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医学科学杂志。2020; 26:e920678-1–e920678–9。
2020年4月18日在线发布。2020年2月10日在线预发布。 数字对象标识：10.12659/MSM.920678
预防性维修识别码：项目管理委员会7191948
PMID：32303670

醛固酮对Sirtuin 1（SIRT1）诱导肺动脉高压内皮祖细胞衰老和增殖抑制的影响

王悦（Yue Wang）,1,A类 Bin Zhong先生,2,B类 吴启勇（Qiyong Wu）,2,C类 季春童,2,D类 陶朱,2,E类和张明（Ming Zhang）通讯作者2,F类
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

背景

肺动脉高压（PAH）的特征是肺循环阻力逐渐增加。肺血管内皮功能障碍是原发性肺动脉高压的主要原因之一。内皮祖细胞（Endothelial progenitor cells，EPCs）可以增殖分化为血管内皮细胞，在维持正常内皮功能中发挥重要作用。据报道，盐皮质激素受体抑制剂可用于治疗多环芳烃。然而，醛固酮（ALDO）在PAH中的作用及其潜在机制尚不清楚。

材料/方法

大鼠分为4组（每组10只），分别用0.9%生理盐水、野百合碱（MCT）、螺内酯（SP）或MCT联合SP治疗。大鼠用过量戊巴比妥钠处死后，进行苏木精伊红染色，观察肺动脉病理切片。western blot检测Sirtuin 1（SIRT1）、p53和p21蛋白表达。免疫荧光染色验证内皮祖细胞。用不同浓度的ALDO处理内皮祖细胞。MTT法和衰老相关β-半乳糖苷酶染色法检测细胞活力和衰老。

结果

MCT增加了大鼠肺组织血管壁厚度和壁面积，抑制SIRT1蛋白表达，增加了p53和p21蛋白的表达，而SP部分逆转了这一作用。此外，ALDO还抑制了内皮祖细胞的活力并诱导其衰老。SIRT1 siRNA转染EPC后，EPC中p53和p21蛋白的表达上调，加速了EPC的衰老。

结论

ALDO通过下调SIRT1（调节p53/p21通路）促进EPCs衰老并抑制EPCs增殖，从而促进PAH。

MeSH关键字：醛固酮，高血压，Sirtuin 1

背景

肺动脉高压（PAH）以小肺动脉闭塞和重塑为特征，可导致肺血管阻力逐渐增加、右心室衰竭，甚至死亡[1–三]. PAH患者肺血管高度重塑是由基因改变、细胞信号改变、代谢改变、异常压力和慢性炎症引起的[4]. 内皮祖细胞通常被定义为能够分化为内皮细胞并有助于形成新血管的细胞[5]. 内皮祖细胞是来源于骨髓的单核细胞群[6]并通过促进新的内皮生长和内皮修复机制在维持血管完整性方面发挥重要作用，保护缺血损伤后的组织灌注[7]. 据报道，循环内皮祖细胞的衰老和功能障碍加剧可能会加速内皮功能障碍，导致PAH肺血管重塑[8]. 因此，延缓内皮祖细胞的衰老可能有助于预防多环芳烃。

Boehm等人[9]指出目前，肺动脉高压的治疗并不针对肺血管重塑过程；然而，醛固酮（ALDO）与螺内酯（SP）的拮抗作用可以改善肺血管重构过程中的运动能力和内皮功能障碍。据报道[10]PAH患者血浆ALDO水平与经肺梯度呈正相关。此外，根据Ogo的一份报告[11]PAH与肾素-血管紧张素-醛固酮系统和交感神经系统的加速激活有关。此外，醛固酮拮抗剂可以降低严重左心衰患者的发病率和死亡率；然而，ALDO对PAH和心力衰竭的病理影响尚未完全阐明[9].

Sirtuin 1（SIRT1）是一种氧化还原敏感蛋白[12]参与许多细胞过程，包括代谢、衰老、昼夜节律调节、氧化应激反应和增殖[13]. SIRT1是NAD+依赖性去乙酰化酶，可导致靶p53的下调和去乙酰化，而靶p53是细胞周期素依赖性激酶抑制剂p21/cip1转录的上游调节器[14]. 研究[15]发现长非编码RNA（lncRNA）介导SIRT1/p53和FoxO3a信号通路，在慢性阻塞性肺疾病的发病机制中调节II型肺泡上皮细胞衰老。此外，根据2019年的一份报告[16]，ALDO刺激可能通过SIRT1/AMPK信号通路诱导比格犬心室心肌细胞的代谢重塑。因此，在本研究中，我们推测ALDO对PAH的影响与刺激EPC和调节SIRT1/p53/p21通路有关。

材料和方法

多环芳烃动物模型

雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，年龄12-14周，体重250±20 g，购自Sparford Laboratory Animal Science and Technology Co.，Ltd.（中国北京）。为了确定盐皮质激素受体抑制对野百合碱（MCT）诱导的PAH的影响，SD大鼠被随机分为4组（每组10只）：对照组、螺内酯（SP）组、MCT组和MCT+SP组。SD大鼠在饮用水中或MCT（50 mg/kg；Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA）中单独腹腔注射0.9%生理盐水作为溶媒对照或SP（25 mg/kg/天；Henry Schein，Melville，USA。治疗23至25天后，用过量的戊巴比妥钠（100 mg/kg）处死大鼠。取大鼠肺组织，用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗，分为2部分。一部分用4%聚甲醛固定过夜，石蜡包埋，切片进行苏木精-伊红染色（H&E）；另一部分在−80°C下冷冻，以检测SIRT1、p53和p21蛋白表达水平。动物实验是按照实验动物的饲养和使用规则进行的。这项研究得到了常州大学动物研究伦理审查委员会的批准。

H&E染色

用H&E染色观察肺动脉病理切片。肺动脉用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋肺动脉。然后将肺动脉切成5 mm段。切片用H&E染色。每个切片从10个显微镜下随机选择并在显微镜下观察。为了量化肺动脉壁的厚度，测量了10条肺段直径为50至100 mm的肌肉动脉的管腔直径（或基底膜水平面积）和总血管直径（或外膜边缘面积）。直径和面积由ImageJ（美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院）测量。然后计算血管壁厚度（%）：（总血管直径-最小直径）/总血管直径×100%，壁面积（%）:（总血管面积-最小面积）/总管道面积×100%。

Western blot（WB）分析

Western blot（WB）分析检测肺组织中SIRT1、p53和p21蛋白。冷冻肺组织（100 mg）在液氮中研磨成粉末。添加含有1%PMSF的RIPA热解溶液1 mL。上清液在4°C、12 000 rpm下离心20分钟。蛋白质含量由BCA蛋白质测定试剂盒（中国贝尤蒂姆）测定。蛋白质（30μg）经过12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），然后转移到聚偏氟乙烯膜（Millipore Billerica，MA，USA）。在室温下，用5%脱脂牛奶封闭膜2小时。我们加入1:250稀释的SIRT1（ab110304121kD）、p53（ab131442，53kD）和p21（ab109199，21kD）抗体，并在4°C下孵育过夜。GAPDH（1:500，36kD，ab8245）用作内部对照（抗体购自英国剑桥Abcam）。样品在室温下与辣根过氧化物酶结合二级抗体（1:10000；美国Li-Cor公司）孵育1小时。进行ImageJ进行半定量分析。

免疫荧光染色

使用Ficoll-Paque™PREMIUM（德国弗莱堡GE-Healthcare）通过密度梯度离心分离健康大鼠的内皮祖细胞。EPC（1×107)将其接种在涂有人类纤维连接蛋白（Millipore，Temecula，USA）的6孔板上，置于含有内皮生长介质-2（EGM-2）SingleQuots（Lonza，Walkersville，MD，USA。培养7天后，用免疫荧光染色法检测内皮祖细胞，细胞凝集素（UEA-1）凝集素结合和乙酰化低密度脂蛋白（acLDL）双重阳性。细胞与1,1′-十八烷基-3,3,3′，3′-四甲基氰基碳标记的acLDL（DiI-acLDL，2.47 ug/mL）在37℃孵育1小时，然后用2%多聚甲醛固定在PBS中10分钟。然后用UEA-1的异硫氰酸荧光素标记的凝集素（10 mg/mL）对细胞染色1小时。DAPI（4′6-二氨基-2-苯基吲哚，己二酸）作为对照，观察细胞核。图像在荧光显微镜下放大。分化的内皮祖细胞经DiI-acLDL和UEA-1凝集素双重阳性染色。

3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化铵（MTT）测定

EPC（1×104细胞/孔）接种在96个培养皿中。用不同浓度（1、10、100和1000 nmol/L）的ALDO处理内皮祖细胞，用MTT检测细胞活力。同时设对照组。再培养24小时后，添加MTT，再培养细胞4小时，然后添加二甲基亚砜（DMSO）。结晶完全溶解后，使用商用酶联免疫吸附分析试剂盒（美国明尼阿波利斯R&D Systems公司）测量490 nm波长下的光密度。

细胞分组和转染

在用不同浓度的ALDO处理内皮祖细胞后，进行MTT分析以检测细胞活力，从而选择100 nmol/L的ALDOs进行进一步实验。然后将细胞分为4组：对照组（未经处理的内皮祖细胞）、SP组（用10μmol/L SP处理的内皮细胞）、ALDO组（用100 nmol/L ALDO处理的内皮细胞核）、ALDO+SP组（使用10μmol/L SP和100 nmol/L ALDO治疗的内皮核细胞）。为了探讨其潜在机制，将细胞转染SIRT1 siRNA，并将细胞分为3组：对照组、siNC组（转染siNC的EPCs）和siSIRT1组（转播SIRT1 siRNA的EPCs）。EPC（5×105细胞/孔）接种在6孔板中。然后使用Lipofectamine 2000（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）将对照siRNA（siNC）或SIRT1 siRNA（Santa Cruz Biotechnology，Carlsba，CA，US）转染细胞。转染48小时后，进行进一步实验。

衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色

通过以下方法检测内皮祖细胞的衰老就地用酸性β-半乳糖苷酶染色试剂盒用SA-β-gal染色（Beyotime，南京，中国）。通过添加PBS终止反应后，通过在光学显微镜下对每个代表性视野至少300个细胞进行计数来检查β-半乳糖阳性细胞的数量。实验进行了3次，β-半乳糖阳性细胞数表示为总细胞的百分比。

统计分析

GraphPad Prism（GraphPad Software Inc.，La Jolla，CA，USA）用于分析所有数据。数据表示为平均值±标准偏差。采用单因素方差分析和Tukey检验分析各组之间的差异。全部P（P）数值<0.05被认为具有统计学意义。

结果

SP显著阻止MCT诱导的PAH的发展

MCT治疗后，采集肺动脉病理切片。H&E结果显示，与对照组相比，MCT组大鼠肺动脉壁厚度/直径以及肺节段壁面积与总血管面积之比的百分比变化增加，而SP逆转了MCT诱导的PAH的发展(图1A–1C). 然后，用WB检测SIRT1、p53和p21蛋白的表达。结果表明，MCT下调了SIRT1的表达，上调了p53和p21在大鼠肺组织中的表达，而SP部分逆转了MCT对大鼠肺组织的作用(图1D、1E).

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肺动脉病理切片及肺组织中sirtuin 1（SIRT1）、p53和p21的表达。(A类)每组肺切片的苏木精-伊红染色（H&E）代表性图像。(B类)计算肺切片壁厚与总血管总直径的比值。结果表明，与对照组相比，野百合碱（MCT）治疗组大鼠肺动脉壁厚/直径百分比增加，而螺内酯（SP）逆转了MCT的这种作用。(C类)计算肺段壁面积与总血管面积的比值。结果表明，与对照组相比，MCT治疗组大鼠肺动脉壁厚度/直径百分比增加，而SP逆转了MCT的这种作用。(D、 E类)western blot（WB）结果显示，与对照组相比，MCT下调了肺动脉高压（PAH）大鼠肺组织中SIRT1的表达，上调了p53和p21的表达**P（P）<0.001与对照，# P（P）<0.05,## P（P）<0.001与MCT。

大鼠内皮祖细胞的表型特征

我们从健康大鼠的外周血单个核细胞中分离出内皮祖细胞。用免疫荧光染色法鉴定内皮祖细胞。三色荧光成像结果显示，EPCs对Dila-acLDL（红色）的摄取，与FITC-UEA-1（绿色）结合。细胞核用DAPI（蓝色）染色。分化后的内皮祖细胞呈双阳性，覆盖层为黄色(图2A).

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健康大鼠外周血内皮祖细胞（EPCs）的特征以及不同浓度醛固酮（ALDO）对EPCs活性和sirtuin 1（SIRT1）表达的影响。(A类)免疫荧光染色鉴定内皮祖细胞。结果显示，EPCs与Dila-acLDL（红色）和FITC-UEA-1（绿色）结合。细胞核用DAPI（蓝色）染色。分化后的内皮祖细胞呈双阳性，覆盖层为黄色。(B类)3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化铵（MTT）检测结果表明，ALDO以剂量依赖性的方式抑制EPCs活性。(C、 D类)western blot（WB）结果显示，ALDO以剂量依赖的方式下调SIRT1蛋白的表达*P（P）<0.05, **P（P）<0.001与对照组。

ALDO以剂量依赖性方式抑制PAH大鼠EPCs活性

用不同浓度的ALDO（1、10、100和1000 nmol/L）处理内皮祖细胞。用MTT和WB测定细胞活力和SIRT1蛋白的表达。结果发现，随着ALDO浓度的增加，ALDO对内皮祖细胞活力的抑制作用明显(图2B). 此外，ALDO可以抑制EPC中SIRT1蛋白的表达，并且ALDO浓度越高，对SIRT1表达的抑制作用越明显(图2C，2D).

ALDO抑制内皮祖细胞的活力并诱导其衰老

为了进一步探索ALDO在内皮祖细胞中的作用，我们通过MTT法测量了细胞活力，并对内皮祖细胞进行SA-β-gal染色以检测衰老。结果显示，与对照组相比，ALDO降低了EPC在490nm波长下的光密度。与ALDO组相比，盐皮质激素受体抑制剂SP增加了内皮祖细胞的光密度(图3A). 此外，与对照组相比，ALDO组β-半乳糖苷酶阳性细胞百分比明显增加，而SP显著逆转了ALDO诱导的衰老(图3B、3C). 此外，ALDO抑制了EPCs中SIRT1蛋白的表达，而在用ALDO和SP处理的EPCs中SIRT1蛋白显著上调(图3D，3E).

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醛固酮（ALDO）和螺内酯（SP）对内皮祖细胞（EPC）增殖和衰老的影响。(A类)与对照组相比，ALDO（100 nmol/L）处理的EPCs在490 nm波长处的光密度较低，而SP（10μmol/L）显著逆转了ALDO的作用。(B、 C类)测定衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性，结果表明，与对照组相比，ALDO组β-半乳糖苷酶阳性细胞百分比增加，而SP显著逆转了ALDO诱导的衰老。(D、 E类)western blot（WB）结果显示，ALDO下调内皮细胞sirtuin 1（SIRT1）蛋白的表达，而SP显著逆转了ALDO的作用**P（P）<0.001与对照组。# P（P）<0.05,## P（P）<0.001与SP。& P（P）<0.05,&& P（P）<0.001与ALDO。

ALDO通过下调SIRT1抑制内皮祖细胞的活力并诱导其衰老

接下来，为了探讨ALDO对内皮祖细胞影响的潜在机制。用SIRT1 siRNA转染内皮细胞，用WB法检测转染率，结果表明SIRT1 siRNA转染的内皮细胞中SIRT1蛋白显著下调(图4A、4B). 此外，转染SIRT1 siRNA的内皮祖细胞中p53和p21蛋白的表达上调(图4C、4D). 然后进行SA-β-半乳糖苷酶染色检测内皮祖细胞的衰老，结果显示，与对照组和siNC组相比，siSIRT1组的β-半乳糖苷酶阳性细胞百分比增加(图4E、4F).

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sirtuin 1（SIRT1）通过调节p53/p21通路在内皮祖细胞（EPCs）衰老中的作用。(A、 B类)western blot（WB）结果显示SIRT1 siRNA成功转染细胞(C、 D类)WB结果显示，当用SIRT1 siRNA转染细胞时，EPC中p53和p21蛋白的表达上调(E、 F类)通过衰老相关的β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性测量细胞衰老，结果发现，与对照组相比，siSIRT1组的β-半乳糖苷酶阳性细胞百分比增加*P（P）<0.05, **P（P）<0.001与对照组。# P（P）<0.05,## P（P）<0.001与siNC。

讨论

本研究的主要发现是MCT增加了大鼠肺组织血管壁厚度和壁面积，而SP作为ALDO的拮抗剂部分逆转了MCT的这种作用。MCT抑制大鼠肺组织SIRT1蛋白表达，增加p53和p21蛋白表达。细胞实验表明，ALDO通过调节SIRT1/p53/p21通路抑制正常内皮祖细胞的活性并诱导衰老。

肺动脉高压病理学的核心是由血管平滑肌细胞、内皮细胞、炎性细胞和肌成纤维细胞的增殖组成的丛状病变，这些细胞阻塞了肺动脉[17]. 根据Thompson等人[18]血管重塑是PAH的主要病理特征，但对这一过程的治疗很少。根据2018年的一项综述，内皮祖细胞参与内皮细胞再生，被认为是内源性血管修复的重要因素，可以通过替换功能失调的内皮祖细胞促进受损动脉的再内皮化，从而抑制新内膜的形成[19]. 据报道，内皮祖细胞的正确归巢在再生动脉的重塑中起着关键作用。然而，EPC促进肺血管重塑的机制尚不清楚[20].

动物模型是了解肺动脉高压病理生理学以及发现和开发新疗法的重要工具[21]. 本研究采用MCT建立PAH大鼠模型。通过H&E染色观察肺动脉病理切片。此外，还计算了血管壁厚度和壁面积。结果显示，模型大鼠肺组织中血管壁厚度和壁面积的变化。SP对MCT诱导的大鼠PAH有抑制作用。SP对心血管疾病有广泛的治疗作用。之前的研究[22]据报道，SP和利伐沙班联合治疗通过抑制StAR产生的pal-2和局部醛固酮，部分抑制了PAH的心血管重塑。Safdar等人对46例PAH患者的临床研究[23]表明SP是安全的，耐受性良好，在高钾血症或肝功能测试异常的患者中没有增加副作用。

我们还发现，MCT下调了PAH大鼠肺组织中SIRT1的表达，上调了p53和p21的表达。之前的研究[24]结果表明，白藜芦醇通过增强SIRT1激活，部分改善了PAH大鼠的右心室收缩压，减轻了右心室肥厚，从而产生了有益的作用。近年来，许多研究指出SIRT1在细胞增殖和凋亡中起着关键作用。例如，Igarashi等人的研究[25]结果表明，在肠道中，SIRT1激活的化合物预计不会损害Paneth细胞中的信号转导，并激活肠干细胞中的SIRT1，这将增加肠干细胞的数量，有益于健康。SIRT1还被证明抑制氧化应激诱导的血管平滑肌细胞增殖[26]. 同样，另一项研究发现，肌酸通过抑制miR-34a/SIRT1/p66shc通路，至少对非酒精性脂肪性肝病提供了部分保护[27]. 其他研究人员[28]发现SIRT1在肠再灌注早期逐渐被抑制，导致肠内活性氧的积累和凋亡。p53/p21途径是诱导细胞衰老的主要途径之一[29]是我们研究的重点之一。SIRT1被发现与p53特异性结合并去乙酰化，负调控氧化应激中p53介导的转录激活，包含p53介介导的p21转录激活[29]. 基于上述结果，我们推测SP对PAH大鼠的影响可能是通过SIRT1/p53/p21途径实现的。

我们通过细胞实验进一步探讨了ALDO影响内皮祖细胞功能的机制。结果表明，ALDO抑制正常内皮祖细胞的活力并诱导其衰老。此外，ALDO在正常内皮祖细胞中下调SIRT1蛋白表达，上调p53和p21蛋白表达。我们推测，ALDO通过下调SIRT1刺激EPCs并促进PAH，SIRT1促进EPCs衰老并抑制EPCs增殖。然后，我们将SIRT1 siRNA转染到内皮祖细胞，以验证SIRT1通过调节p53/p21调节内皮祖细胞衰老。结果表明，SIRT1 siRNA转染细胞后，EPC中p53和p21蛋白表达上调，加速了细胞衰老[30]发现MeCP2抑制了端粒活性低、p16和p53 mRNA水平高的衰老内皮细胞中的SIRT1，SIRT1显示了逆转MeCP2对内皮细胞的作用。

结论

总之，我们的研究结果表明，ALDO刺激了内皮祖细胞。研究发现，ALDO下调SIRT1，SIRT1通过调节p53/p21通路促进EPCs衰老，抑制EPCs增殖，从而促进PAH。然而，这项研究有一些局限性。例如，ALDO对PAH大鼠模型中EPC的影响需要在未来的试验中直接研究，其他可能参与细胞衰老的途径也需要研究。

缩写

阿尔多醛固酮
acLDL公司乙酰化低密度脂蛋白
DiI-acLDL公司1,1′-十八烷基-3,3,3′，3′-四甲基氰基碳标记的acLDL
EPC内皮祖细胞
健康与环境苏木精和曙红
MCT公司野百合碱
MTT公司3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴
多环芳烃肺动脉高压
SA-β-加仑衰老相关β-半乳糖苷酶
标准偏差斯普拉格-道利
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳
SIRT1公司Sirtuin 1号机组
服务提供商螺内酯
UEA-1公司欧洲榆凝集素
工作分解结构西方印迹

脚注

支持来源：这项工作得到了常州市卫生和计划生育委员会重点科技项目的支持[批准号ZD201503]

工具书类

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