脯氨酸氧化酶是一种p53诱导的基因，靶向COX-2/PGE₂诱导大肠癌细胞凋亡和抑制肿瘤生长的信号转导

摘要

介绍

前列腺素和其他花生四烯酸代谢物参与调节正常细胞生长以及在慢性炎症和致癌等病理状态下观察到的异常增殖(普雷斯科特和菲茨帕特里克，2000年;Gupta和Dubois，2001年;丹纳伯格等。，2005). 环氧合酶（COX）催化游离花生四烯酸转化为前列腺素的关键步骤。由于COX-2基因表达的正常调节缺陷，结直肠癌和其他实体肿瘤的COX-2水平升高。在人类和实验动物模型中，研究表明阿司匹林和其他非甾体抗炎药在降低结肠癌相对风险和促进结肠癌肿瘤消退方面的功效，首次提出了COX-2表达与致癌的关系(威廉姆斯等。，1997;川盛等。，1998;Gupta和Dubois，2001年). 目前人们普遍认为COX-2和前列腺素，尤其是前列腺素E2（PGE₂)与结直肠癌以及其他组织肿瘤的发生发展直接相关。通过药理手段抑制COX-2或直接调节其表达/活性可限制人类癌症的发展或进展。因此，它们是癌症预防和治疗的重要目标。

结直肠癌是美国男性和女性癌症相关死亡的第二大原因(杰马尔等。，2005). 结直肠癌的发生是由于一些抑癌基因和癌基因编码序列中的突变或缺失的连续积累，以及控制基因组稳定性的分子的异常活性。COX-2、p53、表皮生长因子受体（EGFR）、β-连环蛋白/腺瘤性息肉病大肠杆菌（APC）、K-ras等都可能在结直肠癌发生中起重要作用(沃斯利等。，2007). 例如，80%以上的结直肠癌具有β-catenin或APC突变，导致该途径激活，尽管EGFR在50%以上的结肠癌中过度表达，并且与更具侵袭性和侵袭性的表型相关。这些信号之间的相互作用，例如COX-2和EGFR之间的相互影响，以及COX-2与β-catenin/APC之间的相互关系至关重要(丹纳伯格等。，2005). 因此，这些相互作用对于理解结直肠癌的致癌机理以及治疗干预至关重要。

脯氨酸氧化酶（POX）是一种线粒体内膜黄素酶，参与氨基酸脯氨酸的降解，脯氨酸占胶原蛋白结合残基的25%以上，胶原蛋白是细胞外基质和人体中最丰富的蛋白质。POX催化脯氨酸转化为吡咯啉-5-羧酸盐（P5C）。与P5C还原酶（将P5C转化回脯氨酸）一起，它们介导脯氨酸循环，在线粒体和细胞质溶质之间穿梭氧化还原当量。此外，P5C是连接三羧酸（TCA）和尿素循环的直接碳桥的中间体。最近的研究揭示了POX对能量和营养应激的反应。在发现它是p53诱导的结直肠癌细胞凋亡的基因之一后，人们对它在细胞增殖、凋亡细胞死亡，特别是在癌细胞中的作用进行了深入的研究。由p53诱导(波利亚克等。，1997)以及过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（多种细胞过程的另一个重要调节因子）(熊猫等。，2006). POX可通过内源性和外源性途径诱导细胞凋亡。在这两种情况下，活性氧（ROS）的生成，尤其是超氧化物的生成起着关键作用。下游介质包括激活T细胞途径的钙调神经磷酸酶/核因子的激活和MEK/ERK信号的抑制(里维拉和麦克斯韦，2005年;线路接口单元等。，2006年b).

POX导致凋亡细胞死亡，抑制肿瘤生长在体外和体内（提交手稿），这促使我们询问这些效应是否与上述对结直肠癌发生至关重要的信号传导有关。这里，我们显示POX抑制COX-2/PGE₂活动和PGE₂将细胞从POX诱导的凋亡中拯救出来。此外，β-catenin/APC和EGFR信号也被POX抑制。这表明POX的作用涉及结肠直肠细胞中的多条通路，进一步支持了这些通路之间的相互干扰对肿瘤发展至关重要。与来自同一患者的正常组织样本相比，人类癌症组织样本中POX的表达降低，这表明POX可能是结肠组织中的一种重要肿瘤抑制因子。由于POX和相关酶是细胞外基质代谢的重要调节因子，这些发现强烈表明，在能量/营养应激的情况下，POX可能调节癌症表型。

结果

COX-2/PGE的抑制作用₂通过POX发送信号

我们和其他人(Maxwell和Rivera，2003年;线路接口单元等。，2005,2006年b;里维拉和麦克斯韦，2005年)已证明POX在多种癌症中诱导细胞凋亡并抑制肿瘤生长，包括结直肠癌。作为COX-2/PGE₂信号在结直肠癌发生中起着如此重要的作用，我们决定确定它是否也参与POX依赖性抑制肿瘤生长。我们使用去除多西环素（DOX）可以诱导POX的DLD-1结直肠癌细胞系，监测POX诱导下COX-2的表达水平。我们发现，去除DOX并诱导POX后，COX-2的表达显著降低(图1a). DOX对DLD-1 Tet-Offvector细胞中COX-2的表达没有影响，在DLD-1的Tet-Off矢量细胞中，POX不是通过从培养基中去除DOX而诱导的(图1a). 由于COX-2的转录激活，例如通过生长因子、转录因子、促炎症介质，也是调节COX-2活性的重要手段，我们使用COX-2启动子荧光素酶构建物来检测POX的潜在变化。数据显示，使用和不使用DOX的情况之间差异极小，表明POX并没有抑制COX-2活性(图1b).

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图1

环氧合酶-2（COX-2）/前列腺素E2（PGE）的抑制作用₂)脯氨酸氧化酶（POX）。将DLD-1-Tet-Off POX细胞和DLD-1-Tet-Off载体细胞在不含多西环素（DOX）的培养基中培养0、1、3和5天。收集细胞并制备细胞裂解物。通过蛋白质印迹法测定POX和COX-2的表达水平(一). 通过荧光素酶分析测定POX对COX-2反式激活活性的影响(b条). POX也抑制PGE₂酶联免疫吸附试验测定的活性(c（c）). 前列腺素E₂治疗（5μM）部分逆转了POX诱导的细胞凋亡，如图所示₀/G公司₁相位(d日和e（电子）)通过流式细胞仪分析进行评估，并通过3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-5-（3-羧基-甲氧基苯基）-2-（4-磺苯基）-2H-四唑（MTS）细胞增殖试验测量细胞生长(（f）). 星号表示统计上的显著差异(*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01).

作为COX-2的主要酶制剂，PGE水平₂也进行了检查。如预期，PGE₂POX也显著降低了水平(图1c). 进一步支持COX-2/PGE的作用₂在POX诱导的凋亡和生长抑制信号中，我们用不同浓度的PGE处理DLD–POX细胞₂并进行分析以确定细胞周期分布和细胞生长，并发现PGE₂部分逆转了POX诱导的细胞凋亡，在没有DOX的情况下，第3天的平均凋亡率从19.1%下降到7.7%(图1d和​和）。e（电子）). 它还部分逆转了生长抑制(图1f). 这些数据表明COX-2/PGE₂抑制在POX诱导的细胞凋亡和生长抑制中起着重要作用。

活性氧/超氧化物在COX-2/PGE抑制中的作用₂活性和细胞生长

我们已经证明POX诱导的细胞凋亡是由ROS/超氧化物直接介导的(线路接口单元等。，2005,2006年b). 这里，我们再次表明POX表达以时间依赖的方式导致ROS/超氧化物的生成(图2a). 锰超氧化物歧化酶（MnSOD）是一种线粒体酶，可将超氧化物转化为H₂O（运行）₂，阻止了这种凋亡(图2b). 我们怀疑这些影响至少部分是通过COX-2/PGE产生的₂活性氧/超氧化物的调节和介导。为了证明这一点，我们用MnSOD重组腺病毒（Ad-MnSOD）处理DLD-1-POX细胞，发现MnSOD部分逆转了POX介导的COX-2减少(图2c). 与此一致的是，MnSOD还逆转了PGE水平的降低₂通过POX(图2d)支持COX-2/PGE的解释₂POX的减少是由ROS/超氧化物水平的增加介导的。

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图2

活性氧（ROS）/超氧化物参与环氧化酶-2（COX-2）/前列腺素E2（PGE）₂)POX抑制。(一)脯氨酸氧化酶（POX）表达产生超氧化物自由基。DLD-1 Tet-Off POX细胞在有无强力霉素（DOX）的情况下培养。在不同的时间点，进行氢噻吩分析以测量超氧自由基的生成。DLD-1 Tet-Off POX细胞在DOX存在下接种于24孔板中，并用等量载体病毒感染含锰超氧化物歧化酶（MnSOD）的重组腺病毒作为对照。2天后从培养基中去除DOX，并使用3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-5-（3-羧甲基氧基苯基）-2-（4-磺苯基）-2H-四氮唑（MTS）增殖试验测定细胞生长(b条). 用MnSOD重组腺病毒（Ad-MnSOD）或腺病毒载体感染细胞，1天后将DOX从培养基中去除3天。收集细胞并进行COX-2蛋白印迹和PGE测定₂已执行活动(c（c）和d日). 星号表示统计上的显著差异(*P（P）<0.05; **P（P）<0.01).

EGFR信号通路与β-catenin通路的关系

大肠癌的发生是一个复杂的过程，涉及多种信号通路的解除调控(Kinzler和Vogelstein，1996年;木材等。，2007). 除COX-2外，其他介质还包括p53抑癌因子、APC/β-catenin信号、K-Ras癌基因、EGFR酪氨酸激酶等₂在POX诱导的细胞凋亡中起作用。事实上，越来越多的研究表明，COX-2、β-catenin和EGFR之间的相互作用对结直肠癌的发生至关重要，所有这些或特定的组合都可以作为治疗干预的目标(卡斯特隆等。，2005;丹嫩贝格等。，2005;线路接口单元等。，2006年a). 因此，我们进一步研究了这些途径。我们发现，通过去除DOX诱导POX后，EGFR的磷酸化（活性）降低(图3a). 腺病毒载体引入MnSOD后，这种减少部分恢复，表明ROS/超氧化物的作用(图3b). 为了进一步确定EGFR信号在POX诱导的凋亡和生长抑制中的重要性，我们用EGF处理POX表达细胞。虽然我们没有观察到凋亡诱导或生长抑制的逆转（数据未显示），但我们发现EGF治疗部分阻断了POX降低COX-2的作用，表明EGF和COX-2之间的联系(图3c). 对于APC/β-catenin途径，我们测定了糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）和β-catening的磷酸化状态，发现POX降低了GSK-3的磷酸化，增加了β-catentin的丝氨酸磷酸化(图4a和​和c），c（c）)均表明APC/β-catenin途径活性降低。MnSOD腺病毒感染后，这两种变化都部分逆转，表明ROS/超氧化物的关键作用(图4b和​和d）。d日). 为了确定POX在启动子水平上对该通路的影响，我们使用TOPflash和FOPflash进行了荧光素酶分析，发现POX也降低了TCF/LEF启动子活性(图4e).

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图3

表皮生长因子受体（EGFR）信号传导的参与。DLD-1 Tet-Off脯氨酸氧化酶（POX）细胞在不含强力霉素（DOX）的培养基中培养0、1和3天。收集细胞并制备细胞裂解物，对磷酸化的EGFR和EGFR进行western印迹(一). 用Ad锰超氧化物歧化酶（MnSOD）或Ad-vector感染细胞，1天后，从培养基中去除DOX 3天。然后收集细胞，制备细胞裂解物，并对EGFR及其磷酸化形式进行western印迹(b条). (c（c）)为了确定EGF对POX-reduced cyclooxygenase-2（COX-2）表达的影响，从培养基中去除DOX 3天，用浓度为10和100 ng/ml的EGF处理细胞。然后收集细胞，制备细胞裂解物，并进行COX-2的western印迹。肌动蛋白的western印迹用作负荷控制。

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图4

大肠腺瘤性息肉病（APC）/β-catenin通路的参与。DLD-1 Tet-Off脯氨酸氧化酶（POX）细胞在无DOX培养基中培养0、1和3天。收集细胞，制备细胞裂解物，并进行糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）、磷酸化GSK-3α和β-连环蛋白、磷酸化β-连环素的western印迹(一和c（c）). 为了确定活性氧（ROS）/超氧化物对该信号传导的影响，用MnSOD重组腺病毒（Ad-MnSOD）或腺病毒载体感染细胞作为对照。一天后，从培养基中去除强力霉素（DOX）3天。然后收集细胞，制备细胞裂解物，并对GSK-3β和β-连环蛋白及其磷酸化形式进行western blotting(b条和d日). 为了确定POX对β-catenin/TCF/LEF反式激活活性的影响，分别将TOPflash和FOPflash构建物转染到DLD-1-Tet-Off POX细胞。一天后，DOX从培养基中取出1或3天。然后采集细胞并进行荧光素酶分析。星号表示统计上的显著差异(e（电子）) (*P（P）<0.05).

POX在人结直肠癌组织中的表达减少

POX抑制了结直肠癌的生长在体外细胞培养模型和体内异种小鼠模型（已提交手稿）。它通过调节对结肠直肠癌发生至关重要的多种途径诱导凋亡细胞死亡。这些观察结果表明POX可能起到抑癌作用。为了将这一想法推广到临床癌症，我们利用人体组织样本，对POX进行免疫染色，以确定其表达，并将同一个体的癌组织与正常组织进行比较。我们发现，在24对结直肠组织中的20对中，与同一患者的正常组织相比，癌组织中POX的表达显著降低，而三例没有变化，只有一例增加(图5). 统计分析表明差异显著(P（P）<0.001;表1). 数据强烈表明POX在人类结肠组织中具有抑癌作用。

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图5

脯氨酸氧化酶（POX）在人类大肠肿瘤组织中的表达降低。用免疫组织化学方法对24对结直肠腺癌/正常组织的人组织阵列载玻片进行POX表达染色。显示了具有代表性的图像。(一)上部（方框1）为低分化腺癌组织，而下部（方框2）为正常组织。(b条)显示同一患者另一对正常/癌组织的POX免疫染色（40×和200×）。

表1

结肠直肠组织中POX的表达（癌症与正常）

对	24
向下	20
没有变化	三
向上	1
P（P）-价值	<0.001

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缩写：POX，脯氨酸氧化酶。

Z轴-使用了检验（比例下降的零假设等于50%）。POX在人类大肠肿瘤组织中的表达降低。对来自同一患者的24对人类结直肠癌/正常组织进行POX表达的免疫染色。表达分为以下五个级别：0、+、++、+++和++++。然后比较同一患者的肿瘤和正常组织，并确定至少一个水平的变化（上调、无变化或下调）。使用Z轴-测试。比例下降的零假设等于50%。

讨论

一些证据表明POX起到了抑癌作用。是p53诱导凋亡中的p53下游基因；它通过激活内源性和外源性途径以及通过调节多种信号通路诱导凋亡，包括MEK/ERK和活化T细胞的钙调素/核因子。此外，它抑制各种培养肿瘤细胞的生长，并抑制异种移植模型中的肿瘤形成（提交的手稿）。我们现在已经进一步证明POX靶向COX-2抑制结直肠癌，并调节EGFR和β-catenin/Wnt信号。重要的是，与正常组织相比，癌组织中POX的表达降低。虽然我们在确定人类肿瘤组中的遗传或表观遗传变化方面的努力尚未得出结论性结果，但遗传来源的文献表明，POX基因所在的染色体22q11.2中存在一些肿瘤抑制因子。染色体22q11是人类癌症中常见的断点，经常发生缺失或易位。Di-George/22q11缺失综合征患者发生恶性肿瘤的频率远高于对照组(麦当劳麦金纳等。，2006). 从这个染色体位点克隆了两个抑癌基因，并提出了另一种抑癌基因的存在(塞弗内等。，1999;黄等。，2002).

不受调控的COX-2表达是大肠肿瘤发生的重要早期步骤。因此，它是癌症化学预防和治疗的一个非常重要的靶点。COX-2特异性抑制剂已被批准用于预防家族性腺瘤性息肉病患者结直肠息肉的形成。出乎意料的是，长期使用高剂量的这些抑制剂会增加患者的血栓事件，因此被自愿退出市场。因此，迫切需要寻找新的COX-2抑制剂。

在癌前组织和恶性组织中，COX-2的含量普遍增加。COX-2的过度表达是由于转录和转录后控制的失调。生长因子、致癌基因、细胞因子和肿瘤促进剂通过蛋白激酶C和Ras介导的信号传导刺激COX-2转录。根据细胞类型和刺激，不同的转录因子包括AP-1、NF-IL6、核因子-κB、活化T细胞核因子和PEA3可以激活COX-2转录(狄克逊等。，2000;Dixon，2004年). 虽然COX-2可以被许多因素上调，但对负效应物的了解却少得多。野生型，但不是突变型p53，可以抑制COX-2的转录体外试验。APC抑癌基因状态也可能影响COX-2的表达(Gupta和Dubois，2001年). 这些发现表明，癌基因和抑癌基因之间的平衡调节了COX-2在肿瘤中的表达。在这里，我们发现候选肿瘤抑制因子POX也抑制COX-2的表达和活性，这表明它通过靶向多种信号来执行其肿瘤抑制作用，从而与许多其他重要肿瘤抑制因子的作用类似。

毫不奇怪，POX也抑制EGFR和β-catenin信号。当然，POX可能会单独瞄准和阻止每个人。另一个考虑因素是这些信号与COX-2之间的串扰。这些相互作用对结直肠癌的发生至关重要，是开发新的联合癌症治疗方法的重点。首先，COX-2/PGE2通过G蛋白偶联受体和许多常用的信号级联诱导典型APC/β-catenin/Wnt和EGFR信号通路的反式激活(丹纳伯格等。，2005). 相反，β-catenin作用于TCF/LEF转录因子以调节COX-2的表达(Gupta和Dubois，2001年;荒木经惟等。，2003). 通过EGFR诱导COX-2的信号途径因细胞类型和诱导物而异，但ras/raf/MAPK信号途径有助于增加转录和转录后控制(丹纳伯格等。，2005). 这与我们之前的发现一致，即POX下调MEK/ERK信号(线路接口单元等。，2006年b). 实际上，PGE之间的直接合作效应₂EGFR对肿瘤细胞增殖和侵袭的作用也有很好的记录(布坎南等。，2003;邵等。，2004,2005).

ROS/超氧化物在POX调节信号通路、诱导细胞凋亡和抑制生长中的关键作用以前已有报道(线路接口单元等。，2005,2006年b). 人们认为氧化还原状态调节许多信号通路，包括那些涉及COX-2、EGFR和β-连环蛋白的通路(陈等。，2005;基姆等。，2005;科尔斯瓦根，2006年). MnSOD部分逆转POX降低这些分子/信号的表达/活性；进一步表明超氧化物对于减少这些信号至关重要。现在，我们有越来越多的数据表明ROS/超氧化物在调节POX效应中的重要性。他们是否是POX活动的唯一调解人仍是一个悬而未决的问题。P5C是POX活性的产物，与重要的细胞过程有许多联系，也必须予以考虑。鉴于脯氨酸循环和TCA循环之间的密切联系以及POX活性对TCA循环及其中间产物的潜在影响，以及TCA循环对许多细胞活动的重要性，POX诱导的TCA循环，特别是其中间产物的变化是另一个考虑因素。

细胞外基质及其与细胞的相互作用在细胞信号转导和癌症研究中受到了广泛关注，肿瘤微环境已被认为是癌症化学预防的重要靶点(阿尔比尼和斯波恩，2007年). 脯氨酸是POX的底物，主要通过基质金属蛋白酶和脯氨酸酶从胶原蛋白等消化后的细胞外基质中获得。最近，我们发现脯氨酸酶催化胶原蛋白降解的最后一步产生脯氨酸，刺激低氧诱导因子信号传导，在血管生成和肿瘤进展中具有潜在作用(苏拉钦斯基等。，2008). 因此，POX也可以被视为癌症预防研究的目标。实际上，第一份表明COX-2在结肠息肉形成中具有重要作用的报告指出，COX-2表达于息肉的基质细胞，而不是息肉的上皮细胞(大岛等。，1996).

不同的原癌基因作为细胞代谢和肿瘤抑制因子的输入，作为负调控因子的特征揭示了代谢和癌症之间的密切联系(梅里达和阿维拉·弗洛雷斯，2006年). 由于POX与许多重要的细胞代谢过程密切相关，因此也可以被视为癌症预防的代谢靶点。胶原蛋白降解产生的脯氨酸释放主要发生在应激情况下，即营养/代谢应激和伴随癌症进展和侵袭的炎症应激。相反，脯氨酸降解可能在生物能量上支持许多对氧化代谢很重要的必要功能。例如，P5C和脯氨酸的循环可以将糖酵解或磷酸戊糖分流产生的还原电位转移到活性氧或三磷酸腺苷中(哈格多恩和彭，1986年). P5C刺激戊糖磷酸分流的氧化臂，并相应地增加嘌呤核糖核苷酸的合成(Yeh和Phang，1988年). 因此，脯氨酸代谢可以参与存活或程序性细胞死亡。目前针对癌症的靶向治疗主要涉及特异性阻断促进肿瘤细胞增殖、阻止细胞死亡、阻碍细胞分化或促进血管生成的分子信号。然而，细胞信号转导的分子途径是多方面的，通常是多余的。另一种方法可能是靶向肿瘤代谢，因为大多数肿瘤表现出的一个独特特性是能量代谢异常。癌细胞已获得突变，使其对限制性刺激不太敏感，也不太依赖生长刺激，但它们可能容易受到代谢压力的影响。因此，POX可能是调节代谢目标和COX-2的有用工具。

我们将继续我们目前的研究，试图发现人类癌症中POX基因的遗传和表观遗传变异，这可能为POX促进肿瘤发展的机制提供新的见解。同时，我们将确定高POX活性的代谢后果，例如，测试其对TCA循环及其中间产物的影响。作为p53诱导氧化应激的主要介质(Bensaad和Vousden，2007年)由于其与细胞外基质、代谢、COX-2和其他信号的特殊联系，POX可能发挥比先前预期更广泛的作用，这使其成为结直肠癌以及其他类型癌症的一个有希望的新治疗靶点，特别是在联合治疗中。

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