PICS期间脾脏中不同的中性粒细胞群

摘要

介绍

脓毒症早期诊断和治疗的最新进展提高了总体生存率。然而，脓毒症幸存者的长期康复仍然很差，经常导致慢性危重病状态(1). 这种情况通常与免疫系统受损有关，也称为持续炎症、免疫抑制和分解代谢综合征（PICS）(2). 因此，这些患者患有多种并发症，伤口愈合不良，残疾增加，易受继发感染，导致住院时间延长(三). 尽管进行了广泛的护理和干预，约50%的慢性危重病患者在ICU出院后6个月内死亡，对于出院后能够存活至1年的患者，至少20%的患者表现出严重的身体和认知功能障碍，近10%的患者从未回家(三,4). 脓毒症相关慢性危重病的治疗干预失败主要是由于缺乏脓毒症后发生的免疫功能障碍的可用信息。

中性粒细胞是感染的关键反应者，因为活化的中性粒细胞被募集到细菌入侵的部位来发挥其抗菌功能(5). 历史上，人们认为，细菌清除后，中性粒细胞大多迁移到脾脏进行细胞死亡，而骨髓进行紧急骨髓生成以再生中性粒细胞群(6). 然而，我们的数据显示，在PICS小鼠模型中，脾脏中显著积聚了不同但有功能的中性粒细胞群，这表明这些细胞可能在继发感染和/或对脓毒症的整体全身反应中发挥作用。

中性粒细胞的滚动和迁移涉及跨膜糖蛋白和粘附分子，L-选择素（CD62L）与β₂-整合素激活和与细胞内粘附分子（ICAM-1）等反受体的粘附（CD54）(7,8). CD62L从中性粒细胞质膜的胞外区脱落表示中性粒细胞激活或部分激活（启动），与巨噬细胞1抗原（Mac-1）（CD11b/CD18）β的成分CD11b上调一致₂-整合素亚家族(9). 活化中性粒细胞表面标志物CD54的出现与逆向内皮细胞迁移相关，其表达被炎症刺激增加(10,11). 显示抗肿瘤表型的中性粒细胞显示CD54表达增加(12)而表达CD54的中性粒细胞也与慢性全身炎症有关(13). 然而，这些中性粒细胞亚群的功能特性尚不明确(14). 在我们使用小鼠PICS模型的研究中，我们发现髓源性脾中性粒细胞（Ly6G⁺CD11b型⁺)根据表面CD54表达，明显包括两个种群。因此，我们决定进一步研究CD54亚群（CD54高和低）的特征，以帮助理解PICS中的免疫抑制。虽然已知脾脏可以作为髓外造血的场所，但这些脾脏中性粒细胞的确切作用和功能特性尚不清楚。因此，我们研究的目的是更好地描述和定义这些中性粒细胞亚群的免疫功能，以深入了解PICS的发病机制。

材料和方法

结果

PICS小鼠脾脏同时容纳CD54高表达和CD54低表达的中性粒细胞

用中性粒细胞和髓细胞标记物（分别为Ly6G和CD11b）标记未接触（Unt）小鼠和CLP（盲肠结扎和穿刺）后不同日期小鼠脾脏的单细胞悬液，以检测成熟中性粒细胞。此外，还量化了脾脏与体质量的比值，以证实与健康小鼠相比，CLP小鼠脾脏质量逐渐增加(图S1). 与Unt小鼠相比，PICS小鼠（CLP后第8天）的中性粒细胞总数显著增加(图1A). 此外，基于CD54表面标记物的表达分析了PICS脾脏中的中性粒细胞。虽然大多数脾中性粒细胞表达CD54，但有明显的CD54高（CD54^你好)和CD54低（CD54^洛)表达细胞，其中大多数是CD54^洛PICS期间的单元格(图1B). 然而，在Unt脾脏中，CD54表达细胞的数量明显较少，CD54的数量没有明显的分离或差异^洛细胞与CD54比较^你好单元格(图1B). 构成CD54的人口百分比^洛细胞主要形成与CD54不同的峰^你好PICS脾脏中的人群与典型FACS图像中所示的Unt细胞不同(图1C). 有趣的是，当我们比较CD54的中性粒细胞数量时^你好与CD54相比^洛在CLP后第2-8天的PICS脾脏中，我们发现CD54^你好感染后急性期的人群明显增多，但随着时间的推移，CD54逐渐升高^洛种群成为优势表型。当所有小鼠发育成PICS时，比率反转，CD54^洛中性粒细胞显著高于CD54^你好种群，不像美国老鼠(图1D). 从CLP后第2天到第8天，对照组Unt小鼠的总WBC计数从8600万到1.74亿不等，CLP小鼠的总白细胞计数从870万到大幅度增加的5.52亿。总之，这些结果表明PICS脾脏中出现了两个不同的中性粒细胞群。

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图1

在持续性炎症、免疫抑制和分解代谢综合征（PICS）小鼠中，脾脏含有CD54高表达和CD54低表达的中性粒细胞。从未接触（Unt）小鼠或CLP后小鼠（pCLP）中获取脾脏，用Ly6G、CD11b和CD54抗体对单细胞悬液进行标记，然后在不同时间点进行流式细胞术分析。散点图描绘（A）、Unt和pCLP第8天（PICS）小鼠脾脏中性粒细胞总数（Ly6G+CD11b+）和（B）表达高CD54（CD54）的中性粒细胞数量^你好)和低CD54（CD54^洛)在Unt和PICS脾脏中。黑色条表示平均值±SEM值*第页<0.05被认为是显著的。（C）直方图显示典型小鼠（Unt，左；PICS，右）脾脏中性粒细胞CD54表达模式，高表达（R6门）或低表达（R7门）。实验至少重复了三次。（D）显示CD54中性粒细胞数量的折线图^你好或lo在第2天（d2）、第4天（d4）、第6天（d6）和第8天（d8）在Unt和CLP小鼠脾脏中表达。Unt与pCLP、CD54的三元方差分析^你好与CD54lo相比，时间（天）使数据显著(第页< 0.05).

CD54型^你好中性粒细胞显示促炎性，而CD54^洛中性粒细胞显示趋化性和归巢性

为了探索CD54的功能^你好和CD54^洛然后，我们评估了这些细胞产生活性氧、吞噬和形成中性粒细胞胞外陷阱（NETs）的能力。进行DHR分析，通过测量DHR的氧化来评估ROS的生成。CD54型^洛与CD54相比，细胞的ROS生成显著降低^你好细胞的平均荧光强度（MFI）图2A此外，CD54^洛与CD54相比，细胞的吞噬作用和NETosis显著降低^你好中性粒细胞(图2B,C类).

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图2

CD54型^你好中性粒细胞具有促炎特性。用Ly6G、CD11b和CD54标记来自持续炎症、免疫抑制和分解代谢综合征（PICS）小鼠的脾细胞，并用流式细胞术分别进行功能检测，如二氢罗丹明（DHR），以测量活性氧（ROS）、pHrodo（吞噬作用）和NETosis。散点图显示（A）DHR的ROS平均荧光强度（MFI），（B）pHrodo+细胞百分比，以及（C）MPO+H3+细胞（NETosis）和CD54的总数百分比^你好或CD54^洛表达脾中性粒细胞。实验至少重复了三次。散点图中的黑色条表示平均值±SEM值*第页<0.05被认为是显著的。

虽然这些研究表明CD54^洛细胞在性质上可能不太具有促炎性，与CD54相比，该群体表现出更强的趋化能力^你好单元格(图3A). 为了进一步评估这一点，我们检测了两个群体中表面CXCR4和总CXCR2的表达。PICS期间，脾脏中性粒细胞上的大多数CXCR4表达是细胞内的，总CXCR4相对于表面CXCR4明显更多（平均总MFI值为13854±4849，而平均表面MFI为3034±684）。然而，CD54^洛与CD54相比，中性粒细胞表面和总CXCR4表达显著减少^你好单元格(图3B、D). 对于CXCR2，大多数表达在表面上，CXCR2的总水平和表面水平几乎相似（平均总MFI值为1537±444，而平均表面MFI为1321±826）。而两个CD54^你好并且lo细胞具有CXCR2的等效表面表达，CD54的总水平降低^洛细胞，表明CXCR2受体在刺激后再循环回表面的可用性较低(图3C,E类). 总之，这些结果表明CD54具有较高的趋化和归巢能力，但炎症功能较低^洛细胞，而CD54^你好PICS期间，细胞具有更大的炎症功能，趋化反应降低。

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图3

CD54型^洛中性粒细胞表现出更强的趋化性。对从持续炎症、免疫抑制和分解代谢综合征（PICS）小鼠分离的脾细胞进行趋化性分析，然后收集以标记Ly6G、CD11b、CD54，或者直接与CXCR4和CXCR2以及Ly6G，CD11b和CD54共标记，然后进行流式细胞术分析。（A）绘制PICS小鼠脾脏中性粒细胞趋化性百分比，以量化总趋化性以及CD54中的趋化性^你好和CD54^洛细胞。散点图显示（B）CXCR4和（C）CXCR2和（D）CXCR4和（E）CD54上的CXCR2^你好和CD54^洛PICS小鼠脾中性粒细胞。实验至少重复了两次。散点图中的黑色条表示平均值±SEM值*第页<0.05被认为是显著的。

CD54型^你好细胞是第一个繁殖群体而CD54^洛细胞参与后期循环

接下来，我们调查了CD54高和低水平人群的增殖和细胞周期分布，以评估他们是否对紧急骨髓生成有不同的贡献。为了检测增殖中性粒细胞的细胞周期状态，我们使用流式细胞术通过碘化丙啶（PI）染色分析细胞的增殖特异性标记Ki-67和DNA含量(22). Ki-67⁺群体包括活跃细胞周期阶段（G₁、S和G₂/M） ，而静止或静止（G₀)Ki-67细胞呈阴性。PI vs.Ki-67门控用于确定CD54的分布^你好和CD54^洛亚G细胞₁（DNA片段化的凋亡细胞），G₁、S、G₂/M、 和G₀CLP后第2-8天小鼠脾脏的阶段(图S2). 编号G₀在两个细胞群中都检测到该事件，表明所有中性粒细胞在感染后都已进入活跃的细胞周期阶段(图S2). CD54型^你好发现细胞在CLP后第6天循环，此时大多数细胞在G₂/M、 有些在S相，但在G相最少₁阶段。第8天，S和G₁事件进一步减少，最低为G₁最大值（>80%）为G₂/M（M）(图4A). 这表明所有循环细胞逐渐达到G₂/M没有进一步回收或新电池进入G₁CLP后第8天。另一方面，CD54^洛中性粒细胞在CLP后2-8天表现出几乎相反的细胞周期动力学模式。大多数事件（>80%）在G中暂停₁在CLP后的第2-4天，直到CLP后的第6天左右，当CD54^洛人口从G开始增长₁至S相(图4B). CD54的转变^洛细胞继续通过G₁-S–G公司₂/CLP后第8天的M期(图4B).

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图4

CD54型^你好细胞是第一个增殖群体，而CD54^洛细胞参与晚期循环。将CLP后第2、4、6和8天（分别为d2、d4、d6和d8）的小鼠脾细胞与Ki-67和PI以及Ly6G、CD11b和CD54进行共标记，以通过Ki-67与PI的流式细胞术门控量化细胞周期相。描绘亚G级事件百分比的条形图₁G公司₁、S和G₂/M相输入（A）CD54型^你好和（B）CD54型^洛CLP后小鼠的中性粒细胞。每一条代表CLP后小鼠脾脏在CLP后各天各细胞周期阶段事件百分比的平均值±SEM(n个= 5–8). 如前所述，对持续炎症、免疫抑制和分解代谢综合征（PICS）小鼠脾脏中性粒细胞进行5-乙炔基-2′-脱氧尿苷（EdU）检测。散点图显示（C）S期结束后中性粒细胞EdU掺入率高（EdU高）的百分比，以及（D）低教育程度合并（低教育程度），总S阶段与CD54相比^你好和CD54^洛PICS小鼠脾细胞。实验至少重复了两次。散点图中的黑色条表示平均值±SEM值*第页<0.05被认为是显著的。ns，不显著。

我们还使用EdU掺入法检测和量化CD54中的增殖细胞^你好和CD54^洛PICS期间的人口。CLP后第7天向小鼠注射EdU，CLP后24小时后第8天采集细胞进行分析。两个群体的细胞在完全S期后完成了EdU的最大掺入（EdU高）(图4C)，CD54^你好略高于CD54（约4%）^洛细胞，但无统计学意义。有趣的是，到CLP后第8天，尚未完成S期的细胞（持续S期）和合并相对较少EdU（EdU低）的CD54中的细胞显著较高（约10%）^洛与CD54相比^你好人口(图4D). 这个结果也支持了我们之前的细胞周期数据，即CD54^你好种群逐渐完成S阶段并进入下一阶段（G₂/M） 而CD54^洛CLP后6-8天，人群开始积极循环(图4A,B类). 综上所述，这些数据表明，在CLP之后，CD54^你好细胞可能参与了紧急骨髓生成，因为它们在感染的急性期（CLP后2-4天）增殖更多。另一方面，CD54^洛这些细胞在CLP后第6天开始循环，可能在稍后的时间点（CLP后6-8天）参与髓外造血。这再次支持了我们的发现CD54^洛CLP后第8天，细胞包含大多数中性粒细胞(图1D)与CD54相比^你好随着时间的推移逐渐减少的细胞。

CD54型^洛中性粒细胞不是PICS中的抑制细胞

如上所述，CD62L的表达可能有助于确定中性粒细胞的成熟程度。此外，据报道，CD62L的一个子集^昏暗的中性粒细胞可作为粒细胞来源的髓源性抑制细胞（MDSC），并可通过Mac-1（CD11b/CD18）或ROS依赖性方式导致免疫抑制(23). 当我们评估CD54时^你好和CD54^洛根据中性粒细胞亚群CD62L在PICS小鼠中的表达，我们发现CD54^洛CD62L型^洛子集在所有其他子集中显著最高(图5A). 另一方面，CD54^你好CD62L型^洛中性粒细胞明显较少，可能构成CD54的少数群体^你好-活化的中性粒细胞已经脱落CD62L的外结构域。与此相一致，该人群也表现出最大的CD11b表达（数据未显示），表明这些是更成熟的中性白细胞。然而，另一个CD62L^洛CD54型^洛与CD54相比，CD11b的表达明显减少^你好CD62L型^洛细胞。如预期，所有CD62L^你好与CD62L相比，CD11b亚群的表达相对较少^洛细胞，再次表明CD62L可以帮助识别中性粒细胞的成熟期。

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图5

CD54型^洛中性粒细胞不是抑制细胞。CD54高或低表达的中性粒细胞（CD54^你好和CD54^洛)根据粘附标记物CD62L和精氨酸酶1（Arg-1）和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的细胞内表达水平作为髓源性抑制细胞的标记物，进一步对持续炎症、免疫抑制和分解代谢综合征（PICS）小鼠进行流式细胞术分析。散点图显示（A）每种亚型的中性粒细胞百分比，（B）含有精氨酸酶-1的中性粒细胞百分比，以及（C）iNOS在CD62L和PICS中CD54亚群中的表达。实验重复了三次。散点图中的黑色条表示平均值±SEM值*第页<0.05被认为是显著的。

一些研究表明，紧急骨髓生成可能导致骨髓中MDSC过度释放，这可能导致脓毒症后后期出现免疫抑制(24,25). 因此，我们进一步检测了其他MDSC标记物，如细胞内精氨酸酶-1（Arg-1）和iNOS(26,27). 然而，我们的数据表明，PICS小鼠脾脏中<1%的中性粒细胞表达Arg-1或iNOS(图5B、C). 而CD54的两个子集^洛中性粒细胞显著降低了Arg-1和iNOS的表达，这些细胞类型的总数可以忽略不计，并且可能没有临床意义(图5B、C). 综合起来，我们的结果表明相对不成熟的CD54^洛中性粒细胞不是MDSC，但确实降低了整体免疫功能。

讨论

本研究旨在更好地描述CLP后脾脏中性粒细胞群的免疫功能，以提高对PICS发病机制的认识和理解。使用我们的PICS小鼠模型，我们在脾脏中发现了两个离散的中性粒细胞群。一个种群是成熟CD54^你好具有传统促炎特征的细胞在CLP后显著减少，另一种为CD54^洛成熟度较低、炎症特性降低且在PICS期占主导地位的细胞。CD54型^洛中性粒细胞也具有更强的趋化性，并积极增殖，而CD54^你好PICS期间，细胞停止重新进入细胞周期以进一步增殖。这些中性粒细胞均未表现出任何抑制活性，但功能较弱，炎症反应性降低。我们目前的研究已经确定了一种独特的髓外CD54^洛脾脏中性粒细胞群以PICS期间免疫功能降低为特征，这可能解释脓毒症诱导的慢性危重病的病理生理学。

中性粒细胞的异质性可以是表型的，也可以是功能性的，并且在其生命周期的不同水平上表现出来，无论是在稳态还是在疾病条件下(13,28). 感染性炎症可引起中性粒细胞变异的快速变化，作为成熟或激活状态的功能(11,28). 虽然先天免疫反应是对感染的最初反应，但其他细胞反应也很重要。结果表明，中性粒细胞作为先天性反应的主要防御者，也与其他类型的细胞（尤其是T细胞）相互作用，并能真正形成随后的反应，无论是急性反应还是长期反应。此外，众所周知，通常被认为不成熟的髓源性抑制细胞（MDSC）也可能包括中性粒细胞群(11,29). 在我们的PICS小鼠模型中，CD54的早期增殖^你好急性感染后立即出现的细胞提示紧急骨髓生成，而逐渐占主导地位的CD54细胞周期开始较晚^洛脾脏的表型表明骨髓外造血正在进行。然而，这些不同的中性粒细胞群体对败血症后期免疫抑制的贡献尚不清楚。早期研究表明，脓毒症患者的免疫抑制可能是由于急性骨髓造血后持续性骨髓增生异常综合征（MDSC）的扩张所致，这可能导致慢性危重病[回顾于(30)]. 然而，在我们的研究中，我们在PICS脾脏中发现了一个新出现的人群——CD54人群^洛免疫功能下降的中性粒细胞。研究表明，在脓毒症7天后的CLP小鼠中，高达95%的BM细胞是髓系细胞，大多不成熟，功能类似MDSC，随着时间的推移，其逐渐演变为免疫抑制性更强，并浸润脾脏、淋巴结、肺、肝、骨骼肌和脑(2). MDSC通常为粒细胞（CD11b+Ly6G+）和单核细胞（CD11 b+Ly6 G–Ly6C+）。我们选择评估脾脏中的粒细胞，以更好地了解外周免疫细胞的变化，而不仅仅是简单地测量外周血中性粒细胞和单核细胞，这不一定能系统地描述远程组织中的发生。迄今为止，MDSC大多与脓毒症的免疫抑制有关，同时也可能对实质细胞产生潜在的促炎性损伤。有趣的是，在我们的研究中，我们发现促炎性粒细胞（CD11b+Ly6G+CD54）^你好)具有免疫反应性，但较成熟，数量较少，而优势种群包括新增殖的趋化性粒细胞（CD11b+Ly6G+CD54^洛)缺乏免疫反应性。这些CD54^洛细胞还包括主要的亚群CD54^洛CD62L型^洛与功能性CD54相比，CD11b表达相对较低^你好CD62L型^洛并且不表达细胞内Arg-1或iNOS，表明这些细胞不属于MDSC群落。此前，其他报告显示急性炎症期间血液中存在明显的人类中性粒细胞表型，其特征为CD54^明亮的细胞（CD62L^昏暗的/CD16型^明亮的/CD11b型^明亮的/CD54型^明亮的)通过T细胞抑制显示免疫抑制能力(23). CD54的作用^你好和CD54^洛然而，我们的研究中T细胞的功能尚不清楚。

粒细胞生成后能够从骨髓迁移或反向迁移到骨髓以进一步归巢的中性粒细胞，已知通过减少CXCR4/CXCL12信号传导下调CXCR4表达(5). 而CXCR2减少与中性粒细胞粘附有关(31)，已知缺乏CXCR4和CXCR2的中性粒细胞表现出组成型动员，其中CXCR4在中性粒细胞运输中发挥主导作用(32). 在我们的研究中，CD54人群的CXCR2表达总体下降。众所周知，从骨髓中招募成熟和不成熟的中性粒细胞会在脾脏中建立一个生态位(33). 然而，CD54^洛细胞明显缺乏CXCR4的表达，这可能表明该群体具有更强的迁移或归巢能力。

目前的研究仅限于PICS小鼠模型。因此，有必要将本研究扩展到慢性危重病患者。此外，我们还不知道这些不同的脾中性粒细胞群在继发感染中的作用。因此，尽管CD54^洛细胞的炎症功能降低，需要进一步研究以确定它们是否有助于PICS中发生的免疫抑制。我们实验室正在进行的研究将揭示更多有关脓毒症早期和晚期循环中性粒细胞状态和功能的信息，并有助于确定脾脏中性粒细胞在脓毒症后慢性危重病发展中的确切作用。此外，重点研究将有助于研究脾以外组织中任何类似或其他群体的中性粒细胞和/或其他先天免疫细胞在PICS中的作用。

总之，脾脏中相对不成熟、活跃增殖的中性粒细胞的促炎功能明显减少，但在PICS期间保持了趋化能力，这可能是脓毒症后免疫抑制的一个促成因素。针对这些中性粒细胞的治疗策略可能有益于重症脓毒症幸存者，并改善该患者群体的总体预后。

数据可用性声明

本文包含了本研究生成的所有数据集/补充材料.

道德声明

该动物研究由辛辛那提大学动物护理和使用机构委员会审查和批准（方案编号：10-05-10-01）。

作者贡献

SS：作品设计、数据收集、数据分析和解释、文章起草、文章批判性修订以及待发布版本的最终批准。CC和VN：作品构思、数据分析和解释、文章起草、文章批判性修订以及待出版版本的最终批准。

利益冲突

作者声明，该研究是在没有任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或金融关系的情况下进行的。

致谢

脚注

工具书类