TREM2通过抑制PI3K/NF‐κB信号抑制小鼠小胶质细胞的炎症反应

转染

BV2电池（4×10⁶细胞/孔）在六孔板中培养过夜，并根据制造商的说明，使用Amaxa Nucleofector（中国上海龙沙）中的胶质特异性Nucleofector试剂盒通过电穿孔转染200 nM TREM2特异性siRNA或对照siRNA。将转染的细胞培养48小时，分别产生BV2/siRNA和BV2/siRNA‐TREM2细胞。

siRNAs的序列为

对照siRNA:forward′5‐UUCUCCGAACGUGUCACGUTT‐3′，

背面为“5‐ACGUGACACGUGGAGAATT‐3”；

TREM2‐siRNA1：正向'5‐GACGUUGUAACUGAAATT‐3′

反向5′-UUGUCAGUACCAACGUCTT‐3′；

TREM2‐siRNA2：前5′‐GUCCAUAAGGAUGCAAUTT‐3′，

背面5′‐AUUGCAUCCUUAGAUGGACTT‐3′；

TREM2‐siRNA3：正向5′‐GACCUUUCAUUCAGAGUTT‐3′

通过Western blot检测TREM2表达的相对水平。为了产生TREM2过度表达，从cDNA文库中扩增TREM2的cDNA，并将其克隆到pC1质粒（美国麦迪逊市普罗米加）中，生成p‐TREM2，然后进行测序（Wang等人。，2016). 通过电穿孔将对照pC1或p‐TREM2转染BV2细胞。用G418处理细胞3周，以产生稳定的对照BV2/NC、TREM2高表达BV2/TREM2细胞。通过定量RT-PCR和Western blot分析测定TREM2表达的相对水平。

NO和LDH的测量

将BV2、BV2/NC、BV2/TREM2、BV6/siRNA和BV2/siRNA-TREM2细胞用载体或10μM LY294002（PI3K抑制剂，中国上海）预处理1 h，并将载体或1μg/mL LPS（Sigma）预处理24 hh.使用Griess反应试剂盒（中国南京建成）测定培养细胞上清液中的亚硝酸盐浓度（NO的指示物）。简单地说，将每组培养上清液的等份与等量的Griess试剂[（1%磺胺基/0.1%N‐（1‐萘基）‐乙二胺盐酸盐/2.5%H_三人事军官₄]持续15分钟，并使用微孔板分光光度计在540nm处测量吸光度。根据不同浓度亚硝酸钠的标准曲线，测定亚硝酸盐的浓度。

同样，根据制造商的说明，使用2,4-二硝基苯肼显色比色试剂盒（中国南京建成）检测各组细胞上清液中的LDH浓度。使用微孔板分光光度计在440 nm处测量LDH浓度的吸光度，并根据标准曲线进行计算。

细胞活力

BV2、BV2/NC、BV2/TREM2、BV6/siRNA和BV2/siRNA‐TREM2细胞（1×10⁴细胞/孔）在96孔板中培养过夜。细胞用载体或10μM LY294002（中国上海MCE）预处理1 h，用载体或1μg/mL LPS处理24 h。在最后2 h培养期间，将单个细胞孔暴露于10μL CCK‐8溶液（SAB）中，并在450℃下测量吸光度微板阅读器中的nm（Molecular Devices，CA，USA）。

细胞凋亡测定

BV2、BV2/NC、BV2/TREM2、BV6/siRNA和BV2/siRNA‐TREM2细胞（10⁶细胞/孔）在60mm塑料皿中培养过夜。用LPS（1μg/mL）刺激细胞24小时。随后，用Annexin V‐FITC和碘化丙啶（PI）对细胞进行染色，并测定凋亡FITC的百分比⁺和FITC⁺圆周率⁺流式细胞术分析细胞。

酶联免疫吸附试验（ELISA）

BV2、BV2/NC、BV2/TREM2、BV6/siRNA和BV2/siRNA‐TREM2细胞（1×10⁴细胞/孔）在96孔板中培养过夜。细胞用载体或10μM LY294002预处理1 h，用载体或1μg/mL LPS处理24 h。根据制造商的协议，使用特定试剂盒（BD Bioscience）通过ELISA测定不同组细胞上清液中IL-1β、TNF-α、IL-10和TGF-β的水平。

免疫荧光

将不同组的细胞培养在玻璃盖玻片中，并在60°C下干燥过夜，然后在TBS中再水化60 min。将细胞在98°C的改良柠檬酸盐抗原回收液（Beyotime）中进行抗原回收20 min。用TBS洗涤五次后，用免疫染色封闭缓冲液（Beyotime）封闭盖玻片30分钟，然后用抗TREM2（1:1000稀释液，Bioss，Boston，USA）在4°C下孵育过夜。用TBS清洗盖玻片五次，并在室温（RT）下用抗-TREM2培养60分钟。清洗后，在室温下用4′，6′-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）对细胞进行复染5分钟，并用防褪色聚乙烯吡咯烷酮培养基（Beyotime）固定。图像是在荧光显微镜下采集的（日本东京奥林巴斯）。

吞噬试验

BV2、BV2/NC、BV2/TREM2、BV6/siRNA和BV2/siRNA‐TREM2细胞（1×10⁴细胞/孔）用载体或10μM LY294002预处理1小时，然后用载体或1μg/mL LPS处理24小时。随后，将单个细胞孔暴露于0.4µL荧光标记的乳胶珠（F8775，Invitrogen）中，温度为37°C，CO含量为5%₂清洗后，将细胞固定在4%多聚甲醛中，并用5%山羊血清处理（中国北京中山金桥生物技术有限公司）。将细胞与兔抗鼠Iba‐1在4°C下孵育过夜，并用Alexa Fluor 488‐山羊抗兔IgG（H+L）染色（Proteintech，CHI，USA），然后用DAPI进行复染。在荧光显微镜（OLYMPUS）下捕获荧光信号，并使用Image J软件（美国贝塞斯达国立卫生研究院）进行进一步分析。通过计算荧光标记乳胶珠（红色信号）的细胞数与小胶质细胞总数（绿色信号）的比值来确定阳性吞噬细胞的百分比。

逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）

使用TRIzol试剂（Invitrogen）提取总RNA，并使用Prime Script RT Master Mix Kit（TaKaRa）反向转录到cDNA。根据制造商的说明，使用SYBR Premix和Super Script One‐Step RT-PCR System（Applied Biosystems）上的特定引物，通过定量PCR测定TREM2和β-actin的相对水平。PCR扩增一式三份。数据由2人分析^-ΔΔCt.

TREM2正向引物'5‐GAGACCTCCTTCCCACCACCT‐3′，

反向引物'5‐GGCTTCTTGCCCCCCTG‐3′；

β-actin正向引物‘5‐AGGTCGGTGAACGGATTTG‐3’，

反向引物‘5‐GGGTCGTATGCAACA‐3’。

蛋白质印迹

收集不同组的细胞并在添加有1 mM苯甲烷磺酰氟（PMSF，Sigma）的裂解缓冲液（Beyotime）中进行裂解，然后在12000℃离心克在4°C下保持15分钟。在使用Bicyconinic Acid protein Assay Kit（Beyotime）定量蛋白质浓度后，通过十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS–PAGE）在12%凝胶上分离细胞裂解物（30μg），并转移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF，Millipore）上。在TBST（1 mM Tris，150 mM NaCl，0.1%Tween20，pH 7.4）RT中用5%无脂干乳封闭斑点2 h，并在4°C下过夜用一级抗体进行探测。主要抗体包括抗TREM2（bs2723R，Bios）、抗GAPDH（AP0063，Bioworld，Minneapolis–Saint Paul，Minneopolis，USA）、抗pAKT（AF0016）、抗p‐NF‐kBp65（AF2006，Affinity）和抗‐β-actin（ab8226，Abcam）。洗涤后，用辣根过氧化物酶（HRP）检测结合抗体结合二级抗体，并使用超级信号West Dura延长持续时间基板（Thermo Scientific Pierce）进行可视化。通过使用ChemiDoc XRS+系统（Bio‐RAD）进行密度扫描，确定要控制的目标蛋白的相对水平。

TREM2促进LPS刺激的BV2小胶质细胞吞噬作用，PI3K信号抑制了该作用

为了进一步研究TREM2表达改变的功能后果，我们测试了不同组BV2小胶质细胞的吞噬作用。如图所示​图3，三LPS处理显著增加了吞噬BV2细胞的百分比，TREM2过度表达显著增强了吞噬BV2细胞的百分比。PI3K抑制剂的治疗并未影响LPS刺激的吞噬作用，但显著增加了吞噬BV2/TREM2细胞的百分比（图​（图3A三A和​和3B）。三B） 。相反，TREM2的敲低显著降低了LPS刺激的BV2细胞吞噬作用，而用PI3K抑制剂预处理则消除了这种作用（图​（图3C三C和​和3D）。三D） ●●●●。此外，PI3K信号通路的阻断增加了吞噬BV2细胞的百分比。这些独立的证据表明，TREM2促进LPS刺激的BV2细胞吞噬作用，而PI3K信号则抑制了这种吞噬作用。

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图3

TREM2表达的改变改变了LPS刺激的PI3K抑制BV2细胞吞噬功能。用或不用PI3K抑制剂预处理不同组的细胞，并用或不用LPS刺激24小时。随后，用荧光标记的乳胶珠在37°C、5%CO下处理不同组的细胞₂清洗1小时后，用兔抗鼠Iba‐1和Alexa Fluor 488‐山羊抗兔IgG对细胞进行染色，然后用DAPI进行复染。对细胞进行光成像，并计算吞噬（红色）细胞在总DAPI+细胞中的百分比。数据是具有代表性的图像，或表示为来自三个单独实验的每组细胞的平均值±SD。（A和B）诱导TREM2过度表达增强了LPS诱导的PI3K抑制BV2细胞吞噬作用。（C和D）敲低TREM2表达可减少LPS诱导的PI3K抑制BV2细胞吞噬作用。在图中​图3B：三B： a.BV2 B.BV2+LPS c.BV2+TREM2 WT+LPS d.BV2+TREM2过度表达+LPS e.BV2+TREM2 WT+PI3K抑制剂+LPS，f:BV2+TRAM2过度表达+PI3K-抑制剂+LPS。第25页，共31页细胞生物学国际仅供参考图​图3D，三D、 a.BV2 b.BV2+LPS c.BV2+SiRNA ctrl+LPS D.BV2+SiRNA TREM2+LPS e.BV2+SiRNA ctrl+PI3K抑制剂+LPS f.BV2+SiRNA TREM2+PI3K-抑制剂+LPS**P（P）与BV2细胞相比<0.01。^## P（P）与BV2/NC相比<0.01^{^^} P（P）与BV2/NC或BV2/NC-siRNA-ctrl细胞相比<0.01^&& P（P）与BV2/NC PI3K抑制剂或BV2/NC-siRNA ctrl PI3K抑制细胞相比，<0.01。

TREM2减少LPS诱导的PI3K增强的BV2细胞凋亡

接下来，我们研究了TREM2表达的改变是否影响BV2细胞的存活。用或不用PI3K抑制剂对不同组的细胞进行预处理，并用或不使用LPS刺激24小时。通过流式细胞仪测定凋亡细胞的百分比。如图所示​图4A4A和​以及4B，4B、 LPS刺激可显著增加凋亡BV2细胞的百分比，TREM2过度表达或PI3K抑制剂预处理可显著减轻这一比例。PI3K抑制剂预处理几乎完全消除了LPS增强的BV2/TREM2细胞凋亡。相反，TREM2表达的下调显著增加了凋亡细胞的百分比，而PI3K抑制剂的预处理显著降低了凋亡细胞百分比（图​（图4C4C和​和4D）。4D） ●●●●。同样，PI3K抑制剂的预处理也减少了LPS增强的BV2细胞凋亡。因此，TREM2作为拮抗剂对抗LPS诱导的PI3K信号增强的BV2细胞凋亡。

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图4

TREM2减少LPS诱导的PI3K增强的BV2细胞凋亡。将BV2、BV2/NC、BV2/TREM2、BV6/siRNA和BV2/siRNA-TREM2细胞预先处理为三份，分别用或不用PI3K抑制剂LY294002处理1h，用或不使用LPS刺激24h。通过流式细胞术测定凋亡细胞的百分比。数据是具有代表性的流式细胞仪图表，或表示为来自三个单独实验的每组细胞的平均值±SD。（A和B）TREM2过表达的诱导减少了LPS诱导的PI3K增强的BV2细胞凋亡。（C和D）TREM2表达的下调增加了LPS诱导的BV2细胞的PI3K增强凋亡**P（P）与BV2细胞相比<0.01^## P（P）与BV2/NC相比<0.01^{^^} P（P）与BV2/NC或BV2/NC-siRNA-ctrl细胞相比<0.01^&& P（P）与BV2/NC PI3K抑制剂或BV2/NC-siRNA ctrl PI3K抑制细胞相比，<0.01。

TREM2抑制BV2细胞中LPS刺激的PI3K依赖性NO和LDH的生成

为了了解TREM2的调节作用，我们进一步检测了不同组细胞中NO生成和LDH的水平。如图所示​图5A5A和​和5B，5B、 LPS刺激上清液中高水平的NO生成和BV2细胞中的LDH活性，TREM2过度表达或PI3K抑制剂预处理显著降低了这些活性。同样，PI3K抑制剂的预处理增强了TREM2介导的对LPS刺激的BV2细胞NO生成和LDH活性的抑制。相反，TREM2的敲除增加了NO和LDH活性水平（图​（图5C5C和​和5D）。5D） ●●●●。在BV2和BV2/TREM2细胞中，用PI3 K抑制剂预处理显著减轻了LPS刺激的NO生成和LDH活性。总之，这些数据表明TREM2抑制了BV2细胞中LPS刺激的PI3K依赖性NO和LDH的生成。

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图5

TREM2抑制BV2细胞中LPS刺激的PI3K依赖性NO生成和LDH活性。将BV2、BV2/NC、BV2/TREM2、BV6/siRNA和BV2/siRNA-TREM2细胞预先处理为三份，分别加入或不加入PI3K抑制剂LY294002，处理1h，并加入或不添加LPS刺激24h。测定培养细胞上清液中NO的浓度，分析不同细胞组中的LDH活性。数据表示为三个独立实验中每组细胞的平均值±SD。（A和B）诱导TREM2过度表达可减少LPS诱导的PI3K增强的BV2细胞NO生成和LDH活性。（C和D）TREM2表达的敲除增加了LPS诱导的PI3K增强的BV2细胞中NO的产生和LDH活性**P（P）与BV2细胞相比<0.01^## P（P）与BV2/NC相比<0.01^{^^} P（P）与BV2/NC或BV2/NC-siRNA-ctrl细胞相比<0.01^&& P（P）与BV2/NC PI3K抑制剂或BV2/NC-siRNA ctrl PI3K抑制细胞相比，<0.01。

TREM2减弱LPS诱导的PI3K依赖性IL-1β和TNF-α，但增强BV2细胞中IL-10和TGF-β的表达

我们进一步研究了TREM2表达改变对不同组细胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-10和TGF-β水平的影响。LPS刺激显著增加了培养的BV2细胞上清液中TNF-α和IL-1β的水平，但降低了IL-10和TGF-β的水平（图​（图6A）。6A） ●●●●。TREM2过度表达的诱导减轻了LPS刺激的TNF-α和IL-1β，LPS减少了BV2细胞中IL-10和TGF-β的生成。此外，PI3K抑制剂预处理显著减轻了LPS调节的TNF-α、IL-1β，同时增加了BV2和BV2/TREM2细胞中IL-10和TGF-β的生成。相反，TREM2表达的下调显著增强了LPS刺激的TNF-α和IL-1β，LPS减少了BV2细胞中IL-10和TGF-β的生成（图​（图6B）。6B） 。用PI3K抑制剂预处理可显著消除BV2细胞中LPS刺激的TREM2增强的TNF-α和IL-1β，并挽救LPS减少的TREM 2沉默增强的BV2电池中IL-10和TGF-β的产生。因此，TREM2可减弱LPS诱导的PI3K依赖性IL-1β和TNF-α，但可增强BV2细胞中IL-10和TGF-β的表达。

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图6

TREM2调节BV2细胞中LPS刺激的细胞因子的产生。用或不用PI3K抑制剂LY294002预处理BV2、BV2/NC、BV2/TREM2、BV2/siRNA和BV2/siRNA-TREM2细胞1h，用或不使用LPS刺激24h。用ELISA测定不同组细胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-10和TGF-β1的浓度。数据表示为三个独立实验中每组细胞的平均值±SD。（A） 诱导TREM2过度表达可降低LPS诱导的PI3K增强的PI3K-依赖性TNF-α、IL-1β，但可促进BV2细胞中PI3K依赖性IL-10和TGF-β1的表达。（B） TREM2表达的下调增强了LPS诱导的PI3K依赖性TNF-α、IL-1β，但降低了BV2细胞中PI3K特异性IL-10和TGF-β1的表达**P（P）与BV2细胞相比<0.01^## P（P）与BV2/NC相比<0.01^{^^} P（P）与BV2/NC或BV2/NC-siRNA-ctrl细胞相比<0.01^&& P（P）与BV2/NC PI3K抑制剂或BV2/NC siRNA ctrl PI3K抑制剂细胞相比，<0.01。

CX.L获得了浙江省自然科学基金LY16H150001、浙江省中医药科技计划2016ZA118和国家自然科学基金81491566的资助。