鲜血。2011年9月29日；118(13): 3680–3683.
血小板含有肿瘤衍生RNA生物标记物
,1三 ,1,2,4 ,1,2,5 ,1,2 ,6 ,7 ,三 ,7 ,7 ,2 ,1,2 ,4和
1,2,4 R·乔纳斯·A·尼尔森
1荷兰阿姆斯特丹癌症中心VU大学医学中心神经肿瘤学研究小组；
2荷兰阿姆斯特丹癌症中心VU大学医学中心神经外科；
三瑞典乌梅大学肿瘤放射科学系；
利奥诺拉·巴拉杰
1荷兰阿姆斯特丹癌症中心VU大学医学中心神经肿瘤学研究小组；
2荷兰阿姆斯特丹癌症中心VU大学医学中心神经外科；
4马萨诸塞州总医院和哈佛医学院神经内科分子神经遗传学室，马萨诸塞州立大学波士顿；和
埃丝特·赫尔曼
1荷兰阿姆斯特丹癌症中心VU大学医学中心神经肿瘤学研究小组；
2荷兰阿姆斯特丹癌症中心VU大学医学中心神经外科；
以下部门5儿科肿瘤学，
Sjoerd van Rijn先生
1荷兰阿姆斯特丹癌症中心VU大学医学中心神经肿瘤学研究小组；
2荷兰阿姆斯特丹癌症中心VU大学医学中心神经外科；
毛迪·瓦尔文
7荷兰阿姆斯特丹VU大学医学中心肿瘤医学中心
Winald R.Gerritsen公司
7荷兰阿姆斯特丹阿姆斯特丹癌症中心VU大学医学中心肿瘤医学
亨克·M·维尔豪尔
7荷兰阿姆斯特丹阿姆斯特丹癌症中心VU大学医学中心肿瘤医学
W.Peter Vandertop（彼得·范德托普）
2荷兰阿姆斯特丹癌症中心VU大学医学中心神经外科；
大卫·P·诺斯克
1荷兰阿姆斯特丹VU大学医学中心癌症中心神经肿瘤学研究小组；
2荷兰阿姆斯特丹癌症中心VU大学医学中心神经外科；
约翰·斯科格
4马萨诸塞州总医院和哈佛医学院神经内科分子神经遗传学室，马萨诸塞州立大学波士顿；和
托马斯·维尔丁格
1荷兰阿姆斯特丹癌症中心VU大学医学中心神经肿瘤学研究小组；
2荷兰阿姆斯特丹癌症中心VU大学医学中心神经外科；
4马萨诸塞州总医院和哈佛医学院神经内科分子神经遗传学室，马萨诸塞州立大学波士顿；和
1荷兰阿姆斯特丹癌症中心VU大学医学中心神经肿瘤学研究小组；
2荷兰阿姆斯特丹癌症中心VU大学医学中心神经外科；
三瑞典乌梅奥乌梅奥大学肿瘤放射科学系；
4马萨诸塞州总医院和哈佛医学院神经内科分子神经遗传学室，马萨诸塞州立大学波士顿；和
以下部门5儿科肿瘤学，
6病理学，以及
7荷兰阿姆斯特丹阿姆斯特丹癌症中心VU大学医学中心肿瘤医学
通讯作者。 收到日期：2011年3月23日；2011年7月21日接受。
- 补充资料
编号：22BDFA16-0492-41B8-9624-E176E80A2995
摘要
诊断平台提供对癌症患者的诊断、监测和分层具有高度预测性的生物标记物，是开发个性化医学的关键工具。我们证明肿瘤细胞在体外和体内将（突变）RNA转移到血小板中，并表明从胶质瘤和前列腺癌患者分离的血小板分别含有癌相关RNA生物标记物EGFRvIII和PCA3。此外，基因表达谱分析显示，与正常对照组相比，胶质瘤患者的血小板中存在明显的RNA特征。由于血小板很容易获得和分离，因此它们可能成为癌症辅助诊断的一个有吸引力的平台。
介绍
靶向肿瘤治疗和个性化药物在很大程度上取决于疾病特征分析和伴随诊断的发展。1–5肿瘤衍生核酸的突变可以高度预测癌症靶向治疗的反应（例如，结直肠癌中的KRAS突变、黑色素瘤中的BRAF突变和肺癌中的EGFR突变）。5然而，获得容易获得的高质量核酸仍然是一个重大的发展障碍。1–三血液中每微升通常含有15万至35万血小板（血小板），6它们发挥着不同的功能7并为研究和临床应用提供高可用的生物标记物来源。8此外，血小板分离相对简单，是血库/血液学实验室的标准程序。由于血小板不含细胞核，因此其功能维持所需的RNA转录物在血小板形成过程中来自巨核细胞。6,8,9血小板RNA可以很容易地分离出来并进行基因表达分析。8–10在这里，我们表明血小板会吸收肿瘤衍生的分泌膜泡，这些膜泡可以包含肿瘤相关RNA，血小板可以作为癌症诊断的潜在生物标记物来源。
方法
血小板分离和组织切除
根据《赫尔辛基宣言》，在知情同意和遵循道德准则的情况下，在荷兰阿姆斯特丹VU大学医学中心和瑞典乌梅奥Norrlands Universites Sjukhus进行了胶质瘤和前列腺癌患者的肿瘤组织切除和全血采集。通过标准离心法从含有EDTA抗凝剂的紫卡普BD真空吸附器中收集的全血中分离血小板。在室温下120℃离心20分钟，取出细胞克，重复5分钟。在室温下360℃离心20分钟，从上清液中分离血小板克然后将血小板颗粒在PBS中洗涤两次，0.8%EDTA，并收集在100μL PBS中。通过显微镜分析评估血小板质量（活化和聚集）以及纯度。接下来，将分离的血小板颗粒进行snap冷冻以供进一步使用。
微泡分离、标记和转移
从U87/U87-EGFRvIII胶质瘤和22Rv1前列腺癌细胞中分离出微囊泡，并按照前面所述进行标记。11在U87-EGFRVIII微泡培养后，用RNA酶清洗血小板并进行处理，以确保EGFRVIII RNA进入血小板，从而防止其受到RNA酶介导的降解。使用LSM-710共焦显微镜系统、ZEN 2010软件（卡尔蔡司）和63倍油浸物镜（卡尔蔡司）分析微泡摄取。用德克萨斯红结合小麦胚芽凝集素（Invitrogen）对血小板进行染色，以显示血小板结构，并分析绿色PKH67（Sigma-Aldrich）对微泡的摄取。按照其他地方的描述进行电子显微镜检查。12
逆转录聚合酶链反应
如前所述，对EGFRvIII、PCA3和GAPDH进行RT-PCR，11,12使用以下底漆组：
嵌套EGFRvIII引物：PCR1，正向，5′-CAGTATTGAT-CGGGAGC-3′；反面为5′-TGTGGATCACAGAGGAGT-3′；PCR2，正向，5′-GAGCTCTCGGGGAGCAG-3′；背面为5′-GCCTTCGCACTCTTACAC-3′。
嵌套PCA3引物（外显子2-3）：PCR1，正向，5′-AGTTCCGGTGAGTCT-3′；背面为5′-CACATTTCAGCAGATGTGTGG-3′；PCR2，正向，5′-ATCGACGCACTCTCTCTGAGT-3′；和反向，5′-TGTGTGTGC-CTCGATGGTAA-3′。
GAPDH引物：正向，5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′；背面为5′-TCAGAGATGTGGATGGTTC-3′。
结果
癌细胞分泌膜泡，将突变RNA转移到血小板中
在，我们表明，从健康人对照受试者分离的血小板有能力吸收来自人类癌细胞的分泌型RNA膜泡。我们分离了健康供体受试者的血小板，以及胶质瘤和前列腺癌细胞分泌的膜泡11,12（补充图1，可从血液网站；请参阅在线文章顶部的补充材料链接）。接下来，我们用绿色荧光染料PKH67标记分离的微泡，然后将其与血小板孵育。我们通过FACS分析测定了血小板中标记的肿瘤衍生微泡的摄取和积累(A） ●●●●。为了证实微泡被血小板内吞，我们使用共焦显微镜，显示从胶质瘤和前列腺癌细胞获得的PKH67标记的微泡被显著摄取(B） ●●●●。这里分析的胶质瘤细胞分泌的膜泡含有肿瘤相关RNA，包括突变的EGFRvIII。11为了确定肿瘤衍生RNA可以从癌细胞转移到血小板，我们通过RT-PCR证明了微泡介导的突变EGFRvIII RNA转移到健康对照者的血小板(C） ●●●●。我们通过RT-PCR在来自健康供体受试者的血小板中检测到EGFRvIII RNA，这些受试者是用从EGFRvIII阳性胶质瘤细胞中分离的膜泡培养的，而不是在用EGFRvII阴性胶质瘤细胞的微泡培养的血小板中。接下来，我们在小鼠大脑中植入了表达萤火虫萤光素酶的U87 EGFRvIII神经胶质瘤细胞13; 2周后，使用萤火虫荧光素酶介导的生物发光成像对小鼠进行成像，显示肿瘤明显生长(D） 之后从心脏中抽出500μL血液。分离血小板，并用RT-PCR证明体内血小板中存在EGFRvIII mRNA(D） ●●●●。
血小板中肿瘤衍生RNA的摄取。（A） 用PKH67绿色荧光染料标记U87胶质瘤衍生微泡，并与分离的血小板孵育。在有无微泡的情况下培养15、30、45和60分钟后，清洗血小板并进行PKH67荧光的FACS分析。（B） 血小板与来自胶质瘤或前列腺癌（PCa）患者的PKH67标记的微泡（MV）孵育，用德克萨斯红小麦胚芽凝集素染色，并通过共焦显微镜分析PKH67标签的微泡摄取。将显示合并的图像和尺寸栏。（C） 用U87胶质瘤衍生微泡在不同条件下孵育后，从RNA酶处理的血小板中分离出RNA。RT-PCR检测EGFRvIII RNA。MV/MV-EGFRvII显示从U87/U87-EGFRvⅢ细胞分离出的微泡。（D） 小鼠植入U87-Fluc-EGFRvIII细胞或无细胞，2周后成像。所示为小鼠血小板上的代表性生物发光图像和相应的EGFRvIII RT-PCR。（E） 从12名健康对照受试者和26名胶质瘤患者（此处仅显示18名患者）的血小板中分离出RNA，并进行RT-PCR分析。相应的胶质瘤组织活检作为对照。血小板活化和不均匀EGFRvIII组织分布可能导致假阴性信号。PC表示U87-EGFRvIII RNA；NC、H2O；和nd，未确定*正信号。（F） 从健康对照组（n=10）和前列腺癌患者（n=12）的血小板中分离出RNA，并进行PCA3和GAPDH RT-PCR分析。
癌症患者的血小板含有肿瘤衍生的突变RNA
为了确定从神经胶质瘤患者中分离的循环血小板是否含有RNA生物标志物EGFRvIII，我们将健康供体受试者的血小板与神经胶质瘤患者的血小板进行了比较(E；总结见补充表1）。除了从血小板中提取的RNA外，我们还从相应的胶质瘤组织中提取了RNA。作为概念验证，我们使用RT-PCR确定是否在切除的胶质瘤组织和同一患者（n=26）的血小板以及健康对照者（n=12）的血小板中检测到突变的EGFRvIII RNA。对样品进行编码，并以盲法进行RT-PCR。共有21%的胶质瘤组织样本含有EGFRvIII转录本（补充表1），与之前观察到的类似。11值得注意的是，80%的EGFRvIII阳性患者的血小板和健康献血者（n=12）的所有血小板均扩增出EGFRvII，而所有血小板样本中均检测到GAPDH RNA。为了证明肿瘤相关信息的存在并非仅限于胶质瘤患者的血小板，我们报告了前列腺癌患者（n=12）血小板中存在前列腺癌标记物PCA3的RNA编码，而健康对照组（n=10；F） ●●●●。
基因表达谱鉴定血小板中的胶质瘤特征
最后，使用基因表达阵列，我们测定了从健康对照受试者（n=12）和胶质瘤患者（n=8；补充方法）分离的血小板的RNA谱。进行SAM分析以确定我们获得了不同的RNA表达谱，并允许我们编译胶质瘤相关基因表达特征(A） ●●●●。有趣的是，一些潜在的生物标记物在对照样品中几乎检测不到，而在胶质瘤患者的血小板中，它们高度表达(B） ●●●●。
胶质瘤相关基因表达特征。（A） 对来自神经胶质瘤患者和健康对照受试者的血小板RNA进行基因表达阵列。SAM分析用于确定显著表达的基因。图中显示了前30个上调RNA的热图。（B） 前10个RNA的个体表达水平。虚线表示背景（BG）。
讨论
在这里，我们证明了癌细胞分泌的膜泡是能够将肿瘤衍生（突变）RNA转移到血小板的载体，如共焦显微镜和RT-PCR所示。据证实，肿瘤细胞可以通过多种微泡类型向循环中释放RNA。11,12,14–16然而，正在出现其他机制；例如，循环microRNAs（miRNAs）与argonaute 2蛋白一起被检测到，16以及与高密度脂蛋白的复合物。17因此，血小板中肿瘤衍生RNA分子也可能通过微泡依赖性机制转移。对血小板的兴趣及其与血管内成分相互作用的能力吸引了一些研究小组将血小板作为癌症生物标记物的蛋白质来源，并研究其在疾病中的作用。18–22一些血小板蛋白被鉴定为潜在的癌症生物标志物，包括PF423和血小板反应蛋白-1。24有趣的是，血小板反应蛋白-1被证明是血管生成的负调节因子，并影响血小板介导的骨髓衍生细胞向肿瘤血管生成部位的募集。25此外，血小板衍生的溶血磷脂酸被证明支持乳腺癌转移，并通过干扰骨髓衍生细胞向血管生成部位的募集而被确定为潜在的治疗靶点。26最近研究表明，巨核细胞选择性地将mRNAs转运到血小板中，只允许将一部分RNAs转移到血小板中，27Calverly等人发现了在肺癌转移中差异表达的巨核细胞/血小板衍生mRNA亚群。28然而，肿瘤衍生RNA在血小板生物学和癌症中的任何作用仍有待研究，并且尚不清楚转移的肿瘤衍生RNA能在多大程度上功能性转化为蛋白质，从而操纵血小板功能，如前所述，在内皮细胞摄取肿瘤衍生的微泡后发生。12最近的一项研究表明，癌症患者血小板中的miR-28被解除了调控。29因为血小板具有功能性miRNA机制，10,30确定肿瘤衍生的miRNAs是否能在功能上抑制血小板中的翻译也很有意义，正如在微泡介导的肿瘤衍生miRNAs-递送过程中单核细胞中发生的那样。31除了这里显示的微泡摄取外，据报道血小板本身可以有效释放肿瘤前微泡，18,32,33因此，有可能形成以血液为基础的（肿瘤衍生的）RNA分布网络。因此，肿瘤细胞通过血小板传播RNA为癌症监测提供了一个战略开口。本文的结果表明，血小板含有肿瘤相关RNA，因此可能成为个性化医学背景下癌症伴随诊断的一个有吸引力的平台。
致谢
作者感谢Xandra O.Breakefield教授的持续支持，感谢Jantine Posthuma de Boer在采血方面的帮助，感谢Nitesh Mistry在电子显微镜方面的帮助。
这项工作得到了瑞典乌梅大学狮子癌症研究基金会的支持；瑞典研究委员会（R.J.A.N.）Stichting Translational Research CCA/VU University Medical Center；和NWO-VIDI（T.W.）。
脚注
这篇文章的出版费用部分由页面费支付。因此，仅为了表明这一事实，根据《美国法典》第18卷第1734节的规定，本文特此标记为“广告”。
作者
贡献：R.J.A.N.、J.S.和T.W生成并分析了数据，并参与了实验策略和手稿的设计、写作和编辑；L.B.和S.v.R.生成PCR数据并编辑手稿；E.H.和D.M.P.生成了微泡摄取数据并编辑了原稿；M.W.、A.W.、W.R.G.、H.M.V.、W.P.V.和D.P.N.提供了患者材料并编辑了手稿。
利益冲突披露：作者声明没有相互竞争的财务利益。
通讯员：Thomas Würdinger，神经肿瘤学研究小组，阿姆斯特丹癌症中心，荷兰阿姆斯特丹VU大学医学中心，De Boelelaan 11171081 HV；电子邮件：ln.cmuv@regnidruw.t公司.
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