鼻咽癌的种系多态性与生存期：一项多队列全外显子关联研究

基因分型和质量控制

每名患者在诊断时和治疗前均采集EDTA抗凝外周全血样本。使用Qiagen blood midi或maxi试剂盒从血样中提取基因组DNA样本（德国杜塞尔多夫市Qiangen）。对于处于发现阶段的两个队列（SYSUCC-1和SYSUCC-2），新加坡基因组研究所（新加坡）和CapitalBio Technology Co.，Ltd（中国北京）使用Infinium HumanExome BeadChips（美国加利福尼亚州圣地亚哥伊卢米纳）、，共包含246173个SNP，大多数为人群中罕见到低频的外显子SNP。对于复制阶段的SYSUCC‐3队列，候选SNP的基因型是从全基因组数据中检索的，这些数据是通过使用Infinium Global Screening Array BeadChip（Illumina，San Diego，California，USA）获得的，然后使用IMPUTE2程序（2.3.2版）进行插补^{[ 31 ]}使用默认参数。对于复制阶段的NCCS队列，候选SNP的基因型是根据制造商的说明，在CFX384实时系统（Bio-Rad，Hercules，California，USA）上通过TaqMan分析（Applied Biosystems，Waltham，Massachusetts）直接分型的。

在发现阶段，使用PLINK程序（1.07版）在两个队列中应用严格的质量控制过滤器去除质量差或频率低的基因型标记。^{[ 32 ]}基因分型成功率低于95%的SNPs被排除在外，非染色体的SNPs、次要等位基因频率（MAF）低于1%的SNPs和偏离Hardy-Weinberg平衡（HWE）检验的SNPs也被排除在外(对< 1 × 10⁻⁶). 同样，在个人中进行了质量控制筛选。排除了基因分型效率低于95%且与记录性别不一致的样本（意味着样本处理中可能出现意外的技术错误）；此外，显示杂合度极值的样本（近交系数估计F类<–0.01，表示可能的交叉污染）也被排除在外；此外，对于根据PLINK中实现的按血统识别（IBD）计算具有隐秘关系的成对个体（可能是由于意外的技术错误或生物亲属）。最后，去除遗传祖先主成分分析（PCA）所揭示的种族异常值。因此，共有3257个样品和31870个通过质量控制的SNP接受了进一步分析（图S1，支持信息）。

细胞培养

人类胚胎肾细胞293T（HEK293T）和两个鼻咽癌细胞系（S18和5–8F）在添加了10%胎牛血清（FBS；Gibco，Grand Island，NY，USA）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM；Gibco's，Grand Idland，纽约州）中培养并在37°C的标准细胞培养条件下，在5%CO的饱和水环境中保持₂HEK293T购自美国型培养物收藏中心（ATCC）。两个鼻咽癌细胞系，5-8F和S18，在SYSUCC建立并维持。5-8F的特征是来自父母细胞系SUNE-1的一个具有高致瘤性和转移能力的亚克隆，该细胞系来源于SYSUCC治疗的鼻咽癌患者。^{[ 33 ]}S18是一个克隆，具有很强的迁移和侵袭能力，从中国南方一例鼻咽癌患者的CNE‐2单细胞集落中获得。^{[ 34 ]}5–8 F和S18在体外繁殖时都失去了EBV基因组/外显子，成为EBV阴性。^{[ 35 ]}

RNA提取和逆转录（RT）PCR分析

使用Trizol试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）分离总RNA，并根据制造商的说明（美国威斯康星州麦迪逊市普罗米加），使用寡核苷酸（dT）启动和M‐MLV逆转录酶进行逆转录。在StepOne实时PCR系统（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆应用生物系统公司）中，根据感兴趣的基因使用引物对（表S7，支持信息）和SYBR Green作为DNA染料（日本东京高原市）进行实时定量PCR。使用Bulge‐loop hsa‐miR‐1253引物集（RIBOBIO，中国）通过茎环RT‐qPCR方法定量miRNA水平。然后，将PCR产物克隆到pMD19‐T载体（日本塔卡拉）。使用Sanger测序法测定含有miRNA的质粒。

荧光素酶分析

DNA片段包含RPA1型通过使用逆转录（RT）‐PCR和从鼻咽癌细胞中提取的mRNA作为模板（5–8F细胞系；引物信息列于支持信息中的表S7），获得在rs1131636具有C（RPA1‐3UTR*C）或T等位基因（RPA1−3UTR*T）的3′-UTR。研究miR-1253对RPA1型使用TargetScan预测的跨越rs1131636的3〃UTR区域，^{[ 36 ]}突变体构造RPA1型将播种序列替换为5′-CAAAGCGTTTTAgTaCaCtCTTCAATTAATGC-3′（RPA1‐3UTR*MUT），得到3′-UTR。将每个DNA产物分别亚克隆到荧光素酶编码区（psiCHECK2；Promega，Madison，WI，USA）下游的荧光素酶报告质粒中，并通过Sanger测序确认序列有效性。下一个，5×10⁴将细胞接种到24孔板的每个孔中，并使用脂质体2000（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）同时转染各自的构建物和miR‐1253模拟物或干扰对照miRNAs（GenePharma，中国上海）。培养36 h后，根据制造商的方案，使用双荧光素酶检测试剂盒（美国威斯康星州麦迪逊市普罗米加）测量细胞的荧光素素酶活性。

RPA1在细胞中的稳定敲除和过度表达

采用慢病毒表达系统控制细胞中RPA1的表达。对于shRNAs的敲除，按照Addgene的方案将双链寡核苷酸（GenePharma，中国上海；支持信息中的表S7提供了序列）插入慢病毒载体pLKO.1(网址：https://www.addgene.org/). 对于过度表达RPA1型使用RT‐PCR和从鼻咽癌细胞中提取的mRNA作为模板（5–8F；引物信息列于支持信息中的表S7）获得cDNA，然后克隆到pCDH载体（pCDH‐Flag‐RPA1）中；作为阴性对照，编码绿色荧光蛋白（GFP）的基因也被分别构建到pCDH载体（pCDH‐GFP）中。为了生产慢病毒，按照制造商的指示，使用Lipofextamine 2000（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）将慢病毒构建物与包装载体∆8.9和VSVG共同转染到HEK293T细胞中。在转染后48 h收集病毒上清液，并通过0.45µm PVDF过滤器过滤。对于转染，慢病毒与聚brene（8µg mL⁻¹; Sigma，San Antonio，TX，USA）添加到细胞中；随后将细胞保存48小时，然后用2µg mL筛选感染细胞⁻¹嘌呤霉素（中国北京索拉比奥）一周。

免疫印迹分析

如前所述，从整个细胞裂解液中提取蛋白质。^{[ 37 ]}简而言之，在低温低盐裂解缓冲液中用蛋白酶抑制剂鸡尾酒（瑞士巴塞尔罗氏）制备全细胞裂解物，然后在4°C下以12000 rpm离心5分钟。然后将上清液中的蛋白质进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，并转移到PVDF膜上（Millipore，Billerica，MA，USA）。随后用5%脱脂乳封闭膜，并分别与初级抗RPA1抗体（sc‐28304；美国加利福尼亚州圣克鲁斯）、抗flag抗体（F1804；美国密苏里州圣路易斯市Sigma‐Aldrich）和抗凝集素抗体（A1978；美国密苏里州圣路易斯市Sigma‐Aldrich）孵育。

免疫组织化学

将石蜡包埋切片脱蜡并重新水化，然后用5%的正常山羊血清回收抗原并阻断，然后在4°C下用抗RPA1（Santa‐Cruz，sc‐28304）的一级抗体孵育过夜。采用Dako REAL EnVision检测系统对辣根过氧化物酶（HRP）偶联物进行免疫染色。染色情况由两位病理学家独立评估。根据染色频率和强度分析蛋白质表达水平。根据四个分位数处阳性细胞的百分比对蛋白质的染色频率进行半定量评分，并将其乘以no、弱染色、中等染色和强染色的强度得分，分别为0、1、2和3，以获得免疫组织化学得分。

全外显子测序和基因型调用

使用SureSelectXT Human All Exon+UTRs试剂盒（美国加利福尼亚州圣克拉拉市安捷伦科技公司）对基因组DNA样本进行文库构建，然后在HiSeq仪器上使用配对末端2×125 bp协议进行测序（美国加利福尼亚洲圣地亚哥市Illumina）。使用BWA软件将测序数据与人类参考基因组（GRCh37/hg19）对齐。^{[ 38 ]}随后，根据GATK最佳实践建议，GATK套件被用于基础质量分数重新校准、插入/删除重新校准和变量调用。^{[ 39 ]}从全外显子组数据中检索了132名来自SYSUCC的患者和10名来自NCCS的患者的rs1131636基因型。

RNA测序

RNA样品制备和RNA测序是按照商业试剂盒中提供的标准协议进行的，另有说明。从鼻咽癌组织中提取总RNA(n个=87）使用RNeasy Mini Kit（德国杜塞尔多夫市齐根）。使用Ribo‐Zero磁性试剂盒（美国加利福尼亚州圣地亚哥Illumina）去除核糖体RNA。在10例NCCS患者中检索到石蜡包埋（FFPE）原发复发鼻咽肿瘤对，并进行宏观解剖以提取RNA。按照方案，使用AllPrep DNA/RNA FFPE试剂盒（德国杜塞尔多夫市齐根）提取总RNA。使用TruSeq RNA制备试剂盒（Illumina，San Diego，California，USA）进行文库制备。使用HiSeq 1500或HiSeq X Ten仪器汇集具有不同适配器的库并进行测序，每个样本产生约2500万对端125或150 bp的读取。

使用bcl2fastq软件（2.18版；美国加利福尼亚州圣地亚哥Illumina）从BCL格式转换数据后，从仪器中获得fastq格式的测序数据。然后使用cutadapt（版本1.11）对原始fastq数据中的适配器进行修剪。^{[ 40 ]}删除了低质量的读取对，以及高质量的读取，但可以使用Bowtie 2（2.3.4版）与核糖体RNA对齐。^{[ 41 ]}将这些过滤器后的读数重新排列为参考人类基因组（hg19）。^{[ 42 ]}最后，使用HTseq（0.9.1版）对每个基因的读取计数进行量化，^{[ 43 ]}每个基因的表达水平被归一化为每百万次读取的转录物（TPM），或归一化到每千基百万次读取2个转化转录物（2个TPM）的对数，然后进行分位数归一化以进行下游分析。

细胞增殖、迁移和侵袭检测

用于细胞增殖试验，1×10^三细胞接种到96孔板的每个孔中。在光学显微镜下使用台盼蓝排除法在指定时间测定细胞数量和活力。用于集落形成分析，1×10^三细胞接种在6孔板的每个孔中并培养两周。细胞用甲醇固定，在室温下用0.5%结晶紫染色15分钟，然后在光学显微镜下计数每个孔的菌落。根据制造商的说明，使用两孔硅胶插入物（ibidi，德国）进行伤口愈合分析。使用倒置显微镜（IX73；Olympus，Tokyo，Japan）拍摄图像，并使用ImageJ软件（版本1.32，https://imagej.nih.gov/ij/). 使用预涂或不涂基质凝胶的Transwell腔室（8µm孔隙；美国纽约州科宁市）进行细胞迁移和侵袭分析（美国纽约州科宁市）。5 × 10⁴将无血清培养基中的细胞接种到每个插入物的顶部腔室中，而将含有10%FBS的600µL DMEM添加到下部腔室中。培养20小时后，用0.5%结晶紫对细胞进行染色，随后在光学显微镜下对染色细胞进行计数。每项试验一式三份。

体内异种移植肿瘤模型

从北京维他河实验动物技术有限公司（中国北京）购买4周龄雄性BALB/c裸鼠。小鼠被随机分为实验组。含1×10的细胞悬液⁶将每100µL S18细胞中的个细胞皮下注射到裸鼠（每组10只）的背侧翼。每三天测量一次肿瘤大小。最后，处死小鼠，收集肿瘤进行进一步分析。肿瘤体积的计算公式为V（V）=长度×宽度²× 0.52.^{[ 44 ]}所有动物实验均按照中山大学动物护理和使用委员会批准的方案进行。

克隆形成细胞存活检测

克隆测定是根据前面描述的修改方案进行的。^{[ 45 ]}简言之，1×10^三将个S18细胞接种在6孔板的每个孔中并培养过夜，然后使用放射源R2000 X射线辐射器在0、1、2、3、4和5 Gy下照射（1.1 Gy min⁻¹160 kV，25 mA，0.3 mm铜滤波器；Rad Source Tech，美国）。培养8-10天后，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗细胞两次，然后用甲醇固定并用0.5%结晶紫染色。计数染色菌落。平板效率（PE）计算为菌落数与接种细胞数之比乘以100。然后通过将处理过的细胞的PE除以对照的PE（照射剂量为0Gy）并乘以100来确定存活组分（SF）。