公共卫生病毒学实验室SARS-CoV-2传播的综合分析
,1,† ,1,2,† ,1 ,1,三 ,1 ,1 ,1,三 ,1,三和1,三，*
2以色列卫生部以色列疾病控制中心，以色列Tel-Hashomer，邮政信箱5265601
三以色列特拉维夫大学萨克勒医学院公共卫生学院流行病学和预防医学系，邮政信箱39040
†这些作者为这项工作做出了同等贡献。
2020年7月9日收到；2020年7月31日验收。
- 补充资料
GUID:54F62744-7FD9-4E59-AFAE-E2EBAF6EFF8E
摘要
截至2019年12月，SARS-CoV-2已成为全球关注的主要问题，尤其影响到医护人员。由于人与人之间的传播是通过空气传播的，拥挤的封闭空间极有可能导致病毒快速传播，尤其是在大流行早期，社交距离和戴口罩不是强制性的。本回顾性研究彻底调查了2020年3月中旬在以色列中央病毒学实验室（ICVL）发生的一次小型SARS-CoV-2疫情，其中6名工作人员和2名相关家庭成员受到感染。通过SARS-CoV-2阴性实时聚合酶链反应（PCR）的工作表面刷洗试验，消除了ICVL设施中受污染表面感染的怀疑。对完整的SARS-CoV-2基因组进行了测序，突变分析显示所有样本都包含在分支20B和20C中，具有尖峰突变D614G。系统发育分析澄清了传播事件，确认S1感染了至少三名其他工作人员，并驳斥了工作人员的受感染配偶与ICVL传播集群的关联。最后，血清学测试显示，所有感染者都有IgG和IgA抗体，并显示其他工作人员出现了无症状感染。本研究证明了分子流行病学在阐明传播事件方面的优势，并举例说明了良好的实验室实践、距离和戴口罩在预防SARS-CoV-2传播，特别是在医疗设施中的重要性。
关键词：2019-nCoV、SARS-CoV-2、COVID-19、工作人员、感染、下一代测序（NGS）
1.简介
SARS-CoV-2（严重急性呼吸综合征冠状病毒2）是2019年12月在中国武汉出现的一种新型冠状病毒[1]并在中国和世界许多国家迅速传播，导致严重的呼吸道疾病，导致大量的发病率和死亡率[2,三,4,5,6]. 由于人与人之间的传播以及目前缺乏疫苗接种和有效治疗方案，这种新型病毒对世界范围内的人类健康构成潜在威胁，是一个重大的全球健康问题[三,7]. 包括Nextstrain在内的命名系统提出了主要的SARS-CoV-2全球分支[8]以及共享所有流感数据的全球倡议（GISAID，https://www.gisaid.org) [9]. 这些是基于GISAID中提交的57000个以上序列的病毒基因组[9]. 例如，使用Nextstrain的命名法，目前有五个主要分支：19A（根分支）和19B，以及在欧洲广泛分布的分支20A、B和C，包括与感染性增加和病毒载量增加相关的尖峰蛋白D614G的突变[10].
自20世纪60年代末以来，非SARS-CoV-2人类冠状病毒在全球范围内传播[11,12]. 以色列冬季SARS-CoV-2的当前传播速度尚不清楚；然而，对2015-2016年冬季以色列样本的分析表明，这些样本与其他常见呼吸道病毒同时传播，其中10%的人冠状病毒阳性病例[13].
正在使用实时聚合酶链式反应（RT-PCR）评估以色列和世界各地普通人群中的严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型的传播情况。SARS-CoV-2基因特异性RT-PCR诊断试验的快速发展使得对可疑个体进行快速准确的实验室检测成为可能[14]. 这些测试在以色列中央病毒学实验室（ICVL）进行了成功评估，从2月底第一例SARS-CoV-2输入以色列到2020年3月中旬，对SARS-CoV 2疑似样本进行了专门检查。从以色列的第一个疑似样本开始，ICVL设施中收到的所有样本均按照最严格的安全指示和BSL2+安全条件进行处理[15,16]. 截至2020年3月中旬，以色列所有SARS-CoV-2阳性病例均在指定的检疫设施中隔离；然而，当时在以色列，社会疏远和强制戴面具并不是一种习惯或强制行为。
根据基于调查的流行病学调查推测，2020年3月中旬，在ICVL中发现了几例严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型感染病例，其中一些可能来自一名受感染的工人。SARS-CoV-2空中传输被证明是所有传输路径中最有效的[17,18]甚至在症状前阶段也有传染性[19,20]，这样无声的病毒很容易传播。在SARS-CoV-2传播的早期阶段，工作场所的感染是以色列常见的传播途径，在ICVL爆发的情况下，当时拥挤的工作场所以及缺乏社交距离和戴口罩可能是促成感染的原因。
本研究通过检查受感染的ICVL工作人员、几个流行病学相关的家庭成员和ICVL设施的工作场所，彻底调查了当地SARS-CoV-2 ICVL疫情。应用SARS-CoV-2全基因组下一代测序（NGS）、RT-PCR、血清学测试和系统发育树分析阐明人对人传播事件，绘制个体和常见突变图，并检查有关污染表面的怀疑。这项研究证明了基于完整病毒基因组的分子流行病学在阐明人对人传播方面的附加价值，通过血清学测试揭示了非症状性ICVL工作人员的无声感染，并确认ICVL中遵守的严格安全规定很可能阻止了病毒的进一步传播。
2.材料和方法
2.1. 样品采集、核酸提取和实时PCR病毒基因组定量
在2020年3月15日发现第一例ICVL感染病例（S1）后，立即采集了所有56名ICVL工作人员和大约在这个时候在实验室工作的另外10名非ICVL工作人员的鼻咽拭子，其中大部分在同一天，少数在第二天。该综合筛查试验只进行了一次。为ICVL工作人员对有症状的个人进行了额外测试(n个=1），有症状的亲属(n个=2）或要求在实验室工作的基本工人(n个= 2). 根据制造商说明，使用MagNA PURE 96（德国曼海姆罗氏）从200µL的呼吸样品中提取病毒基因组，并使用与SARS-CoV-2包膜（E）基因对应的引物进行qRT-PCR反应，如前所述[14]. 所有样本都进行了人类RNAseP基因检测，该基因作为家政基因。在ABI 7500仪器上使用TaqMan Chemistry在25µL Ambion Ag-Path Master Mix（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德市生命科技公司）中进行定量逆转录PCR（qRT-PCR）反应。取SARS-CoV-2阳性工作人员（S1–S6）和相关家庭成员（S7-S4的配偶和S8-S3的配偶）的核酸提取样品进行进一步的分子分析。
2.2. 临床标本SARS-CoV-2的特异性扩增
按照制造商的说明，使用SuperScript IV（ThermoFisher Scientific，Waltham，MA，USA）将提取的核酸中的RNA反向转录为单链cDNA。使用设计用于捕获SARS-CoV-2全基因组的SARS-CoV 2特异性引物（第1版共218个引物，分为两个引物库，由ARTIC Network的Josh Quick设计）生成双链cDNA，并使用Q5热启动DNA聚合酶（NEB）通过PCR进行扩增[21]. 简单地说，每个样品都用引物池1或2和5X Q5反应缓冲液、19 mM dNTPs和无核酸水进行了两次PCR反应。按照制造商的说明，将结果DNA与Qubit dsDNA-BR检测试剂盒（ThermoFisher Scientific）进行组合和定量，并将每个样品5µL的1ng扩增子DNA带入文库制备中。
2.3. 文库准备和排序
根据制造商的说明，使用NextraXT库准备试剂盒和NexteraXT索引试剂盒V2准备库（Illumina，San Diego，CA，USA）。用AMPure XP磁珠（Beckman Coulter，Brea，CA，USA）纯化文库，并用Qubit dsDNA HS检测试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA，）测量文库浓度。TapeStation 4200通过DNA HS D1000试剂盒（安捷伦，加州圣克拉拉，美国）测定了文库验证和平均片段大小。正如预期的那样，平均片段大小约为400 bp。计算文库平均碎片大小和浓度摩尔浓度，并将每个文库稀释至4 nM。将文库合并、变性并稀释至10pM，然后用V3 2X300 bp运行试剂盒（Illumina）在MiSeq上测序。GISAID中提供了序列（登录号：EPI_ISL_435284、EPI_ISL_435286、EPI.ISL435287、EPI/ISL435289、EPI-ISL435291、EPI_ISL_435292、EPI_L447250、EPI_ESL447251）。
2.5. 擦拭测试取样
在第一例ICVL感染病例（S1）确诊后，立即采集六份样本（详见)使用∑-Virocult（Medical Wire，Corsham，UK）病毒传输介质从ICVL中的所有SARS-CoV-2相关表面和设备中获得[34]. 其中三个样品取自生物安全柜（BSC），所有可疑SARS-CoV-2都在该柜中打开，而其他三个样品则取自这些设施的所有其他表面，包括门把手、房间内所有设备的外表面等，特别注意“高接触区域”。如上所述，使用qRT-PCR对所有样本进行SARS-CoV-2检测。
表1
| 样品编号。 | 设施 | 取样设备 |
|---|
| 1 | 样本接收区 | 房间内的所有工作面和设备，包括旋钮、椅子、门等。 |
| 2 | 样本接收区 | 生物安全柜（BSC）内外表面 |
| 三 | 样本取样室#1 | 房间内的所有工作面和设备，包括旋钮、椅子、门等。 |
| 4 | 样品取样室#1 | BSC外表面和内表面 |
| 5 | 样品取样室#2 | 房间内的所有工作面和设备，包括旋钮、椅子、门等。 |
| 6 | 样品取样室#2 | BSC外表面和内表面 |
2.6. 血清学
使用所述制备的抗原通过内部ELISA检测SARS-CoV-2的IgG和IgA抗体[35]. 对于ELISA，在4°C下用1µg/mL RBD抗原包被96孔微量滴定板（Nunc，Thermo，Roskilde，Denmark）过夜，用于检测IgG，用2µg/mL用于检测IgA抗体。在25°C下用5%脱脂奶封闭60分钟后，将人血清样品（用3%脱脂奶稀释1:100）添加到抗原包被孔中。将平板在25°C下培养120分钟，将洗涤过的山羊抗人IgG辣根过氧化物酶（HRP）共轭物（Jackson ImmunoResearch，Philadelphia，PA，USA）（稀释比例为1:15000）或抗人Ig A HRP共轭物（Abcam，Cambridge，MA，USA在450 nm处测量每个孔的外径。ELISA指数值低于0.9为阴性，介于0.9和1.1之间，模棱两可且相等，高于1.1为阳性。在一项验证研究中，包括从309名SARS-CoV-2感染者和324名健康未感染者中采集的633份血清样本，IgG的特异性和敏感性分别为98%和88%，IgA的特异性和敏感性分别是98%和80%。
3.结果
3.1. SARS-CoV-2特异性qRT-PCR检测确定SARS-CoV2阳性ICVL工作人员及其亲属
在确认ICVL工作人员S1中的SARS-CoV-2后，于2020年3月15日和次日对所有ICVL人员和相关家庭成员进行了SARS-CoV 2特异性qRT-PCR分析。只有另外两名工作人员SARS-CoV-2检测呈阳性()-S2具有相对较高的循环阈值（Ct）（Ct=33.07），S3具有较低的Ct（Ct=18.77）。几天后，即3月23日，国际VL组织另外两名工作人员S4和S6的SARS-CoV-2检测呈阳性（Ct=26和22）。3月29日，在所有自我隔离的ICVL工作人员返回实验室之前，作为预防测试，对他们进行了额外的qRT-PCR检测。令人惊讶的是，另一名ICVL人员-S5检测呈阳性（Ct=28.58），尽管没有症状。
表2
|
| 案例特征 | 排序参数 |
|---|
| 样品编号。 | SARS-CoV-2细胞 | IgG/IgA值 | 年龄 | 日期
检测 | 估计感染日期* | 变速箱
链条 | #已映射
读取 | %覆盖范围 | 平均深度 |
|---|
|
S1（第一阶段）
| 14.3 | 3.36/3.34 | 55 | 15.3.20 | 未知的 | ICVL接口 | 3,806,897 | 100 | 6095 |
|
S2系列
| 33.07 | 4.87/13.86 | 65 | 15.3.20 | 未知的 | 不适用 | 5,096,580 | 98 | 5357 |
|
第3章
| 18.77 | 4.52/5.9 | 46 | 15.3.20 | 10.3.20 | 不适用 | 3,495,706 | 99.65 | 5501 |
|
S4系列
| 26 | 4.77/6.77 | 39 | 23.3.20 | 14.3.20 | ICVL接口 | 1,739,690 | 99.24 | 4713 |
|
第5章
| 28.58 | 4.71/1.83 | 61 | 29.3.20 | 14.3.20 | ICVL接口 | 1,419,044 | 99.96 | 4958 |
|
S6系列
| 22 | 4.75/1.76 | 41 | 23.3.20 | 14.3.20 | ICVL接口 | 3,380,868 | 99.90 | 6014 |
|
第7页
| 24 | 6.69/2.1 | 41 | 29.3.20 | 14.3.20 | 不适用 | 8,580,675 | 99.99 | 40,466 |
|
第8节
| 22 | 7.17/10.23 | 52 | 18.3.20 | 10.3.20 | 不适用 | 9,498,576 | 100 | 45,041 |
S3（S8）的配偶在接触经验证的SARS-CoV-2病毒后出现症状，因此于3月18日进行了检查，结果呈阳性（Ct=22）。S4（S7）的配偶也出现症状，3月29日被发现呈阳性（Ct=24）。所有感染者的年龄范围为39至65岁，无症状或表现出轻微症状(). 对每个感染者进行了基于调查的流行病学调查（数据未显示），并推断了估计的感染日期。无法获得每个工人或相关家庭成员的有关传播的确切信息。然而，在ICVL传播链中，根据流行病学调查，患者S1被确定为感染了多人。
3.2. 基于全基因组测序的分子流行病学分析传播事件
为了从分子上推断ICVL局部疫情中的传播，使用特定引物在ICVL工作人员和相关家庭成员的所有SARS-CoV-2阳性样本中扩增SARS-CoV 2，并通过Illumina技术对每个样本的全基因组进行测序。所有样本的覆盖率均大于99%，平均测序深度为13583，S2除外，其覆盖率为98%，这可能是由于高循环阈值（Ct）值（即较低的病毒量）().
构建了一个系统发育树来描述所有样本之间的关系。所有测序的样品都与第20分支相关，包含该分支的突变A23403G和C14408T（Nextstrain命名法[8]). ICVL的所有工作人员都表现出20C链定义突变G25563T和C1059T。S8（S3的配偶）缺少20C突变之一C1059T；有趣的是，S7（S4的配偶）表现出三个额外的突变，G28881A、G28882A和G28883C，它们与20B分支相关。S1、S4和S5具有相同的序列()而S6仅表现出一种差异，即在nsp12-G15243T中观察到的唯一突变(和). 鉴于基于调查的流行病学调查确定S1的感染日期比S4、S5和S6早()这些结果证实，S1至少感染了其他三名ICVL工作者（S4、S5和S6）。与相同的S1、S4和S5序列相比，另外两个ICVL成员S2和S3分别表现出两个和一个差异()，以及具有准谱特征的其他混合核苷酸差异(表S1). 虽然他们与ICVL成员S1、S4和S5共享20C链定义突变C1059T，但这与非ICVL的成员S7和S8产生了高置信度分裂（bootstrap值为73%，)考虑到S2和S3的额外突变可能是单独获得的，也可能是从不同的传输链获得的，因此不能将其置于ICVL传输链中。S8被放在20C分支中，这是因为除了其自身独特的突变外，所有ICVL成员G25563T都有一个共同的突变。然而，由于来自相关但不同分支20B的两个突变，S7被置于ICVL传输链之外。除了从GISAID下载的25个随机选择的基于以色列的样本外，还包括ICVL工作者和家庭成员样本的大规模系统发育树进一步支持了这些结论，其中S7与88%置信度的非ICVL样本一起放置(图S1).
ICVL局部暴发的全基因组系统发育树。(A类)六个ICVL样本（S1–S6）、两个家族相关样本（S7–S8）和SARS-CoV-2参考序列（NC 045512.2）的系统发育树。基于GTR+I+G进化模型，采用最大似然法推导出树。分支模式的健壮性通过1000次引导复制进行了测试，成功的引导复制百分比显示在节点上，其中仅显示>70%的值。每个分支显示了分离样品的突变位置，并指示了相应的20B和20C分支（根据Nextstrain命名法）。(B类)样本相似性聚类，根据hamming距离（为每对样本计算的整个基因组序列中不同核苷酸的数量）计算。红色代表最小的差异，白色代表最大的差异。还指出了差异的数量。
表3
| 基因 | Clade公司 | Nuc（数字）# | 裁判 | S1（第一阶段） | S2系列 | 第3章 | S4系列 | 第5章 | S6系列 | 第7页 | 第8节 | AA公司# | 裁判 | S1（第一阶段） | S2系列 | 第3章 | S4系列 | 第5章 | S6系列 | 第7页 | 第8节 | 转/秒 | AA集团 |
|---|
|
5英尺UTR
| | 241 | c（c） |
t吨
|
t吨
|
t吨
|
t吨
|
t吨
|
t吨
|
t吨
|
t吨
| - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
|
NSP2号机组
| 20摄氏度 | 1059 | c（c） |
t吨
|
t吨
|
t吨
|
t吨
|
t吨
|
t吨
| c（c） | c（c） | 85 | T型 |
我
|
我
|
我
|
我
|
我
|
我
| T型 | T型 | R（右） | 水解（T）、脂肪族（I） |
|
NSP3号机组
| | 3037 | c（c） |
t吨
|
t吨
|
t吨
|
t吨
|
t吨
|
t吨
|
t吨
|
t吨
| 107 | F类 | F类 | F类 | F类 | F类 | F类 | F类 | F类 | F类 | S公司 | 芳香族（F） |
|
| | 3651 | 一 | 一 |
克
| 一 | 一 | 一 | 一 | 一 | 一 | 311 | 问 | 问 |
R（右）
| 问 | 问 | 问 | 问 | 问 | 问 | R（右） | 氨基（Q），碱性（R） |
|
|
| 5541 | 一 | 一 | c（c） | 一 | 一 | 一 | 一 | 一 | 一 | 941 | 问 | 问 |
P（P）
| 问 | 问 | 问 | 问 | 问 | 问 | R（右） | 氨基（Q）、脯氨酸（P） |
|
NSP12号机组
| 20亿 | 14408 | c（c） |
t吨
|
t吨
|
t吨
|
t吨
|
t吨
|
t吨
|
t吨
|
t吨
| 314 | P（P） | L（左） | L（左） | L（左） | L（左） | L（左） | L（左） | L（左） | L（左） | R（右） | 脯氨酸（P），脂肪族（L） |
|
| | 15243 | 克 | 克 | 克 | 克 | 克 | 克 | t吨 | 克 | 克 | 601 | C | C | C | C | C | C |
F类
| C | C | R（右） | 芳香族半胱氨酸（C） |
|
NSP13号机组
| | 16626 | c（c） | c（c） | c（c） |
t吨
| c（c） | c（c） | c（c） | c（c） | c（c） | 131 | L（左） | L（左） | L（左） | L（左） | L（左） | L（左） | L（左） | L（左） | L（左） | S公司 | 脂肪族（L） |
|
NSP14号机组
| | 18887 | c（c） | c（c） | c（c） | c（c） | c（c） | c（c） | c（c） | c（c） |
t吨
| 280 | L（左） | L（左） | L（左） | L（左） | L（左） | L（左） | L（左） | L（左） | L（左） | S公司 | 脂肪族（L） |
|
斯派克
| 20亿 | 23403 |
一
|
克
|
克
|
克
|
克
|
克
|
克
|
克
|
克
| 614 | D类 |
G公司
|
G公司
|
G公司
|
G公司
|
G公司
|
G公司
|
G公司
|
G公司
| R（右） | 酸性（D）、脂肪族（G） |
|
ORF3a型
| 20摄氏度 | 25563 | 克 |
t吨
|
t吨
|
t吨
|
t吨
|
t吨
|
t吨
| 克 |
t吨
| 58 | 问 |
H（H）
|
H（H）
|
H（H）
|
H（H）
|
H（H）
|
H（H）
| 问 |
H（H）
| R（右） | 碱性（H），氨基（Q） |
|
NUCAP公司
| 20亿 | 28881 | 克 | 克 | 克 | 克 | 克 | 克 | 克 |
一
| 克 | 203 | R（右） | R（右） | R（右） | R（右） | R（右） | R（右） | R（右） |
K（K）
| R（右） | R（右） | 基本（R/K） |
|
| 20亿 | 28882 | 克 | 克 | 克 | 克 | 克 | 克 | 克 |
一
| 克 | 204 | R（右） | R（右） | R（右） | R（右） | R（右） | R（右） | R（右） |
K（K）
| R（右） | R（右） | 基本（R/K） |
|
| 20亿 | 28883 | 克 | 克 | 克 | 克 | 克 | 克 | 克 |
c（c）
| 克 | 204 | G公司 | G公司 | G公司 | G公司 | G公司 | G公司 | G公司 | R（右） | G公司 | R（右） | 脂肪族（G），碱性（R） |
3.3. 传播链内SARS-CoV-2全基因组的突变
为了评估基因组上的突变位置，将ICVL相关序列与SARS-CoV-2参考基因组对齐(｛“type”：“entrez nucleotide”，“attrs”：｛“text”：“NC_045512.2”，“term_id”：“1798174254”，“term_text”：“NC_045512.2”｝NC_045512.2号)并列举了整个基因组的突变并评估了其影响。总之，在SARS-CoV-2基因组的5′UTR、nsp2、nsp3、nsp12、nsp13、nsp14、spike、orf3a和核衣壳区域中观察到14个突变(和). 按照规定，7/14突变与20B和20C分支相关()与参考序列（C241T、C3037T、C14408T、A23403G）相比，在所有序列中检测到4/14个突变，其余突变（3/14）在S2、S3、S6、S7和S8中唯一观察到(). 翻译区中的10/13突变导致氨基酸替换（R），8/13突变也导致氨基酸（AA）分类组发生变化，可能对产生的蛋白质具有更大的构象或结构影响。3/13突变是沉默的（S），也就是说，没有导致氨基酸的变化，这些突变大多转化为脂肪族AA组中的一种氨基酸。S2和S3序列中唯一观察到的其他变化包括核苷酸混合物，很可能是准谱引起的(表S1). 总的来说，这些结果表明，在基因组的各个区域都有活跃的突变积累——一些突变是在一些个体中唯一观察到的，而另一些突变是分支相关突变，也在全球数千个样本中观察到，这证明了它们在人与人之间传播后的稳定性。
SARS-CoV-2全基因组突变多样性。沿着基因组观察到的所有突变及其频率，由归一化熵确定，其中熵=0代表一个不变的位点，熵=1代表一个所有状态以相同概率发生的位点。UTR-非翻译区，ORF-开放阅读框，S-spike，E-envelope，M-膜，N-核衣壳。
3.4. 实验室表面SARS-CoV-2检测的擦拭试验
为了排除表面感染源，我们对ICVL设施中的相关表面进行了取样，并通过qRT-PCR对其进行了SARS-CoV-2检测(). 所有BSC均与其他表面分开取样，因为内表面的SARS-CoV-2阳性BSC并不一定表明BSC是实验室工作人员的感染源。所有检查的表面SARS-CoV-2检测均为阴性，包括BSC外的高度接触区域，证实他们与感染无关。尽管发现所有表面均为SARS-CoV-2阴性，但作为预防措施，整个ICVL设施在关闭后立即彻底净化。
3.5. 国际VL所有工作人员及其亲属的血清学分析
返回实验室后，立即对所有56名ICVL工作人员和受感染配偶（S7和S8）的血清进行了血清学分析。分析结果明确表明，所有经验证的SARS-CoV-2阳性工作人员及其配偶（S1–S8）均具有高水平的SARS-CoV-2 IgG和IgA抗体。令人惊讶的是，另外三名ICVL工作人员的SARS-CoV-2 IgG和IgA检测也呈阳性，尽管与经验证的SARS-CoV-2个人相比，其IgA水平较低（数据未显示），另外三位工作人员的IgA仅为中等水平和阳性水平（数据未示出）。所有其他ICVL工作人员SARS-COV-2 IgG和IgA检测均为阴性。总的IgG和IgA阳性率分别为14.2%和16%。
4.讨论
自2019年12月以来，SARS-CoV-2的传播已成为全球关注的重大问题。规模较小但意义重大的疫情导致全世界许多实验室、医院病房和诊所在最需要的时候关闭。根据以色列卫生部根据疾病控制和预防中心（CDC）的建议，在ICVL疫情爆发的情况下，所有相关工作人员都进行了SARS-COV-2检测，并在确认第一名受感染工人后立即被送往家中隔离14天[36,37,38]. 检疫结束返回实验室后，进行了额外的测试。在14天隔离期内，另外三名ICVL工作人员SARS-COV-2检测呈阳性，其中一人在隔离第14天被确认，但两天前检测呈阴性。据报道，SARS-CoV-2的中位潜伏期为5天[2,39]. 由于稍后检测到的病例很少（约1%），因此暴露个体的隔离期设置为14天，而14天后检测到进一步症状感染的可能性很小[39,40].
流行病学调查，特别是在医疗环境中，对于审查和纠正法规以避免类似的未来情况至关重要。在ICVL爆发的情况下，基于问卷的流行病学调查无法追踪实验室中每个感染者的确切行踪，也无法确定确切的人与人之间的接触。作为预防措施，ICVL的所有工作人员都被送去接受为期14天的家庭隔离，实验室也被关闭，导致2020年3月中旬SARS-CoV-2在以色列全国范围内的大量测试无法进行，当时SARS-CoV-2正开始在该国传播。在本研究中，分子流行病学的使用能够澄清传播事件，即确认S1感染了至少三名其他ICVL工作者（S4、S5和S6）。另外两名ICVL工作人员S2和S3被安置在与S1、S4、S5和S6集群相同的分支中。然而，他们展示的众多额外独特突变可能是通过内部病毒复制获得的，或者表明与本研究中未取样的不同传播链有关。分析还确定，ICVL工作者S4的配偶S7没有感染S4，并且可能与不同的传播链相关，这可以从仅在S7中发现的与不同分支相关的三个突变以及与ICVL传播链其余部分相关的高置信度分裂中得到证明。S8（S3的配偶）与其他ICVL成员G25563T仅共享一个20C分支突变，而缺乏另一个C1059T。鉴于，根据流行病学调查，除S3外，S8还与另一名SARS-CoV-2确诊患者接触，因此，S8不能肯定位于ICVL传播链中。或者，S8可能从两个不同来源感染病毒，并携带混合病毒群。
对每个样本累积的不同突变进行的彻底分析表明，在SARS-CoV-2基因组的几个位置/基因中，一些个体中的突变数量有限，而其他个体中的许多突变。S1–S4–S5簇和S6的相同序列表明，缺乏或数量有限的突变是传播的证据，与这些序列相比有一个差异。与全球分支20B和20C相关的突变表明，随着时间的推移，它们在选择事件中幸存下来，并且有更好的传播机会。事实上，与分支20相关的A23403G突变，也被称为D614G（根据突变在棘突蛋白氨基酸序列中的位置进行编号），最近在欧洲出现，现在是世界上最普遍的突变形式[10]. 其他突变在个体样本中观察到，并且代表了样本采集时个体中的病毒群。对这些突变性质的进一步研究表明，其中两个独特的突变是沉默的，即没有导致氨基酸的变化，而其他的是导致氨基酸变化的替换突变，在某些情况下还包括氨基酸的属性群，这可能导致所得蛋白质的变化。取决于这些突变是否对病毒有益，它们可能会存活并随时间传播，例如，新出现的支链20相关突变A23403G/D614G将棘突蛋白中的天冬氨酸（酸性基）转变为甘氨酸（脂肪族），这可能会提供更好的病毒适应性[10]. 由于每个突变的性质以及缺乏与该传播链相关的其他已知样本，很难确定在个体中唯一观察到的突变是否是树中未表示的不同传播链的一部分，或仅在采样时观察到的瞬时突变，不会随着时间的推移而存活。
在医疗机构爆发疫情时出现的另一个问题是，传播是由感染者还是从受感染的表面进行的。发现表面上的病毒剂存活数小时至数天[41]. 具体而言，据报道，SARS-CoV-2可在表面存活长达9天，具体取决于表面类型[42]. 由于在试管开盖阶段形成气溶胶，临床样品中的气溶胶传播在临床医院实验室中最为显著。尽管SARS-CoV-2的表面存活率相对较高，但其脂质膜使其易受临床实验室常用的所有消毒剂的影响[42,43]. 因此，良好的实验室消毒实践足以预防SARS-CoV-2实验室获得性感染。事实上，迄今为止，还没有报告SARS-CoV-2的实验室获得性感染[44]. 在ICVL中，所有处理样本的实验室表面的SARS-CoV-2阴性qRT-PCR证实了对受污染表面的怀疑，从而证实了此次局部疫情中的人对人传播。
鉴于SARS-CoV-2无声传播的新证据[45,46,47]对所有ICVL工作人员进行血清学测试，以检查ICVL设施的感染程度。所有确诊感染SARS-CoV-2的工作人员和相关家庭成员均为IgG和IgA阳性，在最后一次SARS-CoV-2阴性结果出现至少两周后进行了检测。这些结果与最新的出版物一致，这些出版物表明，79.8%的患者在发病后10至15天出现SARS-CoV-2的IgG抗体，并且在症状出现后19天内，100%的受试患者IgG呈阳性[48,49]. 令人惊讶的是，另有六名国际VL工作人员检测出一种或两种IgG/IgA抗体呈阳性，其中四人居住在当时SARS-CoV-2发病率较高的地区，尽管没有症状，但仍被感染，这支持了后来出现的低IgG抗体滴度。尽管进行了彻底的基于问卷的流行病学调查，但此次局部ICVL疫情的起源仍不清楚，尽管基于全基因组SARS-CoV-2测序的分子流行病学调查揭示了ICVL的人对人传播事件。此外，对处理样本的所有实验室表面进行SARS-CoV-2阴性qRT-PCR，消除了对受污染表面的怀疑，现在很明显，感染的性质是人对人传播。自那时以来，以色列和全世界都吸取并应用了SARS-CoV-2传播方面的经验教训，在那里，社交距离和戴面具现在是强制性的，并且在医疗机构中特别强制执行。
作者贡献
概念化、R.P.和N.S.Z。；方法论、O.E.、N.S.Z.、E.B.和Y.D。；软件，不相关；验证、O.E.、Y.L.和E.B。；形式分析，O.E.、N.S.Z.、M.M和E.B。；调查、O.M.和R.P。；资源，R.P。；数据处理，M.M。；书面原稿编制，N.S.Z.和R.P。；写作-评论和编辑E.M.、Y.L.和M.M。；可视化，M.M。；监督，E.M。；项目管理、M.M.和N.S.Z。所有作者均已阅读并同意手稿的出版版本。
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