热学。2020; 10(20): 9332–9347.
USP7靶向性通过对肺癌中肿瘤相关巨噬细胞的重新编程调节抗肿瘤免疫反应
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戴晓萌
1华中科技大学同济医学院协和医院肿瘤中心，武汉430022，中国。
李森路
1华中科技大学同济医学院协和医院肿瘤中心，武汉430022，中国。
苏克登
1华中科技大学同济医学院协和医院肿瘤中心，武汉430022，中国。
《惊书梦》
1华中科技大学同济医学院协和医院肿瘤中心，武汉430022，中国。
赵湾
1华中科技大学同济医学院协和医院肿瘤中心，武汉430022，中国。
Jing Huang（黄晶）
1华中科技大学同济医学院协和医院肿瘤中心，武汉430022，中国。
孙亚杰
1华中科技大学同济医学院协和医院肿瘤中心，武汉430022，中国。
颜虎
1华中科技大学同济医学院协和医院肿瘤中心，武汉430022，中国。
卞武
1华中科技大学同济医学院协和医院肿瘤中心，武汉430022，中国。
吴刚
1华中科技大学同济医学院协和医院肿瘤中心，武汉430022，中国。
乔纳森·洛弗尔
2纽约州立大学布法罗分校生物医学工程系，美国纽约州布法罗14260。
金洪林
1华中科技大学同济医学院协和医院肿瘤中心，武汉430022，中国。
杨坤瑜
1华中科技大学同济医学院协和医院肿瘤中心，武汉430022，中国。
1华中科技大学同济医学院协和医院肿瘤中心，武汉430022，中国。
2纽约州立大学布法罗分校生物医学工程系，美国纽约州布法罗14260。
*这些作者为这项工作做出了同等贡献。
竞争性利益：作者已声明不存在竞争性利益。
2020年4月17日收到；2020年7月5日验收。
- 补充资料
补充图表。
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摘要
背景：肿瘤相关巨噬细胞（TAM）具有很强的可塑性，如果重新编程，可以清除肿瘤细胞并调节适应性免疫系统用于癌症免疫治疗。脱泛素酶（DUBs）可以从Ub修饰的底物中去除泛素（Ub），它与致癌代谢有关，但在调节TAMs复极方面并不为人所知。
方法：采用逆转录-PCR检测巨噬细胞（MΦs）中DUB相关基因的表达。流式细胞术和免疫荧光检测肿瘤微环境和脾脏中免疫细胞的变化，包括M1（CD11b+80层/四层+CD86型+CD206型-)和M2（CD11b+80层/四层+CD86型-CD206型+)MΦs和IFN-γ+CD8（CD8）+T细胞。增殖试验用于测定经USP7抑制剂处理的M2MΦs对T细胞增殖的影响。Western blotting检测USP7的表达和MAPK通路的激活。TGCA数据库用于评估USP7在人肺腺癌（LUAD）免疫微环境中的作用。
结果：筛选了51个DUB基因，USP7被鉴定为M2中的高表达基因，而不是M1 MΦs中的高表达基因。使用siRNA或USP7抑制剂特异性沉默USP7导致M2 MΦs的表型和功能改变，有利于CD8+T细胞增殖在体外.USP7抑制剂延缓Lewis肺癌小鼠的肿瘤生长，并促进M1 MΦs和IFN-γ的肿瘤浸润+CD8（CD8）+T细胞。TAM的消耗减弱了这些治疗效果。USP7抑制通过激活p38 MAPK通路介导MΦs重编程。服用USP7抑制剂可增加肿瘤中程序性细胞死亡配体1（PD-L1）的表达，而阻断程序性细胞死蛋白1（PD-1）可提供有效的抗肿瘤反应。临床数据库表明，LUAD中USP7的高表达与先天免疫和适应性免疫呈负相关。
结论：综上所述，这些结果提供了证据，表明针对USP7的治疗方法，结合免疫治疗，应该考虑用于肺癌治疗。
关键词：去泛素酶、USP7、肿瘤相关巨噬细胞、巨噬细胞重编程、抗PD-1
介绍
肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因之一1近年来，使用程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）和程序性细胞死配体1（PD-L1）抗体等药物进行免疫检查点阻断，可以逆转效应器T细胞衰竭，已成为肺癌治疗方案中的既定策略2然而，很大一部分肺癌患者没有从这些治疗中受益，部分原因是免疫抑制肿瘤微环境（TME）中存在各种细胞（例如免疫细胞、基质细胞、成纤维细胞和内皮细胞）能够以多种方式（包括外泌体和微泡）与肿瘤细胞进行动态通讯，从而对免疫治疗产生耐药性三-6因此，了解和制定针对TME中各种细胞（尤其是免疫抑制细胞）的调控策略，不仅将为TME的调控提供新的思路，也将为肺癌的精确治疗带来新的选择。
肿瘤相关巨噬细胞（TAM）是TME中最丰富的浸润性炎症细胞，与多种肿瘤的发生发展密切相关7-9根据微环境中的刺激线索，巨噬细胞（MΦs）可以分化为两种主要表型：M1 MΦs（抑瘤亚型）和M2 MΦs（促瘤亚型10,11在TME中，TAM可以在M1和M2 MΦs之间动态转换。此外，TAM通常通过肿瘤细胞分泌的细胞因子（如IL-10、IL-4和TGF-β）极化为M2 MΦs12理论上，有三种方法可以逆转TAM的促肿瘤作用：1）抑制TAM的募集，2）清除肿瘤组织中的TAM，以及3）将TAM从M2表型重编程为M1表型12-15然而，TAM的减少也可能导致具有抗肿瘤作用的M1 MΦs的数量显著减少。这使得将TAM从M2重新编程为M1 MΦs成为一种吸引人的治疗策略16,17虽然寡核酸药物（miRNA或siRNA）和Toll-like受体激动剂已在动物实验中被证明能诱导TAM的重新编程，但它们在临床研究中的作用有限，并且可能有副作用，如全身炎症反应和血液毒性18因此，有必要为精确癌症药物确定新的TAM重编程剂。
泛素化是蛋白质降解最重要的途径之一。泛素修饰后，蛋白质被蛋白酶体识别和降解19相应地，存在一个复杂的去泛素酶（DUB）系统，可以通过去除泛素链来调节蛋白质的稳定性和功能20DUB通过从底物蛋白中切割单泛素或多泛素分子来调节底物蛋白的代谢水平，从而调节各种细胞活动，包括基因转录、细胞周期、DNA修复损伤、肿瘤发生和炎症免疫反应20-23DUB蛋白USP1、USP4、USP7、USP14和USP33的抑制剂对前列腺癌、肺癌、乳腺癌和血液恶性肿瘤有治疗作用24-28此外，据报道，USP4、USP7、USP13和USP19可稳定抗炎受体或释放抗炎细胞因子27,29,30据报道，USP24可促进TAM中IL-6的表达31然而，DUB和TAM重新编程之间的关系目前尚不清楚。探索DUB在M1和M2 MΦs中的作用将为临床免疫治疗提供额外的分子靶点。
本研究检测了51个与DUB相关的常见基因在ANA-1小鼠MΦ细胞系诱导的M1和M2 MΦs中的表达。对于USP7，M1和M2 MΦs的表达水平差异最大。USP7是一种半胱氨酸蛋白酶，是DUB家族的重要成员32它也是第一种被药物特异性抑制的去泛素酶，具有良好的治疗效果33-35相关研究表明，USP7主要通过调节MDM2-P53轴在各种肿瘤中发挥癌蛋白的作用36,37同时，USP7可以稳定Foxp3的表达，以维持调节性T（Treg）细胞的功能，它还调节NLRP3炎症小体的激活38,39据我们所知，USP7对TAM调节的影响尚未报道。在这里，我们研究了USP7在TAM中的作用以及靶向USP7如何影响肺癌免疫检查点阻断策略。本研究结果表明，靶向USP7可以逆转TME的免疫抑制作用，提高肺癌免疫治疗的效率。
方法
细胞培养
小鼠Lewis细胞和ANA-1细胞取自中国类型培养收集中心（中国武汉）。细胞生长在含有10%胎牛血清（FBS）（美国纽约州格兰德岛Gibco）和1%青霉素/链霉素溶液的Dulbecco改良鹰培养基（DMEM）中。
试剂
P5091、SB203580、SP600125和U0126-EtOH购自Selleck。HBX-19818和GNE-6776购自MCE。CFSE、LPS、CCK-8试剂、NMP、Tween-80和PEG400购自Biosharp（中国合肥）。氯膦酸盐脂质体购自Biolegend。PD-1抗体购自Invitrogen。
小鼠骨髓基质干细胞的生成和激活
如前所述生成小鼠骨髓源性巨噬细胞（BMDM）40BMDM与20 ng/mL IL-4（214-14-20）和20 ng/mL IL-13（210-13-10）培养，极化为IL-4/13 M2 MΦs；50 ng/mL IL-10（210-10-10），极化为IL-10 M2 MΦs；或50 ng/mL LPS和20 ng/mL IFN-γ（315-05-20），极化为M1 MΦs。所有细胞因子均购自PeproTech（美国新泽西州洛基山）。
T细胞增殖试验
CD8（CD8）+根据MojoSort™Mouse CD8，从C57BL/6小鼠的脾脏中分离出T细胞+T细胞隔离试剂盒协议（480008，Biolegend）。用P5091处理IL-4和IL-13诱导的M2 MΦs 24 h，收集条件培养液并通过0.22μM过滤器过滤。为了确定介导P5091处理的M2 MΦs功能的详细MAPK通路，用10μM SB203580（p38 MAPK选择性抑制剂）、10μM SP600125（JNK-选择性抑制剂）和10μM U0126-EtOH（ERK-选择性抑制物）预处理IL-4/13-BMDM 2 h，用10µM P5091刺激细胞24 h，收集条件培养基。羧基荧光素琥珀酰酯（CFSE）标记的CD8+T细胞用IL-2（20 ng/ml）培养，并在条件培养基中用Dynabeads®小鼠T激活剂CD3/CD28（11452D，Life Technologies）刺激4天。最后，CD8的增殖+流式细胞术检测T细胞。
实时定量PCR
使用MicroElute Total RNA Kit R6831-01（Omega Bio-tek，Norcross，GA，USA）从细胞中获取总RNA，并使用HiScript III RT SuperMix（+gDNA wiper）（Vazyme，南京，中国）将其反转录成cDNA。使用AceQ®Universal SYBR qPCR Master Mix（Vazyme，中国南京）在StepOnePlus实时PCR系统（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）上扩增cDNA。引物序列见补充表S1所有引物均由上海桑根生物技术有限公司合成。
转染
BMDM接种在6孔板（2×10）中5每个孔的细胞数）。24小时后，用针对USP7的小干扰RNA（siRNA）或使用Lipofectamine RNAiMAX（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）的阴性对照（NC）siRNA转染它们。48小时后收集细胞，进行western印迹和流式细胞术。USP7 siRNA（sc-77373）和NC siRNA（sc-37007）购自Santa Cruz Biotechnology，Inc。
流式细胞术
为了进行细胞表面分析，用推荐抗体浓度的抗鼠Zombie Violet™Fixable Viability Kit（423114）、Zombie NIR™Fixale Viabiliity Kit（428106）、CD45（103114）、CD11b（101205）、CD86（105012）、CD4（100408）、CD8a（100752）、Gr-1（108411）和PD-L1（124311、124308）对细胞进行染色，并在4°C下培养30分钟。对于T细胞内IFN-γ（505808）细胞因子染色，细胞在用12-肉豆蔻酸13-醋酸盐（PMA）（ab120297，Abcam，100 ng/mL）、莫能新钠盐（ab120499，Abcan，1 ug/mL）和离子霉素钙盐（5608212，PeproTech，100 ng/mL）刺激6小时后被固定和渗透。对于CD206（141706）和Foxp3（126408）染色后，细胞也被固定并渗透。所有流式细胞仪抗体均购自Biolegend（美国加利福尼亚州圣地亚哥）。
肿瘤浸润免疫细胞的获得
如前所述，从肿瘤组织中获取肿瘤浸润免疫细胞40.
小鼠肿瘤模型与治疗
雌性C57BL/6小鼠（6周龄）购自HBCDC（中国武汉）。所有小鼠均按照湖北省动物保护和使用委员会批准的方案以及华中科技大学（中国武汉华中科技学院）动物实验伦理委员会的指南进行饲养。含1×10的50μL PBS6将Lewis细胞皮下注射到雌性C57BL/6小鼠右侧皮下，建立皮下荷瘤模型。七天后，将小鼠随机分为不同组。
P5091（40 mg/kg，i.p.）溶于溶液（4%NMP、3%吐温-80和20%PEG400，Milli-Q水中）中，Vehicle（100μL，i.p.）分别每天注射一次，持续12天。氯膦酸盐脂质体在第一天以150μL/只小鼠的剂量进行MΦ耗竭，然后每三天以100μL/小鼠的剂量耗竭，共四次。每隔一天进行一次抗PD-1治疗（10 mg/kg，i.p.），共四次。根据修正的椭球公式计算肿瘤体积：V=1/2（长×宽2).
组织多色免疫荧光染色
Opal进行组织多色免疫荧光染色TM（TM）7色手动IHC套件（NEL811001KT，Perkinelmer）。肿瘤组织被固定并包埋在石蜡中，然后用切片机切片。切片通常进行脱蜡和水合处理。Tris-EDTA抗原修复缓冲液，3%H2O（运行）2用于内源性过氧化物酶的失活以及用于阻断的正常山羊血清。然后将载玻片与CD8（A02236-1）、CD86（ab213044）、CD206（ab64693）、F4/80（ab6640）和IFN-γ（ab9657）培养过夜。接下来，将它们与HRP标记的山羊抗兔/小鼠二级抗体和DAPI在室温下孵育1小时。最后，使用PE-Vectra（Perkinelmer）进行组织免疫荧光分析。CD8抗体购自中国武汉博斯特生物科技有限公司。抗CD86、CD206、F4/80和IFN-γ的抗体购自Abcam。
TAM排序和RNA测序
通过流式细胞术从接受Vehicle或P5091治疗的小鼠肿瘤组织中分离TAM。用PBS清洗分选的TAM两次，在500 g下离心5分钟，并丢弃上清液。细胞沉淀物在-80°C下快速冷冻。然后，将MΦs送往北京诺维金科技有限公司进行RNA测序。
组织细胞因子检测
根据LEGENDplex，采用流式细胞术检测从对照组或P5091组提取的肿瘤组织中的细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-5和IL-6TM（TM）多分析流动分析试剂盒（740750，Biolegend）。
TCGA数据库分析
肺腺癌RNA-seq的原始数据来自TCGA数据库(https://gdc.nci.nih.gov/). 数据分析基于R×64.3.5.3软件，根据R语言edgeR软件包分析USP7在正常组织和肺腺癌组织中的差异表达数据。从GO.db和biomeRt包中提取免疫相关通路，用于基因集变异分析（GSVA）。参考Achim Rody和其他研究人员之前报道的与T细胞免疫和炎症免疫相关的七个基因集41，利用GSVA分析这七个基因集与USP7表达的相关性。
统计分析
我们使用非配对双尾Student t检验来比较两组测量值之间的差异，同时使用Grapad Prism 6软件使用Kaplan-Meier检验来评估生存率。使用单因素方差分析比较肿瘤体积增长的重复测量值。流式细胞仪数据采用FlowJo.10进行分析。各组之间的显著差异如下所示*P（P）<0.05, **P（P）<0.01, ***P（P）<0.001.
结果
靶向USP7抑制小鼠MΦs的M2表型和功能在体外
尽管TAM与肺癌的发生发展密切相关42，关于DUB参与调节其功能的报道有限。有鉴于此，通过逆转录PCR（RT-PCR）评估与DUB相关的常见基因在ANA-1小鼠MΦ细胞系诱导的M1和M2 MΦs中的表达。如所示图一51个DUB基因的mRNA水平表现出不同的表达模式，其中USP7在M2（IL-4/13 M2和IL-10 M2）和M1 MΦs之间的差异表达最为明显，最高的M2/M1比率为21.7（IL-4/12/M1）和19.2（IL-10 M2/M1）。经证实，翻译后的USP7蛋白在M2 MΦs（IL-4/13 M2和IL-10 M2；由ANA-1诱导）中的表达显著高于M1 MΦs(图S1). 此外，由于它是第一个被小分子抑制剂特异性抑制的DUB，我们对USP7特别感兴趣。接下来，我们进一步验证了由BMDM诱导的M2和M1 MΦs中USP7的表达。如所示图B-C公司在M2 MΦs中，USP7 mRNA和相应蛋白（IL-4/13 M2和IL-10 M2）的表达显著高于M1 MΦs。总之，这些数据证实了USP7在M2和M1 MΦs之间的差异表达。基于这一发现，我们探索了USP7靶向抑制是否能选择性杀伤M2 MΦs。我们使用USP7的特异性抑制剂（P5091、HBX19818、GNE-6776）治疗来自ANA-1的M1、IL-4/13 M2和IL-10 M2 MΦ。这三种抑制剂选择性地结合USP7活性位点并抑制其活性，但不抑制其表达35,43此外，我们进一步验证了用三种抑制剂（P5091、HBX19818、GNE-6776、10μM）处理ANA-1细胞不会改变USP7的表达(图S2). 对于三种抑制剂中的任何一种，在M2和M1杀伤之间均未观察到明显的选择性(图S3A-C公司)在测试条件下。同时，我们进一步验证了P5091对BMDM诱导的M2和M1 MΦs的非选择性杀伤作用(图S3D类).
靶向USP7抑制小鼠M2表型和功能在体外.（A）RT-PCR检测ANA-1诱导的M0、M1（LPS/IFN-γM1）和M2（IL-4/13M2和IL-10M2）中与DUB相关的常见基因的mRNA表达。(B类)通过RT-PCR检测骨髓基质干细胞诱导的MΦs、M1和M2中USP7的mRNA表达。(C类)Western blotting显示USP7在骨髓基质干细胞诱导的MΦ、M1和M2中的表达。(D-电子)流式细胞术分析经P5091（5μM或10μM）处理24 h后，IL-4/13诱导的BMDM M2细胞中CD206的表达。数据表示为平均值±SEM（n=3）。(F类)通过western blotting检测用NC或USP7-siRNA转染的BMDM中USP7的表达。(G公司)流式细胞术检测NC-siRNA和USP7-siRNA组BMDM中CD206的表达。(H-I公司)流式细胞术分析CD8表面CFSE的表达+T细胞在DMSO-或P5091-（5μM或10μM）条件培养基的存在下处理IL-4/13诱导的BMDM M2细胞。数据以平均值±扫描电镜（n=3）表示。
接下来，我们研究了USP7靶向抑制对M2 MΦs表型和功能变化的影响。根据图S4A-B公司三种抑制剂（P5091、HBX19818、GNE-6776）在对受试细胞毒性可忽略的浓度范围（0-10μM）内，均显著降低ANA-1诱导的IL-4/13 M2和IL-10 M2 MΦs中CD206（M2相关标记物）的表达。利用BMDM诱导的IL-4/13 M2 MΦs，我们进一步验证了P5091和(图D-E公司)和GNE-6776显著降低CD206的表达，而HBX19818在浓度为10μM时没有这种作用(图S4C类)-可能是因为HBX19818（IC50:28.1μM）的UPS7抑制活性相对弱于P5091（4.2μM）。此外，P5091靶向USP7对ANA-1诱导的IL-4/13 M2和IL-10 M2 MΦs中CD86（M1相关标记）的表达没有明显影响，对原发性IL-4/13M2 Mφs也没有明显影响(图S5). 为了进一步阐明USP7在M2 MΦs表型变化中的调节作用，我们使用siRNA敲除了BMDM中USP7的表达。图F-G公司结果表明，与阴性对照（NC）组相比，USP7-siRNA组CD206的表达显著降低。最后，我们检测了经USP7抑制剂P5091处理的M2MΦs条件培养基对CD8增殖的影响+CFSE检测T细胞。我们发现CD8的增殖率+P5091（5μM和10μM）组的T细胞显著高于IL-4/13 M2组，这进一步表明靶向USP7可以抑制M2 MΦs的功能(图H-I公司). 总之，靶向抑制USP7可以改变小鼠M2 MΦs的表型并抑制其功能。
靶向USP7抑制肿瘤生长并诱导抗肿瘤免疫体内
我们探讨了靶向USP7对TAM和抗肿瘤免疫的影响体内，使用皮下Lewis肿瘤荷瘤小鼠模型。腹腔注射P5091（40 mg/kg）有效抑制肿瘤生长，按肿瘤体积计算，平均抑制率为73%(图A-C公司)与对照组相比，小鼠体重无明显变化(图S6). 为了进一步研究腹腔注射P5091对先天性和适应性抗肿瘤免疫的影响，在P5091治疗后第13天，我们通过流式细胞术检测了MΦs、髓源性抑制细胞（MDSCs）、调节性T（Treg）细胞、帮助性T淋巴细胞1（Th1）细胞和细胞毒性T淋巴细胞（CTL）。TME中MΦs和T细胞比率检测的选通策略如所示图D类和图S7分别是。根据图E-G公司，M1 MΦs（ZIR）的比例-CD11b型+80层/四层+第86页+CD206型-)P5091组M1/M2比值分别是对照组的2.1倍和5.3倍；而M2 MΦs的比例（CD11b+80层/四层+CD86型-CD206型+)有2.2倍的显著减少。这些结果表明，P5091可以有效地将TAM从M2表型重编程为M1表型。另一方面，MDSC（ZIR）的比率没有显著变化-CD11b型+第1组+)和Tregs（ZIR-CD45型+CD4细胞+Foxp3系列+)P5091治疗后TME(图H-I公司). 此外，我们检测了TME中T细胞介导的抗肿瘤免疫反应的变化。与对照组相比，CD4的比例+T细胞显著减少(图J型)，而CD8的比例+T细胞和Th1（ZIR-CD45型+CD4细胞+干扰素-γ+)细胞没有(图K-L公司). CTL比例（ZIR-CD45型+CD8（CD8）+干扰素-γ+)P5091治疗后TME显著增加(图M（M）).
靶向USP7抑制肿瘤生长并诱导局部抗肿瘤免疫体内.(一)在P5091和对照组中采集并拍摄肿瘤。(B类)P5091或Vehicle治疗后Lewis肿瘤生长体内试验。数据表示为平均值±SEM（每组6个）。(C类)P5091组和对照组每只小鼠肿瘤体积增长的蜘蛛图。(D类)流式细胞术检测TAM的门控策略。(E-G公司)M1的比例(电子)和M2(F类)和M1/M2比率(G公司)P5091组和对照组的TME。(H-M公司)MDSC的百分比(H（H）)、特雷格(我)，CD4+T型(J型)，第8区+T型(K（K）)，Th1型(L（左）)和CTL(M（M）)在每组TME内。数据以平均值±SEM（n=7）表示(电子邮箱).
为了进一步证实观察到的MΦs和CTL的变化，进行了多色免疫荧光检测，其中用DAPI、F4/80、CD86、CD206、CD8和IFN-γ抗体同时标记肿瘤组织。M1 MΦs的数量（DAPI+80层/四层+CD86型+)和CTL（DAPI+CD8（CD8）+干扰素-γ+)P5091组显著高于对照组，而M2 MΦs（DAPI+80层/四层+CD206型-)显著低于对照组(图一); 这与流式细胞术的结果一致。此外，通过多分析液流分析试剂盒评估TME中细胞因子含量的变化。如所示图B-F公司与对照组相比，TME中抗肿瘤免疫相关细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-2和IL-5的含量增加，而与抑制抗肿瘤免疫有关的IL-6的含量降低。总之，这些结果表明，靶向USP7可以显著促进TAM极化为M1 MΦs，并激活TME中CTL介导的抗肿瘤免疫反应体内.
靶向USP7激活局部和全身抗肿瘤免疫。(一)P5091组和对照组TME中TAM和CTL的多色免疫荧光检测。(B-F型)细胞因子IFN-γ(B类)，肿瘤坏死因子-α(C类)，IL-2(D类)，IL-5(电子)和IL-6(F类)用多分析液流分析试剂盒检测各组TME的含量。(G-K公司)Treg的比例(G公司)，CD4+T型(H（H）)，CD8+T型(我)，Th1型(J型)和CTL(K（K）)在各组脾脏中。数据以平均值±SEM（n=7）表示(B-K公司).
为了探讨靶向USP7是否能激活系统适应性抗肿瘤免疫，我们检测了CD4的人群+T细胞，CD8+脾脏中的T细胞、Th1细胞和CTL。结果表明，与对照组相比，CD4的比例+T细胞显著减少，而CD8的比例+T细胞、Th1细胞和CTL有效增加，而P5091组脾脏中Treg细胞的比例没有显著变化(图克-克). 因此，以USP7为靶点可以显著激活全身抗肿瘤免疫反应。
靶向USP7介导的抗肿瘤作用机制
为了确定靶向USP7介导的抗肿瘤免疫反应是否依赖于MΦs，我们使用氯膦酸盐脂质体（Clo）从小鼠体内清除MΦs。正如预期的那样，Clo对脾脏MΦs和TAM的清除效率分别达到约88%和74%(图A-B公司). 如所示图C类在Lewis荷瘤小鼠模型中，Clo去除MΦ可显著减弱P5091的抑制作用。此外，我们发现MΦ耗竭也破坏了P5091在TME中诱导的CTL激活效应(图D-E公司). 综上所述，这些数据表明P5091介导的抗肿瘤作用和CTL激活是MΦ依赖性的。
P5091介导的抑瘤作用和CTL激活是MΦ依赖性的。(A-B公司)氯膦酸盐脂质体（Clo）消耗脾脏MΦs的效率验证(一)和TME(B类). (C类)在经过各种指示的治疗后，对Lewis荷瘤小鼠的肿瘤生长进行了16天的监测。(D类)显示各组TME中CTL比例的典型点图。(电子)点图的汇总数据显示了TME中CTL的百分比。数据以平均值±SEM（n=7）表示(C、 E类).
为了阐明靶向抑制USP7介导的TAM重塑的潜在分子机制，我们通过流式细胞术对对照组和P5091治疗组的TAM进行了RNA序列分析(图一). 与对照组相比，M2相关基因（Arg1、Chi3、VEGF、，等）有效下调，而M1相关基因（Nos2、IL-12、，等）在P5091治疗后显著上调(图B类). 定量RT-PCR分析进一步证实，P5091处理的TAM表达的M1相关IL-12p40和Nos2的mRNA水平较高，M2相关Chil3和VEGF的水平较低(图C类). 为了进一步评估P5091对TAM重编程的影响，我们使用京都基因和基因组百科全书（KEGG）来确定TAM中丰富的典型信号通路。如所示图D类与对照组相比，P5091治疗组的M1相关MAPK信号通路显著丰富。Western blotting进一步证实，在P5091处理的BMDM和ANA-1诱导的IL-4/13 M2 MΦs中，与MAPK通路相关的JNK、ERK和p38蛋白的磷酸化水平有效增加(图E和S8). 为了进一步探讨USP7抑制剂对巨噬细胞的重编程是否依赖于其对MAPK通路的调节，我们使用Erk1/2（U0126-EtOH）、p38（SB203580）和JNK（SP600125）抑制剂进行了相关的拯救实验44。如所示图F和图S9与IL-4/13M2组相比，P5091诱导的CD8+SB203580显著阻止T增殖，但U0126-EtOH或SP600125未阻止T增殖在体外，靶向抑制USP7主要通过激活p38 MAPK通路降低小鼠M2 MΦs的功能。总的来说，USP7的靶向抑制激活了p38 MAPK通路，导致TAM重编程。
以USP7为靶点可以激活p38 MAPK通路来重新编程TAM。(一)通过流式细胞术对TME中TAMs进行分选的策略。(B类)根据RNA测序结果绘制的热图显示了P5091组和对照组TAM中M1和M2相关基因的差异表达。(C类)RT-PCR进一步验证各组TAM的差异表达基因。数据表示为平均值±SEM（n=3）。(D类)KEGG分析根据两组差异表达基因确定20条最明显富集的途径。(电子)Western blotting检测在指定时间点用P5091（10µM）处理的IL-4/13-BMDM M2细胞中JNK、p-JNK，ERK1/2，p-ERK1/2、p38、p-p38和β-actin的表达。(F类)流式细胞术分析CD8表面CFSE的表达+T细胞在IL-4/13条件培养基的存在下诱导各种指定治疗的BMDM M2细胞。治疗表明：DMSO刺激、P5091（10µM）刺激、在p38抑制剂（SB203580，10µM）、JNK（SP600125，10μM）、Erk1/2（U0126-EtOH，10μM）存在下的P5091刺激。数据表示为平均值±SEM（n=4）。
联合阻断USP7和抗PD-1发挥协同抗肿瘤作用体内
相关研究报道，促进TAM从M2向M1 MΦs的极化倾向于增加PD-L1的表达40,45因此，我们监测了P5091治疗后BMDM中PD-L1的表达，但未检测到显著变化（数据未显示）。另一方面，引人注目的是，P5091以浓度依赖的方式显著增加了Lewis肿瘤细胞中PD-L1的表达(图一). 此外，我们在Lewis模型小鼠中监测了P5091治疗后TME活细胞中PD-L1的表达。根据图B-C公司P5091组TME中PD-L1的表达显著高于对照组。P5091和对照组PD-L1的肿瘤组织化学染色结果与流式细胞术结果一致(图S10). 这些结果表明USP7的靶向抑制作用体内可以增加TME中PD-L1的表达。因此，我们探讨了P5091与抗PD-1联合是否具有协同抑瘤作用体内在本实验中，小鼠被分为对照组、P5091治疗组、抗PD-1组和P5091+抗PD-1小组(图D类). 如所示图电子与其他三组相比，P5091+抗PD-1治疗显著延迟Lewis皮下肿瘤的生长。同时，Kaplan-Meier生存分析显示，与其他三组相比，P5091+抗PD-1组的生存时间最长(图F类). 总之，靶向抑制USP7联合抗PD-1对Lewis皮下肿瘤具有协同作用。
联合阻断USP7和PD-1发挥协同抗肿瘤作用体内.(一)流式细胞术检测P5091（5µM或10µM）治疗后Lewis细胞中PD-L1的表达。数据表示为平均值±SEM（n=3）。(B类)用于检测Lewis TME中PD-L1表达的流式细胞术门控策略。(C类)流式细胞术定量P5091治疗后Lewis TME（ZIR活细胞）中PD-L1的表达。数据以平均值±扫描电镜（n=6）表示。(D类)联合使用P5091和PD-1抗体治疗Lewis荷瘤小鼠的治疗计划。(电子)用P5091和/或抗PD-1治疗Lewis肿瘤小鼠14天（n=13）。(F类)Kaplan-Meier生存图显示小鼠在指定治疗后的存活率（n=13）。
LUAD中USP7的高表达与TCGA中的抗肿瘤免疫负相关
为了进一步研究USP7在人肺腺癌（LUAD）免疫微环境中的作用，我们分析了TCGA数据库中517例LUAD患者的转录组测序结果。如图所示A、 LUAD中USP7的mRNA表达显著高于正常肺组织，表明USP7可能是LUAD中的一种癌蛋白。此外，我们还进行了基因集变异分析（GSVA），以探讨USP7表达水平与LUAD免疫反应之间的关系。我们发现USP7的高表达与MΦ趋化性（GO:0048246）、T细胞活化和增殖（GO:00042104）、T淋巴细胞调节毒性（GO:0001913）、粘膜固有免疫反应（GO:0002227）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）的产生（GO:0032725）、，和免疫反应（GO:0050778）(图B类). 此外，根据Rody等人报告的方法，我们通过分析7组集合基因来探索USP7表达是否与T细胞免疫和炎症免疫相关。41。如所示图C类，USP7的表达与HCK、LCK、MHC-I、MHC-II、STAT1、干扰素和IgG呈负相关，表明USP7可能对T细胞免疫和炎症免疫起负调节作用。最后，我们分析了USP7的表达与负免疫调节相关分子（TIM-3、TGFB、PD-L1、，等）。如中所述图D类USP7的表达与PD-L1、TIM-3、TGFβ和CD40呈负相关；而与SATB1呈正相关。总之，USP7似乎在人类LUAD的抗肿瘤免疫中发挥负调节作用。
LUAD中USP7的表达与TCGA中的抗肿瘤免疫呈负相关。（A）TCGA数据库中各种人类癌症（红色）、正常组织（蓝色）和转移组织（紫色）中USP7 mRNA的表达水平。(B类)USP7与先天性和T细胞介导的适应性抗肿瘤免疫之间的关系。GO:0048246，MΦ趋化性。GO:0042104，活化T细胞增殖的正向调节。GO：0001913，T细胞调节毒性。GO:0002227，粘膜固有免疫反应。GO:0032725，粒细胞MΦ集落刺激因子产生的正向调节。GO:0050778，免疫反应的正向调节。(C类)USP7表达与T细胞免疫和炎症免疫的相关性。(D类)LUAD免疫调节相关成员的相关性。
讨论
近年来，旨在重塑TME的抗肿瘤策略引起了很多关注46TAM是TME最重要的成分之一，它们可以合成和分泌抗炎因子，抑制抗肿瘤免疫反应，促进肿瘤生长，从而促进肿瘤的进展和转移，具有强有力的临床证据47.正在积极寻求TAM的重编程方法，需要改进策略以准确有效地将MΦs导向抗肿瘤活性。泛素化/去泛素化系统是细胞调控环境刺激产生的蛋白质降解和稳态的重要经典调控工具，与肿瘤的发生、发展和炎症免疫调节密切相关23。很少有研究报告DUB在调节TAM中的作用。我们筛选了DUB系统中51个常见蛋白的mRNA，在M1和M2 MΦs中表达，发现USP7的mRNA在M2和M1 MΦs中表达差异最大。我们进一步验证了M2MΦs中USP7翻译蛋白的丰度显著高于M1MΦs。此外，在BMDM诱导的M2和M1 MΦs中验证了USP7 mRNA和相应蛋白的差异表达，启发我们进一步研究USP7在MΦ活性调节中的作用。
我们的研究表明，靶向USP7可以显著抑制M2 MΦs的表型和功能。与此同时，体内结果表明，靶向USP7可显著抑制小鼠Lewis肺癌的生长，将TAM重编程为M1 MΦs，并促进TME CD8的表达+T细胞激活。此外，我们发现P5091（USP7的抑制剂）能够激活全身抗肿瘤T细胞免疫反应。一些研究集中于USP7与免疫系统之间的关系。除此之外，他们还报道了靶向抑制USP7可以通过促进Foxp3的泛素降解来抑制Treg细胞的功能39我们推测，本研究中TME和脾脏中Treg细胞比例没有降低的原因可能是P5091的相对较低剂量，以及TAM和Treg的敏感性差异。
USP7通过与MDM2蛋白的相互作用在肿瘤发生和肿瘤发展中发挥重要作用48靶向USP7对各种肿瘤具有抑制作用49-52在本研究中，我们发现USP7抑制剂P5091显著抑制小鼠Lewis肿瘤的生长。为了确定P5091介导的肿瘤治疗效果是否依赖于对TAM进行重新编程以激活抗肿瘤免疫反应，我们通过氯磷酸脂质体耗尽TAM，发现P5091对肿瘤生长的抑制作用和对CTL激活的影响部分减弱，表明P5091的抗肿瘤活性依赖于MΦs的功能。根据图S11，P5091抑制Lewis细胞的生长，IC50约为12μM。考虑到清除MΦs后P5091的抗肿瘤活性尚未完全消失(图C类)我们推测，靶向USP7对小鼠Lewis肿瘤生长的抑制作用可能是基于其对肿瘤细胞和TAM的双重作用，其中TAM的重塑可能起主要作用。
此外，我们通过流式细胞术和RNA序列分析从对照组小鼠和P5091处理小鼠中分离TAM，以阐明USP7靶向重塑肿瘤TAM的分子机制。对两组差异表达基因的KEGG富集分析表明，MAPK通路显著富集。相关研究报道，MAPK通路广泛参与MΦs的炎症激活和TAM向M1表型的重编程16,53Western blotting也证实USP7靶向抑制剂可以显著促进MΦs中JNK/ERK/p38 MAPK通路的激活。根据通路拯救实验，USP7的靶向抑制激活了p38 MAPK通路，导致TAM重编程。
P5091靶向USP7可上调TME中PD-L1的表达，表明与PD-1单克隆抗体联合治疗可提高治疗的抗肿瘤效果。事实上，P5091与PD-1单克隆抗体联合治疗比单药治疗导致肿瘤生长较慢和生存时间更长。然而，通过靶向USP7上调Lewis肿瘤细胞PD-L1表达的机制尚不清楚，我们计划在未来进一步研究。
此外，我们进一步验证了人类LUAD标本中USP7与免疫系统的关系。通过分析TCGA数据库中517例LUAD患者的测序数据，我们发现USP7在LUAD中的表达显著高于正常肺组织，并且USP7的高表达与先天免疫和特异性T细胞免疫激活呈负相关。同时，USP7的表达与PD-L1、Tim3和TGF-β等与负免疫调节相关的分子呈负相关，表明USP7可能对肿瘤细胞中PD-L1的表达产生负调节作用。在我们的研究中，应用P5091后，肿瘤细胞和TME中PD-L1的表达上调，这进一步验证了假设，但需要进一步研究。此外，考虑到许多其他DUBs mRNA在M1和M2 MΦs之间的差异表达（图A） 未来的研究需要对其他DUB靶点进行进一步研究。
结论
据我们所知，这项研究首次表明USP7在肺癌TAM重编程中发挥重要作用。通过激活p38 MAPK通路，USP7靶向性抑制TAM重组为M1 MΦs，然后激活CTL介导的抗肿瘤作用，最终抑制肿瘤生长。然而，靶向抑制USP7可以增加PD-L1在肿瘤微环境中的表达，进一步与PD-1单克隆抗体结合可以发挥协同抗肿瘤作用。总之，以USP7为靶点，结合PD-1单克隆抗体，可能为肺癌的临床治疗提供新的途径。
靶向抑制USP7通过对肺癌中肿瘤相关巨噬细胞的重新编程调节抗肿瘤免疫反应。
致谢
我们感谢实验室所有成员的好意和帮助。本研究得到了国家自然科学基金（编号81874222、81874233和81672978）、湖北省自然科学基金（2019CFB465）和国家重点研发计划（项目编号2016YFC0105300）的资助。我们感谢WNLOHUST的光学生物成像核心设施在数据采集方面的支持。
工具书类
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