交通。作者手稿；PMC 2020年5月11日提供。
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粘蛋白-1是细胞内乳糖神经酰胺运输所需的溶酶体膜蛋白
英国剑桥大学剑桥医学研究所和临床生物化学系，Addenbrooke's Hospital，Hills Road，Cambridge，CB2 2XY
- 补充资料
补充信息。
指南：BCBA8B33-FAAE-498C-B968-67CFB26B46FE
摘要
粘蛋白-1是由该基因编码的膜蛋白MCOLN1型，突变导致溶酶体储存障碍IV型粘液表皮病（MLIV）。粘蛋白-1的有效溶酶体靶向需要N端和C端细胞溶质尾部的二亮氨酸基序。我们已经证明，MLIV细胞中异常的乳糖神经酰胺转运可以通过野生型粘蛋白-1的表达来挽救，但不能通过粘蛋白-1错误靶向质膜，也不能通过溶酶体溶酶体修饰的粘蛋白-1在其预测的离子孔选择性区域发生突变来挽救。我们的数据表明，粘蛋白-1的正确定位及其离子孔的完整性对于其在晚期内吞途径中的生理功能至关重要。
关键词：内吞、溶酶体、细胞器融合、瞬时受体电位
介绍
IV型粘液表皮病（MLIV）是一种由基因突变引起的常染色体隐性遗传神经变性溶酶体储存障碍MCOLN1型编码580个氨基酸，多窗格，膜蛋白粘蛋白-1(1–4). 粘蛋白-1是TRP（瞬时受体电位）阳离子通道大家族的成员。粘蛋白-1在爪蟾卵母细胞、哺乳动物细胞或脂质体都表明粘蛋白-1是一种非特异性阳离子通道，受钙离子变化的调节2+浓度和pH(5–9). 对哺乳动物细胞的实验也表明其H+-渗透性在调节溶酶体pH值方面可能很重要(9).
MLIV中的溶酶体储存缺陷与晚期内吞途径中的膜交通和细胞器动力学异常一致(10–12). MLIV患者的成纤维细胞的特征是溶酶体肿胀，含有多中心板层，脂质和水溶性物质积聚。乳糖神经酰胺在MLIV细胞和其他鞘脂贮存疾病中的运输严重受损(13). 因此，内吞LacCer(N个-（4,4-二氟-5,7-二甲基-4-硼酸-3a，4a-二氮杂-秒-茚-3-戊酰基）鞘氨醇-1-β-D-内酯；BODIPY FL C5-乳糖神经酰胺）及其荧光代谢物积累在MLIV细胞的内吞细胞器/溶酶体中，而不是像正常细胞那样集中在高尔基复合体中(9,10). LacCer的溶酶体积累不是由于其水解为荧光神经酰胺时发生阻碍(10).
MLIV细胞中溶酶体的肿胀可能是融合后溶酶体重建缺陷的结果。向溶酶体的内吞递送包括晚期内吞体和溶酶体之间的接吻以及直接融合以产生内吞体-溶酶体杂交细胞器，溶酶体从中重新形成(14). 融合和溶酶体重组的机制已部分了解(15,16)有人认为，CUP-5蛋白秀丽线虫粘蛋白-1的同源序列是杂交细胞器溶酶体生物发生所必需的(17,18).
虽然早期在瞬时转染细胞中定位标记的黏蛋白-1蛋白的实验表明，主要是质膜定位(三,11)最近有研究表明，绿色荧光蛋白标记的粘蛋白-1定位于溶酶体(19,20). 鉴于粘蛋白-1在晚期内吞途径中的潜在意义，我们决定研究其胞内定位的重要性以及预测的离子孔在其功能中的作用。
结果
粘蛋白-1的定位和靶向
最近的报道表明，粘脂蛋白-1在前两个预测的跨膜结构域之间的管腔环中的氨基酸200之后被蛋白水解切割(21,22). 然而，裂解的蛋白质片段仍然相互关联。为了解决内源性全长粘蛋白-1的定位问题，我们制备了一种用于免疫印迹（但不用于免疫荧光）的细菌表达粘蛋白-1融合蛋白的抗血清。我们对富含溶酶体或晚期内体的大鼠肝脏亚细胞组分进行免疫印迹。内源性全长粘脂蛋白-1，以60kDa条带的形式迁移（与之后观察到的条带相同在体外人类粘蛋白-1 cRNA的翻译（数据未显示）仅存在于溶酶体富集部分(). 此外，我们发现，当在Ficoll梯度上通过超速离心分离NRK细胞匀浆时，全长粘蛋白-1与溶酶体酶ß-己糖胺酶和溶酶体膜蛋白lgp110在同一分数上出现峰值，而不是与阳离子无关的甘露糖6-磷酸受体（MPR），在这些细胞中主要位于晚期内体().
粘蛋白-1是一种溶酶体膜蛋白。(一)富含晚期内体（LE）和溶酶体（L）的大鼠肝脏组分中大鼠粘蛋白-1的免疫印迹。蛋白质（每道10μg）通过使用不连续缓冲液在10%SDS聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，免疫印迹后通过ECL可视化。(B类)对NRK细胞进行分级，并在1-22%Ficoll梯度和45%Nycodenz缓冲垫上分离匀浆。从梯度底部收集3 ml组分。图中显示了梯度部分的折射率（RI）。检测每个组分的β-己糖胺酶活性，并免疫印迹MPR、lgp110和粘蛋白-1。(C类)使用（a）GFP-粘蛋白-1、（b）lgp120和（c）稳定表达GFP-黏蛋白-1的NRK细胞中共定位程度的间接免疫荧光的共焦图像（显示为最大强度Z投影）。棒材，10μm。(D类)免疫电子显微镜显示稳定表达GFP-粘蛋白-1的NRK细胞中的GFP-黏蛋白-1（15 nm金）和lgp110（10 nm金）。条形，100 nm。
当在NRK细胞中表达时，粘蛋白-1在其N端被增强绿色荧光蛋白（GFP）标记，与MPR没有明显的共定位，并且几乎与溶酶体膜蛋白lgp120完全共定位()与其他人报道的溶酶体定位一致(19,20). 免疫电镜证实了NRK细胞中溶酶体的定位，其中GFP-粘蛋白-1在用lgp110抗体标记的电子致密细胞器中被观察到(). 与一篇关于粘脂蛋白-1过度表达导致晚期内吞细胞器分布改变的报道相反(19)中表达GFP-粘蛋白-1后，我们没有发现溶酶体的大体形态学变化。这与Miedel的数据一致等. (22).
预测的粘蛋白-1的氨基末端和羧基末端细胞质尾部包含二亮氨酸基序（亮氨酸15和16以及亮氨酸577和578），前面有酸性斑块，符合适配器结合基序(23). 我们瞬时表达GFP-粘蛋白-1，其中氨基末端二亮氨酸基序被丙氨酸取代（L577/578A）。该突变蛋白部分定位于溶酶体，但由于在细胞表面观察到大量GFP标记蛋白，因此靶向性无效(). 相反，当GFP-粘蛋白-1的氨基末端二亮氨酸基序被丙氨酸（L15/16A）取代并瞬时表达时，它仍然定位于溶酶体()这表明该二亮氨酸基序不是一个强溶酶体靶向基序。然而，当双亮氨酸突变体GFP-粘蛋白-1（L15/16A+L577/578A）被表达时，发现它只存在于质膜上()这意味着在全长蛋白的背景下，两个二亮氨酸基序一起发挥作用，以实现野生型粘蛋白-1的溶酶体定位。我们的数据与Vergarajauregui和Puertollano最近的报告一致(20). 相反，Miedel没有检测到羧基末端二亮氨酸基序在溶酶体靶向中的作用等. (22)他们检查了突变粘蛋白-1的定位，其中四个羧基末端氨基酸被删除（ΔL577LVN）。在单独的实验中，我们通过研究由质膜蛋白CD8α的外（管腔）和跨膜域组成的嵌合体与野生型粘蛋白-1尾巴（氨基酸522-580）的定位，证实羧基末端LL577/588基序本身不足以用于溶酶体靶向或者一条突变的尾巴，其中二亮氨酸基序被丙氨酸取代（L577/578A）(补充信息图S1). LL577/588基序负责嵌合体的细胞内定位，但不能有效地将嵌合体靶向溶酶体。
粘蛋白-1有效靶向溶酶体需要两个双亮氨酸信号。将编码人粘蛋白-1、单双亮氨酸突变体L577/578A和L15/16A以及双双亮氨酸突变L15/16A+L577/578A的cDNA亚克隆到pEGFP-C3中，并在NRK细胞中瞬时表达24h。共焦图像显示了各种GFP-粘蛋白-1结构与lgp120之间的共定位程度，如右栏中的黄色面板所示。棒材，10μm。
正确定位的粘蛋白-1可以挽救MLIV细胞中的乳糖神经酰胺贩运
我们想测试粘蛋白-1的表达是否可以挽救MLIV细胞中的贩运缺陷（之前的特征是通过透射电镜和溶酶体pH值的测量；参见补充信息)这种救援是否取决于粘蛋白-1的正确定位。我们观察到MLIV（WG0909）细胞和杂合子亲本细胞（WG0987和WG0988）之间LacCer贩运存在明显差异，这与以前的报告一致(10,24). LacCer内吞后，亲本WG0987和WG0988细胞主要显示管状核周荧光模式，这是高尔基体区室的典型荧光模式(，未显示WG0988单元格的等效图像）。相反，在WG0909成纤维细胞中，LacCer主要积聚在许多点状细胞中，高尔基体中只有少量荧光脂质积聚(). 当用HcRed标记的野生型粘蛋白-1转染MLIV成纤维细胞时，Lac-Cer转运的缺陷被荧光脂类修复，荧光脂类显示高尔基体分布，很少有突起(). 在MLIV细胞中拯救LacCer贩运依赖于以溶酶体为靶点的粘蛋白-1，因为转染了靶向质膜（L15/16A+L577/578A）的二亮氨酸基序突变的HcRed-mucolipin-1的MLIV细胞没有出现粘蛋白-1(). 这些实验的定量是通过计算LacCer点来实现的(). 尽管通过在MLIV细胞中表达野生型粘蛋白-1挽救了LacCer的贩运，但在这些实验的时间过程中，溶酶体肿胀的形态没有改变（数据未显示）。
MLIV细胞中的异常LacCer贩运通过溶酶体放大的粘蛋白-1的表达得以挽救。(一)用HcRed标记的粘蛋白-1（wt）或双亮氨酸突变体（L15/16A+L577/578A）瞬时转染24小时的未转染MLIV细胞（WG0909）和MLIV细胞中粘蛋白-1基因（亲本细胞，WG0987）突变杂合细胞的LacCer荧光图像。在未转染或转染细胞中摄取3小时后观察到胞内LacCer，后者通过HcRed的存在进行鉴定。(B类)父母细胞杂合子中LacCer puncta（不包括高尔基荧光）的定量，以检测粘蛋白-1基因（WG0987和WG0988）、转染HcRed标记野生型（wt）或双亮氨酸突变体（L15/16A+L577/578A）粘蛋白-1的MLIV患者细胞（WG0909）和MLIV（WG090909）细胞的突变。定量来自于对来自≥3个单独实验的每种细胞类型的≥10个细胞的分析。**，P<0.01（WG0909 vs.WG0909+粘蛋白-1（wt））。(C类)用BODIPY-LacCer对MLIV、WG0909细胞进行1小时的脉冲处理，并追踪2小时。脉冲和追踪均在1 mg/ml德克萨斯红右旋糖酐的存在下进行。放大的区域显示LacCer（绿色）和右旋糖酐（红色）之间的共定位（黄色）。(D类)将WG0909细胞用俄勒冈州绿488-右旋糖酐（绿色）脉冲处理4小时，然后追踪20小时。固定细胞并对其进行lamp-1（红色）染色。协同校准以黄色显示。条形=10μ米。
为了证实LacCer在MLIV细胞中积聚的点状细胞是内吞细胞器，我们在德克萨斯红葡聚糖的持续存在下用LacCer（1h脉冲，2h追踪）对细胞进行脉冲相位分析，发现LacCer-阳性点状细胞与内吞葡聚糖共存(). 内吞葡聚糖可以进入整个内吞途径，因为当MLIV细胞与葡聚糖孵育4小时，然后进行20小时追踪时，可以观察到溶酶体膜蛋白Lamp-1与溶酶体的良好共定位，这标志着晚期内吞隔室和溶酶体(). 在我们的实验条件下，LacCer的大多数不是溶酶体（数据未显示）。
MLIV细胞中胆固醇分布和乳糖神经酰胺转运动力学
除了LacCer的摄取外，我们还通过filipin染色研究了胆固醇在MLIV细胞中的分布，fillipin与未酯化胆固醇形成荧光复合物。我们发现未酯化胆固醇在MLIV细胞（WG0909）中的分布与亲代细胞没有显著差异，主要分布在质膜上(). 我们在MLIV细胞的溶酶体中未观察到明显的非酯化胆固醇积聚()尽管是Soyombo等. (9)据报道，MLIV细胞中filipin的细胞积累增加了三倍。然而，当亲代和MLIV细胞用两亲性叔胺U18666A预处理时，未酯化的胆固醇在所有检测细胞的溶酶体中积累(). U18666A干扰从溶酶体中去除未酯化胆固醇，并导致胆固醇在溶酶体内积聚，从而模拟尼曼-匹克C型脂质沉积病，这是一种以完整膜蛋白NPC-1缺乏为特征的遗传病(25).
胆固醇分布和LacCer流量动力学(一)MLIV、WG0909和亲代、WG0987细胞经U18666A处理24小时后，对其进行非酯化胆固醇（filipin）和lamp-1染色。合并后的图片显示lamp-1（绿色）和filipin（红色）。棒材=10μ米(B类)父母和MLIV成纤维细胞用LacCer脉冲处理1小时，然后追踪2或5小时（分别为顶部和中间面板）。用U18666A处理24小时的细胞也用LacCer脉冲处理1小时，然后追踪2小时（底部面板）。棒材=10μ米。
由于胆固醇在MLIV细胞中的稳态分布没有受到严重干扰，我们推测，在我们的实验条件下，LacCer在粘脂蛋白病IV中的积累是通过晚期内吞途径的较慢流量的结果，而不是完全阻塞流量的结果就其本身而言事实上，当LacCer被追捕5小时而不是之前的实验中的2小时时，MLIV细胞（WG0909）中的荧光脂质呈现出与亲代细胞（WG0.987&WG0988；). U18666A抑制了所有细胞中LacCer对高尔基体的流量（1h脉冲，2h追踪）(). 虽然U18666A的作用方式尚不清楚，但据报道，它可能通过影响脂质顺序而破坏细胞膜(26)，这可以解释后面的结果。
粘蛋白-1离子孔与乳糖神经酰胺贩运的拯救
确定了粘蛋白-1对溶酶体的正确靶向性对于恢复MLIV细胞中LacCer的贩运至关重要，我们希望评估预测的“离子孔区域”突变对恢复LacCer贩运能力的影响。粘蛋白-1包含六个假定的跨膜结构域，预测的离子孔位于其中的第五个和第六个之间(12). 我们将粘蛋白-1的部分孔隙区域与TRP超家族的其他成员和电压门控钙离子对齐2+通道α亚基（CACNLIA1），其中假定孔隙区域的突变已被证明影响离子通道特性(). 基于这种蛋白质比对，我们将两个天冬氨酸残基中的一个或两个突变为赖氨酸（D471K和D471/472K），以干扰孔选择性。除了合成的粘蛋白-1突变体外，我们还研究了人类MLIV突变F465L，因为它位于假定的孔隙区域，并且苯丙氨酸在我们对齐的序列中高度保守(). 当在NRK细胞中瞬时表达为HcRed融合蛋白时，所有这些突变体都与lgp120广泛共定位(，未显示D471K的数据）。尽管这些突变体能够靶向溶酶体，但没有一个突变体能够显著拯救MLIV WG0909细胞中LacCer的贩运(囊性纤维变性).
讨论
我们的数据表明，粘蛋白-1是一种溶酶体膜蛋白，具有两个双亮氨酸靶向基序，这两个基序是有效溶酶体靶向所必需的。我们还提供了第一个证据，证明粘脂质-1对溶酶体的正确靶向及其预测的离子孔的完整性对其生理功能至关重要。我们的定位和目标数据与Vergarajauregui和Puertollano一致(20)，他们进一步表明羧基末端二亮氨酸基序作为AP-2依赖的内化基序发挥作用。他们还认为，L577/578A突变体在细胞表面相对缺乏积累，这意味着直接的细胞内运输途径是新合成的粘蛋白-1从高尔基复合体传递到溶酶体的主要途径。米德尔等. (22)最近还表明，粘蛋白-1主要通过不需要AP-3但依赖AP-1的直接途径传递到溶酶体。
我们已经证明，与亲代细胞相比，MLIV患者细胞中LacCer通过晚期内吞途径的速率较慢。我们通过表达野生型粘蛋白-1来修复这个缺陷。然而，只有当粘蛋白-1蛋白正确靶向溶酶体时，我们才能看到救援。突变两个二亮氨酸基序以产生定位于细胞表面的突变粘蛋白-1，导致无法修复MLIV细胞缺陷的突变。通过MLIV细胞内吞途径的LacCer流量减少与晚期内吞细胞器的膜融合/裂变事件发生扰动一致。这被认为是杯-5的突变体秀丽线虫(17,18)这表明细胞表面受体的降解速度降低(27). 在稳态条件下，我们没有观察到MLIV成纤维细胞溶酶体中未酯化胆固醇的任何显著溶酶体积聚，这意味着尽管存在其他晚期内吞交通异常，但可能在NPC1的帮助下，其清除仍在进行中。将LacCer转运缺陷描述为动力学而非绝对阻滞可能解释了为什么在我们的一些实验条件下（LacCer1h脉冲，2h追踪），MLIV细胞中的LacCer大多数位于溶酶体以外的内吞细胞器中，而其他人则报告了更大的溶酶体定位(9,10,24).
将粘脂蛋白-1正确定位到溶酶体对于正常的LacCer运输是至关重要的，并且仅仅在细胞中存在粘脂蛋白-1蛋白对于正常的细胞功能是不够的。因此，尽管预测有功能性离子孔，但导致粘蛋白-1在内质网中滞留的粘蛋白-1突变体V446L（12,19；我们未发表的数据）会导致MLIV疾病。V446L突变体在内质网中的保留可能是因为它被错误折叠，这也可能解释了由MLIV基因编码的许多其他突变型粘蛋白-1在内质网上的保留，例如MLIV突变体T232P(19). 通过晚期内吞途径的乳糖神经酰胺转运速率取决于完整的粘蛋白-1离子孔，因为改变假定孔内电荷的突变或附近的疾病突变（F465L）导致蛋白质无法修复转运缺陷，尽管它们正确定位于溶酶体。应该注意的是，预测的离子孔突变体（正确地针对溶酶体）缺乏救援，这有力地证明了离子孔是离子孔，但只有定位于溶酶体时，才是粘蛋白-1功能所必需的。尽管最近有人提出MLIV主要是由于脂肪酶失活引起的代谢效应(9)我们的数据更符合先前提出的膜交通疾病，可能影响磷脂合成(10–12). 还应注意的是，先前已经证明MLIV细胞中的磷脂酰胆碱代谢是正常的(28).
通过粘蛋白-1通道的首选阳离子以及调节粘蛋白-1离子通道的机制尚不清楚。尽管其他人在表达cRNA后通过电生理实验确定了通道的一些特征爪蟾卵母细胞(5)，我们无法通过膜片钳这种细胞获得显示不同于内源性卵母细胞通道的可重复数据。当我们通过表达双亮氨酸突变GFP-粘蛋白-1（L15/16A+L577/578A）来增加卵母细胞表面粘蛋白的浓度时，这种情况并没有改善(补充信息图S2 A-G). 我们也无法从表达GFP-粘蛋白-1（L15/16A+L577/578A）的HEK-293细胞获得电生理数据，这些细胞与单独表达GFP的细胞不同(补充图S2 H-J). 获得转染细胞中粘蛋白-1通道的电生理数据的困难可能是由几个因素造成的。首先，这可能是由于蛋白水解裂解使通道失活。最近的工作表明粘蛋白-1在跨膜结构域1和2之间的管腔环中被裂解(21,22). 当蛋白酶组织蛋白酶B被添加到过度表达粘蛋白-1的哺乳动物细胞中时，离子通道活性降低(21). 这表明粘蛋白-1的裂解使离子通道失活。然而，关于组织蛋白酶B是否负责粘蛋白-1的裂解，目前有相互矛盾的报道。基谢廖夫等用组织蛋白酶B和L抑制剂CA-074-Me抑制粘蛋白-1的裂解(21)，而米德尔等观察到没有用相同的抑制剂阻断粘蛋白-1的裂解(22). 米德尔等进一步表明粘蛋白-1的裂解发生在溶酶体前室，可能是跨高尔基网络(22). 蛋白水解裂解是否在阳离子通道的生理调节中起任何作用尚不清楚。
难以从转染细胞中获得电生理数据的第二个可能原因是缺少通道的亚单位。在此背景下，应首先注意，有证据表明粘蛋白-1寡聚物和/或与其他蛋白质形成复合物(19,22)其次，其他TRP通道是异聚的，以形成阳离子渗透孔(29). 第三个原因是可能需要未知蛋白质或其他分子来打开通道。
粘蛋白-1通道的首选阳离子仍有待确定，尽管文献中的大多数报告支持钙离子2+或H+(5–9). 因此，可以假设Ca的浓度2+和/或H+MLIV细胞溶酶体中的离子会发生改变。我们没有看到直接测量Ca的报告2+MLIV细胞溶酶体中的浓度以及我们自己的测量尝试，使用内吞荧光探针Fura-2-葡聚糖(30)，由于干扰自动荧光而失败(31)并且因为所测量的钙浓度在酸性pH下低于探针的Kd。溶酶体H的测量+MLIV成纤维细胞中的浓度产生了令人困惑的数据，但有相互矛盾的报道称其升高了~1pH单位(32)，正常(33以及本研究，请参见补充信息)，或减少(9). 支持粘蛋白-1是H的假说的已发表数据+-选择性通道并不完全令人信服，因为对于高H+-人们预计，对于pH值的一个单位变化，反转电位将改变40-50 mV(34)然而，粘蛋白-1仅在15mV/pH单位的逆转电位上显示出变化(9).
如果粘蛋白-1是钙2+需要注意的是，它不太可能是唯一在调节Ca管腔浓度中起作用的转运蛋白/通道2+在溶酶体中。例如，Galione和同事(35)描述了溶酶体NAADP调节的钙2+频道。然而，这不太可能是粘蛋白-1，因为过表达粘蛋白-1的NRK细胞的膜与未转染细胞的膜相比，放射性标记的NAADP结合没有增加（数据未显示），并且添加NAADP不会导致表达粘蛋白1卵母细胞的电生理实验电流增加(补充图S2 G). 最近对溶酶体膜的蛋白质组学研究已确定存在配体门控P2X4阳离子通道(36)也可能在调节钙的管腔浓度中起作用2+.
方法
试剂
N个-（4,4-二氟-5,7-二甲基-4-硼酸-3a，4a-二氮杂-秒-茚并-3-戊酰基）鞘氨醇1-β-D-乳糖苷（BODIPY FL C5-乳糖神经酰胺；从Invitrogen（英国佩斯利）购买LacCer）、nigericin、荧光右旋糖酐结合物和荧光结合抗体。无脂肪酸牛血清白蛋白（BSA）购自罗氏诊断公司（英国刘易斯）。Filipin来自Sigma-Aldrich（英国普尔），U18666A来自Biomol（英国埃克塞特）
抗体
以前已经描述过单克隆抗鼠lgp120（GM10）、多克隆抗鼠甘露糖6-磷酸受体（MPR）和多克隆抗大鼠lgp110（580）(38). 通过用与谷胱甘肽-S-转移酶（GST）融合的大鼠粘脂质-1片段（氨基酸99-282）免疫Murex Lop兔（Murex Biotech Limited，Dartford，Kent）产生兔抗大鼠粘脂质-1。GFP的兔多克隆抗体来自Abcam Ltd（英国剑桥）。
细胞培养和转染
在含有10%（v/v）胎牛血清（FCS）和2 mM L-谷氨酰胺的DMEM中培养正常大鼠肾脏（NRK）细胞。来自MLIV患者（WG0909）的皮肤成纤维细胞和杂合亲本细胞（WG0987和WG0988）来自加拿大“突变人类细胞株库”(网址：www.cellbank.mcgill.ca). 这些细胞中的MCOLN1基因先前已经被鉴定(三). 人类成纤维细胞在改良的Eagle’s培养基（MEM）中培养，Earle’s盐添加10%FCS和2 mM L-谷氨酰胺。所有细胞在5%的加湿CO中生长237ºC时的大气。使用Fugene 6转染试剂以2的比例转染NRK和HEK-293细胞μg DNA：6μl富根。通过用0.2 mg/ml潮霉素（ΔpMEP4转染细胞）或0.5 mg/ml G418（pEGFP转染的细胞）培养细胞，生成稳定的细胞系。通过添加10μM氯化镉2实验前将其置于组织培养基中培养16h。在转染前一周，通过传代细胞进行人成纤维细胞转染，以便在转染当天获得融合。每次转染75 cm融合细胞2使用Amaxa Biosystems（德国科隆）人类皮肤成纤维细胞Nucleofector试剂盒（Nucleofector程序U-23）将5μg Qiagen midiprep DNA转染烧瓶。转染后，细胞在新鲜MEM培养基中培养（见组织培养），并在转染后24小时用于LacCer摄取实验。对于任何给定的实验，所有细胞都具有相同的传代数，并且没有超过传代数10的细胞用于转染。
在分析之前，用U18666A处理的细胞与3μg/ml U18666A孵育24小时。
分馏和免疫印迹
如前所述，从大鼠肝脏中制备富含晚期内体（LE）和溶酶体（L）的组分(15). 简单地说，用冰冷的STM缓冲液（250 mM蔗糖、10 mM TES、pH 7.4、1 mM MgCl）快速冲洗大鼠肝脏2)然后在Potter-Elvehjem匀浆器中用3 ml STM/g肝脏匀浆。肝匀浆在500℃下离心克持续10分钟，然后将线粒体后上清液加载到Ficoll梯度（晚期内体）或Nycodenz梯度（溶酶体）的顶部。对于晚期内体，将5ml线粒体后上清液加载在30ml 1-22%连续Ficoll梯度的顶部，放置在4ml 45%Nycodenz缓冲垫上。对于溶酶体，14 ml线粒体后上清液覆盖在由21 ml 20%Nycodenz和4 ml 45%Nycoden组成的阶梯梯度顶部。梯度在206000处离心克在Beckman立式转子（VTi50）中保持1小时。从底部收集组分（1ml），分离富集在晚期内体或溶酶体中的组分。典型地，在组分4-10中发现溶酶体，并且在对应于折射率1.366-1.373的梯度部分中发现晚期内体。
汇流NRK电池（1 m2)刮入冰冷的PBS中，通过离心法造粒。将细胞重新悬浮在5 ml含STM蛋白酶抑制剂中，并通过Balch匀浆器5次（比清除率为14μm） ●●●●。匀浆在1500下离心克持续10分钟，将核后上清液覆盖在1-22%的Ficoll梯度上，并如上所述离心。从梯度底部收集3 ml组分。通过将等体积的底物（5 mM对硝基苯基N-乙酰基-β-D-葡糖胺酶，50 mM柠檬酸钠，pH 4.8，0.2%Triton X-100）与梯度级分在37°C下孵育1小时来测定β-己糖胺酶。通过加入等体积的碳酸缓冲液（83 mM Na2一氧化碳三pH 10.7，133 mM甘氨酸，67 mM NaCl），然后在410 nm处测量吸光度。
蛋白质通过使用不连续缓冲液在10%SDS聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，使用大鼠粘蛋白-1、lgp110或甘露糖6-磷酸受体抗体进行免疫印迹，并通过增强化学发光（ECL；GE Healthcare，Little Chalfont，UK）显示条带。
显微镜
为了进行免疫荧光标记，用PBS清洗盖玻片上生长的细胞，然后用4%多聚甲醛在PBS中固定20分钟。随后用0.1%Triton X-100在PBS中渗透细胞10分钟。所有细胞在室温下在0.2%（w/v）BSA在PBS（BSA-PBS）中培养10分钟，然后在室温下与一级抗体在BSA-PBS中培养1小时。用BSA-PBS清洗细胞3 x 5分钟，然后在室温下用荧光结合（Alexa Fluor 488或Alexa Fuor 555）二级抗体在BSA-PBS中孵育30分钟。如前所述洗涤细胞，并用含有2.5%（w/v）1,4-重氮双环-[2,2,2]-辛烷（DABCO）的Moviol将盖玻片安装在载玻片上。
用filipin染色的细胞用多聚甲醛固定（如上所述），但不用Triton X-100渗透。然后按照上述方法对细胞进行染色，但在所有阶段使用含有0.5mg/ml菲利平的PBS-BSA溶液进行染色。
通过在组织培养基中用1mg/ml赖氨酸固定的荧光右旋糖酐结合物（英维特罗根，佩斯利，英国）培养细胞4小时，然后在固定前追踪20小时，获得荧光右旋糖图像(). 中显示的单元格在肝细胞成像前，用右旋糖酐偶联物连续脉冲3h。
所有固定细胞免疫荧光图片（除)使用蔡司LSM510共焦显微镜，使用63x平面彩色物镜（数字孔径1.4）进行采集。图像以1024 x 1024像素的分辨率采集，并显示为最大强度Z投影。图像处理使用了Adobe Photoshop软件。的图像在显微镜上获得，详见下文LacCer部分。免疫电子显微镜如前所述(37).
LacCer贩运
用于LacCer吸收实验的细胞生长在35 mm的玻璃底组织培养皿上。用PBS清洗细胞两次，然后在37℃下用5μM LacCer（按照制造商的说明与BSA复合）在无血清MEM中培养1小时。然后用PBS清洗细胞两次，然后在37℃下用正常MEM（MEM+10%FCS）培养2小时或5小时（如有规定）。用PBS洗涤细胞，然后用4℃下含有2%（w/v）无脂肪酸BSA的正常MEM洗涤细胞（3 x 15 min）反萃取质膜LacCer。然后用不含酚红和碳酸氢钠的MEM培养基清洗细胞，该培养基含有2 mM L-谷氨酰胺、1%（v/v）FCS和10 mM HEPES，20°C时pH值为7.4。在装有汞蒸气灯和过滤器组XF26（美国佛蒙特州Omega Optical）的蔡司Axiover 200M显微镜上，使用63x平面彩色物镜（数字孔径1.4）立即（在室温下）观察细胞内的脂质。滤波器组XF26由一个激励滤波器（485DF22）、二向色滤波器（505DRLP）和两个发射滤波器（OG590和530DF30）组成。两种激发滤光片考虑到与乳糖神经酰胺部分缀合的BODIPY FL荧光团由于分子间准分子的形成而产生绿色荧光和聚集依赖性的向红色荧光的转变。在使用的实验条件下，几乎没有观察到LacCer红色荧光，因此所有LacCer图像(,&)使用530nm鉴别滤光片获得。在一些细胞类型中观察到显著的绿色自荧光，通过在汞蒸气光路前使用蔡司1.0 ND滤光片消除了这种自荧光，但仍能检测到LacCer。荧光图像是用哈马松Orca ER冷却CCD相机拍摄的。使用英国考文垂Improvision公司的Openlab软件对图像进行分析。对于捕获的每个图像，使用阈值生成一个二元掩模，该阈值选择与观察到的荧光模式相对应的亮度值（消除背景信号和焦平面外荧光）。使用此过程，强度超过阈值的像素的值为1，所有其他像素的值均为0。从二值图像中选择并删除与高尔基荧光明显对应的像素。然后使用Openlab软件计算二进制层中各个区域（对应于正像素）的数量。比较不同阈值产生的口罩并没有显著改变结果。在获取LacCer图像之前，首先使用过滤器组00（英国韦尔文花园城卡尔蔡司）鉴定转染HcRed-mucolipin-1结构体的细胞。Adobe Photoshop软件用于所有后续图像处理。
致谢
这项工作由MRC Grant G9310915资助。CIMR由战略计划拨款（066438）支持，FMG由威康信托基金高级临床研究奖学金支持。FR由英国糖尿病R.D.Lawrence奖学金资助。我们感谢Abigail Brown在西蒙·麦卡勒姆（Simon McCallum）提供流式细胞术帮助，凯瑟琳·鲍尔斯（Katherine Bowers）、福尔马·巴斯（Folma Buss）、安东尼·加利昂（Antony Galione）、露丝·默雷尔·拉格纳多（Ruth Murrell-Lagnado）和罗伯·派珀（Rob Piper）提供有益的讨论。
工具书类
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