B16ZsGreen，XCR1-Venus的tdLN的多光子成像；CD11c-m樱桃；MacBlue老鼠。仅显示了Venus和mCherry频道。Zs绿色⁺囊泡浮出水面（绿色）；显示了时间进程。比例尺=10μm。（D） ZsGreen摄取采集模式（碎片摄取与DC:DC传输）通过实时成像进行量化，如C.n=3。（E） 在诱导表达ZsGreen后，在肿瘤细胞（F）和tdLN（G）内的F-G（F-G）中诱导ZsGreenB16肿瘤实验。献祭前开始三苯氧胺治疗的天数。%最大ZsGreen计算为ZsGreencells的平均频率，归一化为每种细胞类型ZsGreene累积的平均最大百分比（设置为100%）。图为平均值%Max ZsGreen+/−SEM。n=6–10。3个独立实验的代表。统计分析是单样本、双面、Student t检验，以确定哪一天某一细胞类型的ZsGreen量达到统计上的0%以上，*p<0.05，**p<0.01。另请参见 视频S6–第8节.

检查抗原转移体内我们对XCR1-Vinus的tdLN进行了多光子显微镜观察；CD11c-樱桃；带有B16Zs绿色肿瘤的MacBlue小鼠。一个例子(图5C(视频S8))显示cDC2（CD11c-樱桃⁺)将ZsGreen传输到cDC1（XCR1-Venus⁺). 作为在体外在一部典型的30分钟电影中，总的转移频率是罕见的，但大约75%的成像实验导致了至少一次可检测的转移事件，这种转移事件总是发生在接触时，而不是通过无DC的外泌体或凋亡体发生(图5D).

肿瘤抗原依次级联进入肿瘤内的髓细胞群和tdLN

直接细胞接触可以预测抗原在髓系人群中的顺序填充，因为细胞会直接传递给其他细胞，而不是以相同的速度填充所有的隔室。为了测试这个体内，我们生成了一个mCherry⁺可使用三苯氧胺调节的Cre诱导表达ZsGreen的B16F10系将可追踪抗原脉冲输入系统(图5E). 在交错的时间点用三苯氧胺灌胃携带这种肿瘤细胞系的小鼠。然后检测肿瘤和tdLN的ZsGreen荧光(图5E). 在肿瘤中，细胞以独特的动力学获得了ZsGreen：中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞最大程度地变成了ZsGreen⁺与肿瘤本身几乎一致，最多在第5天(图5F). 肿瘤患者DC负荷动力学更持久，最大负荷发生在第7天(图5F). 尽管tdLN小鼠之间的变异性更大，但有一个明确的层次结构，其中只有迁移DC种群在第3天被显著加载，此后继续增加(图5G). 相反，在第5天之前，未观察到常驻DC的负荷。最后，仅在第7天检测到含有ZsGreen的单核细胞和微粒（MP）(图5G).

实验模型和受试者详细信息

方法详细信息

我们感谢D.Hume提供MacBlue老鼠；T.Kaisho提供XCR1-Vinus小鼠；J.Cyster为我们提供抄送2^−/−老鼠。我们感谢A.Gérard在发展移植性LN成像方面所做的初步工作。K.Corbin寻求早期技术援助。Krummel实验室、BIDC和A.Denton的所有成员进行讨论和支持。

基金：这项工作得到了MKR和EWR癌症研究所博士后奖学金的部分支持，NIH向MKR授予5T32AI007334-28，向NKS授予人类前沿科学项目奖学金LT000061/2018-L，向MFK授予U54CA163123、5U01CA217864、R21CA191428和R01CA197363。我们感谢PFCC协助生成流式细胞术数据。这里报告的研究部分得到了DRC中心拨款NIH P30 DK063720和NIH S10仪器拨款S10 1S10OD018040-01的支持。