伊马替尼和达沙替尼引起线粒体功能障碍导致C2C12肌管和人RD细胞氧化应激

小鼠C2C12细胞的培养

C2C12小鼠成肌细胞（美国型培养物收集中心[ATCC]，美国）在含有Dulbecco改良鹰培养基（DMEM，Gibco，英国）、谷氨酸MAX、10%胎牛血清（FBS）和1%HEPES（Gibco（英国）的培养基中融合生长。细胞在37°C、含5%CO的湿润空气中孵育₂用Neubauer血细胞仪测定细胞数量，用台盼蓝排除法检查细胞活力。播种后三天，用含有DMEM-Glutamax、1%HEPES、2%马血清（英国Gibco）和0.03%胰岛素（库存：10 mg/ml）的分化培养基（DM）替换培养基，以获得肌管。三天后，我们取出培养基，加入不含胰岛素的分化培养基(Sanvee等人。，2019). 然后用TKIs在无血清分化培养基中处理肌管24小时。

人RD细胞的培养

人类横纹肌肉瘤细胞（RD细胞）来自ATCC（美国马纳萨斯）。RD细胞保存在生长培养基DMEM和10%FBS中。细胞在37°C和5%CO的增湿空气中培养₂当细胞达到大约80%的汇合点时，使用胰蛋白酶进行传代。我们使用Neubauer血细胞仪测量细胞数量，然后使用台盼蓝排除法检查生存能力。

膜毒性

我们根据制造商的方案，使用来自Lonza（瑞士巴塞尔）的Toxilight试验评估了膜的毒性。该方法测量腺苷酸激酶（AK）在培养基中的释放，表明质膜的完整性。我们使用0.1%Triton X作为阳性对照。在暴露于TKI 24小时后，我们将20μl上清液转移到一个新的不透明96-well板上。然后，我们向每个孔中添加50μl分析缓冲液。培养5分钟后，我们使用Tecan M200 Pro Infinity平板读取器（瑞士梅内多夫）测量发光。所有数据均归一化为0.1%Triton X（设定为100%细胞溶解）。

细胞内ATP含量

我们根据制造商的说明，使用CellTiterGlo发光细胞活性测定（瑞士普罗米加）评估细胞内ATP含量。简单地说，在暴露于TKI 24小时后，将80μl分析缓冲液添加到每个含有80μl培养基的96个样品中。在黑暗中培养15分钟后，我们使用Tecan M200 Pro Infinity平板读取器（瑞士梅内多夫）测量发光。将所有数据标准化为含有0.1%DMSO的阴性对照条件。

线粒体膜电位

线粒体膜电位(Δψm） 使用配备有荧光传感器蓝（奥地利因斯布鲁克Oroboros仪器公司）的O2k-荧光LED2模块进行测量。为了访问Δψm、 我们使用藏红花作为荧光探针，根据内部负电位在带电线粒体中积累(Perevoshchikova等人。，2009). 蓝色荧光传感器配备了一套用于番红花的滤光片（激发波长和发射波长分别为495 nm和587 nm）。我们在作为线粒体呼吸介质的MiR05缓冲液中进行了实验。MiR05缓冲液含有0.5 mM EGTA、3 mM氯化镁、20 mM牛磺酸、10 mM磷酸二氢钾、20 mM-HEPES、110 mM蔗糖、1 g/I无脂肪酸牛血清白蛋白和60 mM乳仿生酸（pH 7.1）(Pesta和Gnaiger，2012年). 为了进行校准，在每个小室中添加200μM溶解在蒸馏水中的藏红储备溶液，并分五步滴定到O2k小室中，直至藏红最终浓度为2μM。在校准步骤中，我们观察到荧光线性增加，反映了室内藏红花的浓度。校准后，我们加入C2C12肌管和用洋地黄素透化的人RD细胞。作为第一步，我们添加谷氨酸（10 mM）和苹果酸（2 mM）作为电子传递链（ETC）复合物I的底物。荧光信号急剧下降，反映出Δψm.此时，我们通过添加2.5 mM的二磷酸腺苷（ADP）刺激呼吸链。这与减少Δψm（荧光增加），因为质子穿梭通过ATP合成酶来驱动ATP生成。数据显示Δψm，以谷氨酸/苹果酸和ADP为底物。然后将结果标准化为含有0.1%DMSO的阴性对照条件。

线粒体电子传递链特异酶复合物的活性

使用配备DataLab软件的Oxygraph-2k高分辨率呼吸计分析呼吸链特定酶复合物的活性（奥地利因斯布鲁克Oroboros仪器公司）。治疗24小时后，如前所述，将C2C12肌管和人类RD细胞置于37°C含有MiR05缓冲液的恒温氧气室中，并持续搅拌(Pesta和Gnaiger，2012年). 在用洋地黄素渗透后，我们测定了配合物I、II、III和IV的活性。首先，我们使用谷氨酸和苹果酸（分别为10 mM和2 mM）作为底物评估配合物I和III的活性。然后我们添加ADP（2.5 mM）和鱼藤酮（0.5μM）作为复合物I的抑制剂。然后，我们添加杜洛喹醇（500 mM）作为配合物III的人工底物，然后添加抗霉素A（2.5μM）用作复合物III的抑制剂。在第二次运行中，我们在鱼藤酮存在下使用琥珀酸盐（10 mM）评估了复合物II和IV的活性作为基底，然后添加ADP（2.5 mM）。然后我们添加丙二酸盐（5 mM）作为复合物II的抑制剂。随后，我们添加N，N，N′，N′-四甲基对苯二胺盐酸盐（TMPD）/抗坏血酸盐（分别为0.5 mM和2 mM），以研究复合物IV，然后该复合物被氰化钾（1 mM）抑制。通过评估细胞色素c（10μM）对线粒体呼吸的影响来研究线粒体外膜的完整性。使用Pierce BCA蛋白质检测试剂盒（瑞士巴塞尔赛默飞世尔科学公司）测定蛋白质浓度。我们用pmol O表示呼吸频率₂×秒⁻¹×毫克⁻¹蛋白质。

线粒体超氧化物积累

MitoSOX™红色荧光染料（Thermo Fisher Scientific，Basel，Switzerland）用于测定线粒体超氧化物积累。用TKIs处理24小时后，取出培养基，用PBS（磷酸盐缓冲液）冲洗细胞。作为阳性对照，我们将C2C12肌管和RD细胞暴露于100µM抗霉素30分钟，这是一种众所周知的ETC复合物III抑制剂(Bouitbir等人。，2016). 接下来，将PBS中制备的MitoSOX试剂（2.5μM）添加到每个孔中，我们在37°C的光保护下培养平板10分钟。我们使用Tecan M200 Infinite Pro平板阅读器（Tecan，Männedorf，瑞士）分别在510 nm和580 nm的激发和发射波长下测量荧光。将结果归一化为蛋白质含量，蛋白质含量通过Pierce BCA蛋白质分析试剂盒（瑞士巴塞尔赛默飞世尔科学公司）进行量化，然后再归一化至0.1%二甲基亚砜处理的对照细胞。

线粒体DNA拷贝号

如前所述，我们使用定量聚合酶链反应（qPCR）测定线粒体DNA拷贝数(Quiros等人。，2017). 简单地说，我们按照制造商的说明，使用DNeasy血液和组织试剂盒（瑞士Hombrechtikon，Qiagen）提取了总DNA。我们用NanoDrop 2000（Thermo Scientific，Wohlen，Switzerland）在260nm分光光度法测量了样品中的DNA浓度。我们将样品稀释至10 ng/μl DNA的最终浓度。然后对DNA进行三次qPCR（参见 表1 使用SYBR Green（Roche Diagnostics，Rotkreuz，Basel）并使用ViiA™7实时PCR系统（Applied Biosystems，Waltham，MA，USA）进行。如前所述，对线粒体拷贝数进行量化(Quiros等人。，2017).

定量实时PCR

根据制造商的说明，使用Qiagen RNeasy迷你提取试剂盒从C2C12肌管和人类RD细胞中获取总RNA（瑞士洪布里奇昆市Qiangen）。我们使用NanoDrop 2000（瑞士沃伦热电科学公司）测量了RNA的数量和纯度。对于逆转录，使用Omniscript RT试剂盒（德国希尔顿QiagenGmbH）从1μg总RNA合成cDNA。接下来，将cDNA与正向和反向引物（0.3μM）、SYBR Green（Roche Diagnostics，Rotkreuz，Switzerland）混合，作为荧光染料，用于测量双链DNA形成。实时PCR测量采用ViiA™7实时PCR系统（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆应用生物系统公司）进行，一式三份。引物序列是使用国家生物技术信息中心（NCBI）基因库公共数据库中的信息设计的。所使用的引物组序列列于 表1 使用ΔΔCt方法对相对基因表达水平进行定量18秒基因和β肌动蛋白C2C12肌管和RD细胞中的看家基因(Ramakers等人。，2003).

西方印迹法

用TKIs处理后，使用放射免疫沉淀分析法（RIPA:150 mM氯化钠、1.0%NP-40、0.5%脱氧胆酸钠、0.1%十二烷基硫酸钠、50 mM Tris；pH 8.0）在冰上缓冲液中溶解C2C12肌管15分钟，然后离心获得蛋白质样品。收集上清液后，使用BCA-Pierce分析量化每个样本的蛋白质浓度。将10µg蛋白质加载到市售的4–12%NuPAGE Bis-Tris凝胶上（瑞士巴塞尔Invitrogen）。凝胶在140 V下运行，分离后，使用Trans-Blot Turbo Blotting System（瑞士克雷西耶Bio-Rad）将凝胶电吸至硝化纤维素膜。然后使用抗超氧化物歧化酶1（SOD1）抗体（ab51254，abcam，1:5000）、SOD2（#13194，细胞信号，1:2000）、硫氧还蛋白1（TRX1）（ab109385，abca姆，1:10000）、TRX2（ab185544，abcam，1:10'000）、完整和裂解半胱天冬酶3（#9665S，细胞信号学，1:500）、，和GAPDH（sc-365062，圣克鲁斯生物技术，1:1000）。然后用次级HRP-结合抗体（美国圣克鲁斯生物技术公司）对膜进行1小时（1:2000，在封闭溶液中）的检测。然后我们清洗膜，并加入ClarityTM Western ECL底物（Bio-Rad Laboratories，USA）以观察条带。使用Fusion Pulse TS设备（Vilber Lourmat，Oberschwaben，德国）量化蛋白质表达。

人RD细胞膜毒性与细胞内ATP含量

接下来，我们检查了人RD细胞的膜毒性和ATP含量( 图2 ). 伊马替尼降低了细胞内ATP含量，但仅表现出轻微的膜毒性( 图2A ). 当伊马替尼存在时，50µM时几乎没有留下ATP，而在此浓度下只有30%的细胞被溶解( 图2A ). 正如在C2C12成肌细胞和肌管中观察到的那样，即使在使用的最高浓度（20µM）下，暴露于厄洛替尼24小时对RD细胞也没有膜毒性，并且也不会影响细胞ATP含量( 图2B ). 在达沙替尼存在下，细胞内ATP池从0.5µM开始以浓度依赖的方式减少，而膜毒性仅在100µM时观察到( 图2C ). 由于伊马替尼和达沙替尼的膜毒性浓度高于ATP耗竭浓度，这些结果表明线粒体毒性先于膜毒性( 补充表2 ). 这些在人类RD细胞中的发现证实了我们在C2C12成肌细胞和肌管中的观察结果。在这些细胞系中，厄洛替尼在高达20µM（由于在水性环境中的溶解度有限，可能达到最高浓度）时无毒。因此，我们决定继续观察暴露于伊马替尼和达沙替尼的C2C12肌管和人类RD细胞。

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图2

人RD细胞的膜毒性和细胞内ATP含量。接触伊马替尼浓度增加后的膜毒性（AK释放）和ATP含量（A），厄洛替尼（B） ，和达沙替尼（C）在RD细胞中持续24小时。数据表示为0.1%Triton X（设置为100%）下AK释放量的%，或0.1%DMSO（设置为100）下ATP含量的%。数据表示至少四个独立实验的平均值±SEM。采用单因素方差分析（ANOVA）和Dunnett的后验，将TKIs治疗组与0.1%二甲基亚砜对照组进行比较*p<0.05与0.1%二甲基亚砜控制。

C2C12肌管和人RD细胞线粒体膜电位

作为下一步，作为对线粒体膜电位的评估，在C2C12肌管和人类RD细胞中测定了伊马替尼和达沙替尼对线粒体积累藏红素的影响(Perevoshchikova等人。，2009;Krumschnabel等人。，2014). 我们发现肌管暴露于达沙替尼（1µM）24小时后显示减少ΔΨ _米在C2C12肌管中( 图3A )和RD单元中( 图3B ). 伊马替尼（20µM）减少ΔΨ _米在C2C12肌管中( 图3A )，但不在RD单元格中( 图3B ).

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图3

暴露于伊马替尼和达沙替尼24小时的C2C12肌管和人RD细胞中线粒体膜电位和电子传递链酶复合体的活性。（A、B）C2C12肌管和RD细胞的线粒体膜电位。（C、D）透性肌管和RD细胞中电子传递链酶复合物的活性。数据表示至少三个独立实验的平均值±SEM。采用单因素方差分析（ANOVA）和Dunnett的后验，将TKIs治疗组与0.1%二甲基亚砜对照组进行比较*p<0.05与0.1%二甲基亚砜控制。伊马，伊马替尼；达斯，达沙替尼。

C2C12肌管和人RD细胞中ETC酶复合物的活性

我们观察到细胞ATP含量降低和线粒体膜电位耗散，这可能是由线粒体呼吸链受损引起的(Haegler等人。，2017). 因此，使用高分辨率呼吸测量系统测量C2C12肌管和人类RD细胞通过ETC复合体的呼吸容量。将肌管和RD细胞暴露于伊马替尼（20μM）和达沙替尼（1μM）24小时。在C2C12肌管中，两种TKI均显著削弱ETC复合物I的活性( 图3C ). 此外，两种TKI的ETC复合物II活性也降低，但没有达到统计学意义( 图3C ). 然而，暴露于伊马替尼和达沙替尼的C2C12肌管中的ETC复合物III和IV没有受到影响( 图3C ). 在RD细胞中，两种TKI均显著削弱ETC复合物I的活性( 图3D ). 此外，达沙替尼降低了复合物II、III和IV的活性( 图3D ). 这些发现证实了两种细胞模型中两种TKI的线粒体毒性。

C2C12肌管和人RD细胞线粒体超氧化物的积累

毒物抑制复合物I可刺激线粒体产生超氧化物(品牌，2010;品牌，2016). 因此，我们测定了暴露于伊马替尼和达沙替尼24小时的C2C12肌管和人RD细胞中线粒体超氧化物的积累。伊马替尼在两种细胞模型中50µM时线粒体超氧化物开始显著增加( 图4A、B ). 达沙替尼从1µM开始增加肌管中的超氧物积累( 图4C )但在人类RD细胞中已经达到0.2µM( 图4D ). Erlotinib没有增加肌管和RD细胞中线粒体超氧化物的积累，这证实了这种特殊的TKI在20µM以下不是线粒体毒物( 补充图1 ).

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图4

C2C12肌管和人RD细胞中的线粒体超氧化物积累。伊马替尼浓度增加时线粒体超氧化物积累（A、B）和达沙替尼（C、D）持续24小时。数据表示至少五个独立实验的平均值±SEM。采用单因素方差分析（ANOVA）和Dunnett的后验，将TKIs治疗组与0.1%二甲基亚砜对照组进行比较*p<0.05与0.1%二甲基亚砜控制。

线粒体积累超氧物可以诱导抗氧化防御系统。SOD2仅位于线粒体基质中，可降解线粒体超氧化物，并可随着线粒体超氧化物的积累而上调(富凯和Ushio-Fukai，2011年). 事实上，伊马替尼（20µM）和达沙替尼（1µM( 图5A、B ). 肌管中SOD1的蛋白表达不受任何TKI治疗的影响( 图5A、B ). 在人类RD细胞中，达沙替尼暴露增加了草皮1和草皮2( 图5C ). 然而草皮1和草皮2不受伊马替尼治疗的影响( 图5C ).

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图5

C2C12肌管和人RD细胞的抗氧化防御。（A）蛋白质印迹显示C2C12肌管中SOD1、SOD2、TRX1、TRX2和GAPDH的表达水平。（B）该图显示了针对GAPDH标准化的蛋白质表达的量化。（C）RD细胞抗氧化防御相关基因的mRNA表达。数据表示三个独立实验的平均值±SEM。采用单因素方差分析（ANOVA）和Dunnett的后验，将TKIs治疗组与0.1%二甲基亚砜对照组进行比较*p<0.05与0.1%二甲基亚砜控制。伊马，伊马替尼；达斯，达沙替尼；超氧化物歧化酶；TRX、硫氧还蛋白。

硫氧还蛋白在清除活性氧（ROS）中也发挥重要作用，并参与细胞的氧化还原调节过程(Hanschmann等人。，2013). 我们测量了暴露于伊马替尼和达沙替尼24小时的肌管中TRX1（细胞溶质）和TRX2（线粒体）的蛋白表达( 图5A、B ). 两种TKI均导致TRX2蛋白表达增加( 图5A、B )也可以解释为抗氧化防御反应。TRX1的蛋白表达不受任何TKI治疗的影响( 图5A、B ). 在人类RD细胞中Trx1型和Trx2型未受到两种TKI治疗的影响( 图5C ).

C2C12肌管和人RD细胞中的线粒体DNA拷贝数和线粒体增殖

线粒体毒物损害ETC并导致超氧化物积累，可损伤线粒体DNA并影响线粒体增殖(Meyer等人。，2013;Singh等人。，2019). 因此，我们测量了线粒体DNA拷贝数和线粒体增殖标记。伊马替尼和达沙替尼均降低C2C12肌管和RD细胞的线粒体拷贝数( 图6A、B 分别）。由于线粒体增殖受损，线粒体DNA也会随着氧化损伤而减少。因此，在C2C12肌管和RD细胞中测量线粒体生物发生相关基因的mRNA表达。过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅活化子的mRNA表达α(Pgc-1α),Pgc-1β，核呼吸因子1(编号1),编号2和线粒体转录因子A(Tfam公司)在C2C12肌管中，伊马替尼和达沙替尼的作用减弱，表明这两种TKI均损害线粒体增殖( 图6C ). 在人类RD细胞中，达沙替尼显著降低Pgc-1α、Pgc-1β、Nrf1和Nrf2( 图6D ). 此外，伊马替尼显著降低了编号2mRNA表达和降低Pgc-1α,Pgc-1β、和编号1，但未达到统计显著性( 图6D ).

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图6

暴露于伊马替尼和达沙替尼24小时的C2C12肌管和人RD细胞线粒体DNA拷贝数和线粒体生物发生标记。（A、B）C2C12肌管和RD细胞中的线粒体DNA拷贝数。（C、D）信使核糖核酸的表达Pgc-1α,Pgc-1β,编号1,编号2、和Tfam公司分别参与C2C12肌管和RD细胞的线粒体生物发生。数据表示至少三个独立实验的平均值±SEM。采用单因素方差分析（ANOVA）和Dunnett的后验，将TKIs治疗组与0.1%二甲基亚砜对照组进行比较*p<0.05与0.1%二甲基亚砜控制。伊马，伊马替尼；达斯，达沙替尼；第1页过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅活化子1；Nrf（奈夫），核呼吸因子；Tfam公司，线粒体转录因子A。