肝细胞TMEM16A缺失通过改善肝葡萄糖代谢紊乱延缓NAFLD进展

动物模型

TMEM16A的条件性缺失是使用Cre/液氧Cyagen（中国苏州）的P重组。基因分型策略如图S2A（支持信息）所示。以C57BL/6J文库中的细菌人工染色体（BAC）克隆为模板，通过聚合酶链反应（PCR）生成含有同源臂和条件敲除（CKO）区域的小鼠基因组片段。靶向载体是通过在TMEM16A外显子12的侧翼插入两个液氧P位点，并引入一个新选择盒，其两侧有Frt位点，可去除第二跨膜结构域的53个氨基酸以及第一和第二跨膜域之间的细胞外环。将该结构线性化并导入129个经新霉素筛选鉴定的Sv/J胚胎干细胞（ESCs）。ESC克隆经Southern印迹证实，然后显微注射到C57BL/6 J小鼠的囊胚中。然后将注射的囊胚转移到假孕雌性小鼠体内，并通过出现刺猬毛来鉴定嵌合体雄性。去除抗性盒后，后代成功回交到TMEM16A^弗洛克斯（TM^弗洛克斯)纯合子。白蛋白‐Cre转基因小鼠购自Jackson Laboratory（Bar Harbor，ME），然后回交至C57BL/6基因背景至少九代。肝脏特异性TMEM16A敲除小鼠（TM^LKO公司)通过穿越TM生成^弗洛克斯白蛋白-Cre小鼠。用两对flox引物和一对Cre引物对小鼠进行PCR基因分型，floxed region 1 forward，5′-GGTATCACCAAGGTAACCATCCA‐3′and reverse，5′-CAACCCTCTATCCCTGTCACATG‐3’；浮动区域2正向，5′-TGATTCTGATAGAAAATGAGGCAGAT‐3′和反向，5′-AGGTTATCAGTCAGTTCACAAGCTTTT‐3’；Albumin‐Cre前向，5〃‐GAAGCAGCTTAGAGAAGATGG‐3〃，后向，5′‐TTGGCCCTTACCATAACTG‐4〃。

如前所述，通过Cyagen产生TMEM16A转基因小鼠。^{[ 19 ]}简单地说，含有TMEM16A cDNA的转基因构建物被插入到pRP中。ExBi‐CMV‐洛克斯P‐停止‐洛克斯P盒和微量注射到受精的小鼠胚胎中。在该应变中（称为TM^{反对的论点})，由于“终止密码子”系统，TMEM16A没有过度表达。肝脏特异性TMEM16A转基因小鼠（TM^长期借款)通过将白蛋白-Cre小鼠杂交产生。使用以下引物通过PCR对小鼠进行基因分型，lox公司P站点正向，5′‐TCATGTCTGGATCCCACATCAAGC-3′和反向，5′−GAGTACTTCTCGGACCTCA‐3′；和Cre引物（有关引物序列，请参见上述白蛋白-Cre）。

给雄性小鼠（8周龄）喂食杂粮或HFD（60%kcal脂肪；D12492；Research Diets，Inc.，New Brunswick，NJ）32周。所有动物实验均按照中山大学动物研究委员会的政策进行，并符合中国国家卫生研究院《实验动物护理和使用指南》。

人体肝脏样本

正常和NAFLD肝组织取自在中山大学第一附属医院（中国广州）接受活检或移植的健康人或NAFLD患者。在排除大量饮酒、自身免疫性肝病、病毒性肝炎、血色素沉着症和慢性炎症性肠病后，招募患者参与本研究。两名经验丰富的组织病理学家根据NAFLD评分系统对NAFLD样本进行了评估和评分，他们对临床数据一无所知：^{[ 34 ]}脂肪变性（0-3）、小叶炎症（0-3。表S1（支持信息）总结了这些样本的临床和组织学特征。所有程序均经中山大学医学研究伦理委员会批准。所有受试者都获得了书面知情同意，实验是根据《赫尔辛基宣言》中概述的原则进行的。

原代肝细胞的分离和细胞培养

通过肝脏灌注从小鼠中分离出原代肝细胞。用2%戊巴比妥钠麻醉小鼠，打开腹腔。用含5 mmol L的Hanks平衡盐溶液（HBSS）灌注肝脏⁻¹氯化钙₂，0.1毫克毫升⁻¹DNaseI和100 mmol L⁻¹通过门静脉进行HEPES 5分钟，然后用含有0.5 mg mL胶原酶缓冲液进行第二次灌注⁻¹胶原酶，66.7 mmol L⁻¹氯化钠，6.7毫摩尔L⁻¹氯化钾，50毫摩尔升⁻¹HEPES和4.8 mmol L⁻¹氯化钙₂以5 mL min的速率再进行5 min⁻¹.解剖肝脏并用镊子轻轻地将其切碎。细胞悬浮液通过70µm尼龙细胞过滤器过滤（BD Falcon，BD Biosciences，San Jose，CA）。50×离心后克在2分钟内，将颗粒重新悬浮在HBSS中，并在200×克使用90%Percoll。将获得的肝细胞重新悬浮在补充有10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM）中，100 U mL⁻¹青霉素和100 U mL⁻¹链霉素。通过台盼蓝排除试验测定细胞活力后，在所有实验之前，将细胞在37°C下培养24小时。去除非粘附细胞，然后添加新鲜培养基。

我 _氯钙记录

我 _氯钙如前所述，使用全细胞贴片和Axopatch 200B膜片钳放大器（Axon Instruments，Foster City，CA）进行记录。^{[ 17},^{19 ]}贴片移液管由硼硅酸盐玻璃制成，带有Sutter P‐97水平拉拔器（Sutter Instrument Co.，Novato，CA）。用吸管溶液填充后，吸管的电阻为3–6 MΩ。使用pCLAMP8.0软件（Axon Instruments）在2 kHz下过滤电流并在5 kHz下采样。在实验中，以+20 mV的增量从−100到+100 mV施加测试电位500 ms，间隔5 s。细胞外溶液含有125 mmol L⁻¹ N个‐甲基‐D类葡聚糖（NMDG）‐Cl，5 mmol L⁻¹氯化钾，1.5毫摩尔L⁻¹氯化钙₂，1毫摩尔升⁻¹硫酸镁₄，10毫摩尔升⁻¹HEPES和10 mmol L⁻¹用NMDG将pH值下的葡萄糖调节至7.4。吸管溶液含有130 mmol L⁻¹CsCl，1毫摩尔⁻¹镁·ATP，1.2 mmol L⁻¹氯化镁₂，10毫摩尔升⁻¹高效微粒子，2 mmol L⁻¹EGTA和1.639 mmol L⁻¹氯化钙₂pH值用CsOH调节至7.4。[加利福尼亚州]²⁺]_我为500 nmol L⁻¹.

分子分析

为了测定mRNA水平，根据制造商的说明，使用TRIzol试剂从肝组织或肝细胞中分离出总RNA。使用QuantiTect逆转录试剂盒（Qiagen，Hilden，Germany）将RNA（2µg）逆转录为cDNA。使用SYBR Green PCR Master Mix（Invitrogen，Carlsbad，CA）在MyiQ单色实时PCR检测系统（Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA）上进行实时PCR。基因的序列特异性引物列于表S2（支持信息）中，由Invitrogen合成。使用2^-ΔΔCT方法：以甘油醛-3-磷酸脱氢酶为内对照。

如前所述进行蛋白质印迹。^{[ 11},^{12 ]}简而言之，蛋白质提取物是从冷冻组织或原代肝细胞在放射免疫沉淀分析裂解缓冲液中制备的，该缓冲液中添加了蛋白酶抑制剂混合物（默克，达姆施塔特，德国）。根据制造商的说明，使用Qproteome Cell Compartment Kit（Qiagen）提取细胞质和膜组分。使用BCA分析试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）定量蛋白质含量。蛋白质样品通过6–12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并转移至聚偏氟乙烯膜（Millipore）。在室温下将膜在脱脂干乳中封闭1小时，然后在4°C下与一级抗体孵育过夜。在室温下与相应的二级HRP结合抗体孵育1小时后，用ECL试剂盒（Thermo Fisher Scientific）检测HRP，并用ImageJ软件（NIH，Bethesda，MD）定量。

组织学分析

将肝组织或脂肪组织固定在4%多聚甲醛中，脱水，并嵌入Tissue-Tek OCT化合物（日本东京樱花）或石蜡中。根据标准程序，通过苏木精和伊红（H&E）、PAS和Masson三色染色对石蜡包埋的肝组织切片进行组织学检查，然后用苏木精进行复染。为了对TMEM16A和CD68进行免疫组织化学染色，在4°C下用抗TMEM16A和CD68的一级抗体孵育肝脏切片过夜，然后在室温下用生物素化的二级抗兔抗体染色1h，然后用3,3-二氨基联苯胺四氯化物进行可视化，并用苏木精进行复染。使用油红O对肝脏冷冻切片进行染色，以观察肝脏中的脂质积聚。石蜡包埋脂肪切片用H&E染色。所有图像均用光学显微镜采集（IX71；日本东京奥林巴斯）。使用ImageJ软件计算脂肪细胞的平均直径。

血液化学

使用血糖仪（OneTouch Ultra测试条；宾夕法尼亚州马尔文市Lifescan）和胰岛素ELISA试剂盒（Millipore）对禁食12小时的小鼠的空腹血糖和胰岛素进行测量。HOMA‐IR指数使用以下方程计算，[空腹血糖（mmol L⁻¹)×空腹胰岛素（mIU L⁻¹)]/22.5. 分别在禁食12小时和6小时的小鼠中监测GTT和ITT。对于GTT，小鼠腹腔注射1.5 g kg⁻¹葡萄糖，而0.5 IU kg⁻¹小鼠腹腔注射胰岛素进行ITT。在注射后30、60、90和120分钟检测血糖。使用全自动临床化学分析仪（BS‐800M；中国深圳迈瑞）分光光度法测量血浆ALT和AST。

肝组织生化测定

以10倍体积（v/w）的异丙醇制备肝匀浆，然后在12⁄000×离心后收集上清液克如前所述，检查肝胆固醇含量。^{[ 12},^{35 ]}简而言之，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）清洗肝组织，然后在异丙醇中提取，然后进行超声波处理。向分析溶液（0.9 mL）中添加声波（0.1 mL）；0.1 U毫升⁻¹胆固醇氧化酶，0.01 U mL⁻¹胆固醇酯水解酶，1 U mL⁻¹过氧化物酶，0.05%Triton X‐100，1 mmol L⁻¹胆酸钠和0.6 mg mL⁻¹β-羟基苯乙酸；pH 7.4），并在37°C下培养1小时。通过荧光光谱仪（RF‐5000；日本东京岛津公司）检测混合物的荧光。使用甘油三酯试剂盒（Wako Diagnostics，弗吉尼亚州里士满）测定甘油三酸酯。根据制造商的说明，使用糖原检测试剂盒（加利福尼亚州欧文市BioVision）测量总糖原水平。肝胆固醇、甘油三酯和糖原被归一化为蛋白质量。

细胞内脂质沉积的测量

用siRNA或腺病毒处理的原代肝细胞与BSA或棕榈酸酯孵育24 h。然后用4%甲醛固定细胞并用油红O染色以测量细胞内脂肪含量。收集细胞匀浆，采用与肝组织相同的方法测定细胞内胆固醇含量。荧光强度归一化为细胞蛋白浓度。使用Cayman（密歇根州安娜堡）的商业试剂盒检测细胞内甘油三酯水平。

siRNA、质粒转染与腺病毒感染

为了抑制TMEM16A的表达，根据制造商的说明，使用HiPerfect转染试剂（Qiagen）用针对小鼠TMEM16A基因（5′-CUGCUCAAGUUGUGAACUTT‐3′）的siRNA或阴性对照siRNA转染细胞。TMEM16A cDNA（来自加利福尼亚大学L.Y.Jan博士的礼物）被RFP‐HA标记，并使用重叠延伸PCR克隆方法亚克隆到pMSCV中。然后，按照制造商的说明，用Lipofectamine 2000试剂（Invitrogen）将质粒转染到肝细胞中。对于VAMP3功能获得或丧失的研究，用表达Flag标记的全长小鼠VAMP3基因（AdVAMP3）或靶向VAMP3的shRNA（AdshVAMP3；Cyagen）的重组腺病毒感染细胞24小时。用于击倒VAMP3基因的shRNA的感觉链为5′-ATGAACTGAAGCCGATATTCTCGAGAATATCGTCAT-3′。以Lacz腺病毒（AdLacz）作为阴性对照。

PET/CT成像

在PET/CT成像之前，小鼠禁食12小时，并用1.5%异氟醚麻醉。麻醉小鼠通过尾静脉静脉注射18-FDG（150µCi）。18-FDG注射后立即进行PET采集。使用Inveon多模态PET/CT系统采集图像10分钟，并使用3D最大期望最大化方法进行重建（Inveon Image Research Workplace；Siemens Healthcare，Erlangen，Germany）。使用制造商提供的Inborn Research Workplace Software，通过将18-FDG活性除以注射剂量和动物体重来测量感兴趣区域的标准化摄取值（SUV）。

葡萄糖摄入测量

使用荧光葡萄糖类似物2‐NBDG（Tocris Bioscience，Bristol，UK）评估原代肝细胞的葡萄糖摄取。棕榈酸酯处理24小时后，用无葡萄糖DMEM培养细胞6小时，然后用2‐NBDG（50µmol L⁻¹)在Krebs‐Ringer‐碳酸氢盐缓冲液中（129 mmol L⁻¹氯化钠，4.7 mmol L⁻¹氯化钾，1.2毫摩尔升⁻¹千赫₂人事军官₄，1.0毫摩尔升⁻¹氯化钙₂，1.2毫摩尔升⁻¹硫酸镁₄，5.0毫摩尔升⁻¹氯化钠_三和10毫摩尔升⁻¹庚烯；pH 7.4），持续时间从5分钟增加到90分钟。在每个培养期，用PBS冲洗细胞两次，以停止摄取反应，并立即使用荧光显微镜（IX71）成像。为了量化2‐NBDG的荧光强度，将肝细胞接种在黑色96孔板中，并进行上述处理。使用荧光微孔板阅读器（Infinite F500；Mannedorf，瑞士）测量荧光，并将其归一化为每个孔中的蛋白质浓度。

免疫沉淀分析

如前所述进行免疫沉淀。^{[ 11 ]}将细胞裂解物调整为等量的蛋白质（500µg），并在4℃下用TMEM16A、HA、Flag或VAMP3抗体免疫沉淀过夜。兔IgG对照抗体（#3423；1:50；细胞信号技术）用作阴性对照。蛋白质PLUS A/G琼脂糖（sc‐2003；Santa Cruz Biotechnology）去除免疫沉淀物，然后进行western blot分析。

共焦免疫荧光显微镜

对于肝脏切片中TMEM16A和HNF4的免疫荧光染色，用5%的BSA封闭切片，然后在4°C下与一级抗体孵育过夜。用PBS清洗三次后，将切片与Cy3标记的抗兔IgG（#A10520；1:100；Invitrogen）和FITC标记的抗鼠Ig G（#62‐6511；1:100，Invitrogen）孵育1小时。使用共焦显微镜（Zeiss LSM800；Zeiss，Oberkochen，Germany）拍摄图像。