布尼亚病毒进入哺乳动物细胞

UUKV的标记³⁵S-氨基酸或荧光染料

为了量化和可视化UUKV进入的早期阶段，我们使用纯化的病毒，用荧光探针进行化学标记，或用放射标记[³⁵S] 细胞培养液中的半胱氨酸和蛋氨酸。为了使病毒荧光，我们利用了糖蛋白G中暴露的游离半胱氨酸的存在_N个和G_C类我们将硫代硫酸盐活化荧光染料（TS-link Body-TR）（UUKV-RED）偶联到其上。荧光和放射性标记粒子的特性如所示图S2标记的UUKV制剂纯度大于90%。在放射性病毒中³⁵N、G中存在S标签_N个、和G_C类，而G_N个和G_C类是UUKV-RED制剂中唯一的荧光标记蛋白(图S2A和S2B）。核蛋白N没有荧光，这表明病毒包膜是完整的。共聚焦荧光显微镜观察到不同标记的颗粒为单点，阴性染色后电镜观察到颗粒为132nm(图S2C–S2E）。我们注意到标签对UUKV感染性没有显著影响；滴度与未标记颗粒的滴度相似(图S2F） ●●●●。

UUKV细胞结合具有特异性但效率低下

要分析与单元格的绑定，请增加³⁵S-标记的UUKV首先被允许在冰上与细胞结合2小时（moi为0.6-50）。将未结合的病毒冲走，并通过闪烁计数测定剩余的细胞相关放射性。结果表明，随着输入UUKV浓度的增加，结合增强(图1A） 但在所有三种细胞系中，与细胞相关的比例为7%–9%(图1B） ●●●●。当结合实验的上清液添加到新细胞中时，放射性结合的比例相似，表明未结合的病毒完全能够与细胞结合(图1C） ●●●●。这表明UUKV与宿主细胞的结合效率低下。

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图1

UUKV与细胞结合无效

（A） 连续稀释³⁵将S标记的UUKV与细胞结合，并使用闪烁计数器对样品进行定量。误差条指示SD。

（B） 显示与（A）中相同的数据，但表示为与细胞结合的输入病毒的百分比（100×结合粒子[cpm]/输入粒子[cpm]）。误差条指示SD。

（C） 将之前的结合实验的上清液添加到新细胞中。该程序重复了三次。数据表示为（B）。误差条指示SD。

（D） 不同数量的UUKV-RED与细胞结合，并通过流式细胞仪分析样本。

（E） 显示了未标记粒子和荧光粒子之间的结合竞争。根据病毒糖蛋白的浓度对病毒输入进行标准化。用不同数量的未标记颗粒（UUKV或VSV）预培养细胞，然后按（D）所述暴露于UUKV-RED（2.5 nM）。误差条指示SD。

（F） UUKV-RED与冰上的细胞结合，并用共焦显微镜分析样品。白点是一系列z堆叠合并成一个平面的细胞相关病毒颗粒。

FACS分析允许检测从moi 0.1以上结合的UUKV-RED(图1D） ●●●●。UUKV-RED的结合被未标记UUKV的预结合以剂量依赖性的方式消除(图1E） ●●●●。未标记颗粒浓度增加50倍，UUKV-RED结合减少一半，浓度增加200倍，减少10%。水疱性口炎病毒（VSV）的预结合不影响UUKV-RED的结合(图1E） ●●●●。综上所述，这些实验表明，UUKV与细胞的结合效率很低，但结合很可能涉及一个或多个特定的附着因子或受体。

在4°C下，UUKV-RED与A549结合后，通过共焦显微镜可以在细胞表面看到单个病毒颗粒(图1F） 。当感染倍数（moi）仅为0.2时，每个细胞的斑点数超过100个，这表明感染性微粒和非感染性微粒的比率很低。

薄片电镜显示，与A549细胞表面结合的UUKV以单个颗粒的形式出现，病毒与质膜之间的距离为11.4±2.8 nm（n=30）(图2A） ●●●●。在缺乏可见细胞质外套的浅质膜凹痕中可以看到一些(图2A、 白色箭头）。大约一半与丝状伪足相关或位于其底部（分析的96个颗粒中有47个）。

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图2

UUKV与丝足类结合

（A） UUKV的EM与质膜相关。将细胞暴露于病毒并进行薄片分析。一些膜结合病毒与内陷有关（白色箭头）。

（B） UUKV-RED（moi～1）与表达PH-PLCΔ1EGFP的细胞结合，并通过共焦显微镜分析样品。图片显示UUKV-RED与丝虫的关联。

对在质膜上表达荧光蛋白标记物（PH-PLCΔ1与增强型绿色荧光蛋白[EGFP]结合）的细胞进行荧光显微镜观察，证实了UUKV-RED与丝状足类的关联(图2B） ●●●●。注意，A549和BSC40细胞中的丝状伪足在长度和形状上不同。

UUKV内化主要与氯氰菊酯无关

为了通过荧光显微镜分析UUKV内化，我们首先让UUKV-RED以相对较高的moi（～7.5）在冰上与BSC40细胞结合，然后在氯化铵（NH）存在下加热细胞₄Cl）以防止渗透。40分钟后，将细胞放回冰上，以阻止进一步的内吞作用。为了区分内化颗粒和表面结合颗粒，用三（2-羧乙基）膦（TCEP）在冰上处理细胞30分钟。由于TCEP是一种不透膜的还原剂，它只能去除仍暴露在质膜上的UUKV-RED中的染料。在升温前用TCEP处理的样品中，我们几乎没有观察到背景荧光(图3A[4°C，+TCEP]），而在升温后，内化病毒可被视为细胞内不同强度的荧光点(图3A[37°C，+TCEP]）。我们估计，25%的细胞结合颗粒在40分钟内被内吞。

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图3

UUKV进入主要与氯菊酯无关

（A） UUKV-RED（moi～7.5）与细胞结合，然后样品在NH存在下移动到37°C₄Cl（50 mM）40分钟，以便内化。随后用TCEP（一种膜不透性还原剂）处理细胞，以区分内部颗粒和外部颗粒，并用宽视野显微镜进行分析。

（B） 内部化时间进程³⁵S-标记UUKV（moi～3）。胰蛋白酶处理无法去除的部分被视为背景，并从其他值中减去。误差条指示SD。

（C） 细胞在冰上暴露于UUKV，随后迅速加热至37°C，以使其内部化。使用EM，病毒很少出现在CCP和CCV中，但通常出现在未涂层的小泡中（EE#1）。UUKV也见于较大的内体结构（EE#2和#3）。这些液泡有时与细胞溶质表面的电子致密结构有关（EE#3，白色箭头）。在后期，病毒通常在MVE和可能对应于LE或自噬囊泡的结构中发现。

（D） western blotting检测CHC敲除效率。CHC蛋白水平表示为用CHC siRNA（siCHC_1和_2）处理的细胞中CHC水平的百分比，标准化为用阴性对照siRNA处理的对照细胞中的β-actin和CHC水平。

（E） 用CHC-siRNAs处理的细胞被UUKV或SFV感染。这些值被归一化为用阴性对照siRNA（siCtrl）处理的样本中的细胞数量和感染水平。NI和INF分别用于非感染细胞和感染细胞。误差条指示SD。

为了确定摄取动力学，使用了更定量的分析。细胞在冰上培养³⁵S标记颗粒。清洗后，用冰上胰蛋白酶处理细胞，以去除表面结合的病毒。在低温条件下结合后，90%以上的细胞相关放射性被此程序去除(图S3). 相比之下，如果在胰蛋白酶处理之前将细胞加热到37°C 20分钟，大约三分之一的³⁵胰蛋白酶无法接触到S标记颗粒(图S3). 当随着时间的推移分析胰蛋白酶抗性病毒的产生时，发现内化的最大水平已经在10分钟内达到(图3B） ●●●●。考虑到背景，我们可以确认25%的细胞结合颗粒被迅速内吞。

为了使用EM评估细胞内吞，将细胞暴露在高moi的冰上病毒中，并迅速转移到37°C以允许内吞。2分钟后，在通常位于质膜附近的直径约为150nm的光滑小泡中观察到病毒(图3C、 EE#1）。在极少数情况下，病毒可与氯氰菊酯包被的凹坑（CCPs）和囊泡（CCVs）相关(图3C） ●●●●。10分钟后，在直径400–500 nm的经典内胚空泡中观察到UUKV(图3C、 EE#2和#3）。其中一些在细胞溶质表面（EE#3）具有电子致密结构，其特征是含有氯氰菊酯的蛋白质簇和转运（ESCRT）复合物所需的内体分选复合物，是典型的早期内体（EE）(Sachse等人。，2002). 30分钟后，病毒通常出现在多泡内体（MVE）和可能代表晚期内体（LE）的液泡中(图3C、 MVE和LE）。未观察到病毒与限制膜或腔内小泡的融合。

为了进一步解决CME在感染中的潜在参与，我们在平行实验中使用两种不同的、非重叠的小干扰RNA（siRNAs）耗尽了克拉通重链（CHC）的A549细胞。通过western blotting检测，每种siRNA使培养物中CHC蛋白水平降低85%–95%(图3D） ●●●●。CHC-siRNA-处理的细胞仍能有效感染UUKV。与转染对照siRNA的对照细胞相比，两种CHC siRNA的感染率仅下降35%(图3E） ●●●●。作为评估CHC击倒有效性的对照，我们使用了Semliki Forest病毒（SFV），它只使用氯菊酯途径(Doxsey等人。，1987). 与UUKV相比，SFV感染在这些细胞中受到强烈抑制，与对照组相比减少了75%-80%(图3E） ●●●●。综上所述，结果表明，尽管在CCP和CCV中可以看到一些病毒颗粒，但大多数病毒颗粒是由不涉及网格蛋白外壳的机制内吞的。

UUKV进入EE和LE

EM研究表明，内化的病毒被转运到内体。为了更好地确定该病毒的内吞途径，我们接下来确定病毒是否达到EE。将冰上的UUKV-RED（moi～10）与表达带有EGFP标记的EE标记物Rab5a（EGFP-Rab5a）的A549细胞结合后，温度迅速移到37°C，持续30分钟。共聚焦显微镜显示UUKV与EGFP-Rab5a在加温后5分钟在细胞质囊泡中共定位（数据未显示）。共定位病毒的数量在升温后10分钟达到最大值，此后减少，直到30分钟后不再检测到为止(图4A和4B）。在活的BSC40细胞中，旋转圆盘共焦显微镜显示，UUKV-RED实际上随EGFP-Rab5a阳性小泡在细胞质中移动(电影S1).

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图4

UUKV通过Rab5a-阳性EE进入内吞机制

（A–D）通过共焦显微镜将预结合UUKV-RED（moi～10）进入表达EGFP-Rab5a（A和B）或EGFP-Rab 5a Q79L（C和D）的细胞。病毒在37°C下内化10分钟（A和C）或30分钟（B和D）。显示了一个焦平面。UUKV显示为红色，EE包含EGFP-Rab5a或Q79L显示为绿色。UUKV和Rab5a阳性囊泡（白色数字和正方形）之间的关联放大倍数较高，显示在右侧边界上，以z叠加序列表示。黄色数字表示堆栈在序列中的位置，与标记为0的原始平面相比。白色和黄色箭头分别表示非局域化和共局域化的内部化粒子。黄色虚线划出质膜。

（E） EGFP-Rab5a-WT、S34N和Q79L在细胞中瞬时表达。这些细胞随后感染了UUKV，感染率为2。使用FACS，根据EGFP信号的强度范围，在每个样本感染后7小时内选择一组细胞。从该群体中，对感染进行量化并将其标准化为表达EGFP的细胞。误差条指示SD。

（F） EGFP-Rab5a WT、S34N和Q79L表达对SFV和甲型流感病毒感染的影响。按照（E）所述进行量化。误差条指示SD。

（G） 用沃特曼预处理细胞并感染UUKV。将数据归一化为忽略抑制剂的样品。误差条指示SD。

也观察到UUKV的结球化，空泡中含有LE和溶酶体标记物Rab7a和LAMP-1（EGFP-Rab7a和EGFP-LAMP-1），但时间较晚。暖化后20–30分钟，活细胞中的大肠杆菌化和与EGFP-Rab7a的协同运动发生(图7A和电影S2). EGFP-LAMP-1的结肠化作用在30到40分钟之间最大(图7B） ，并观察到协调运动(电影S3). 此时，大多数内化颗粒与EGFP-LAMP-1阳性囊泡相关。请注意，一些颗粒位于小泡的中间，表明病毒尚未与限制膜融合(图7B） ●●●●。

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图7

UUKV进入晚期内膜细胞

（A和B）通过共焦显微镜将预结合UUKV-RED（moi～10）进入表达EGFP-Rab7a（A）或EGFP-LAMP-1（B）的细胞。病毒在37°C下内化20分钟（A）或30分钟（B）。显示了一个焦平面。UUKV为红色，LE为绿色，含有EGFP-Rab7a或EGFP-LAMP-1。UUKV与Rab7a或LAMP-1阳性囊泡（白色数字和正方形）之间关联的放大倍数较高，显示在右边界上，为z叠加序列。黄色数字表示堆栈在序列中与标记为0的原始平面相比的位置。黄色箭头显示同位化粒子。

（C和D）EGFP-Rab7a WT、T22N和Q67L表达对UUKV和甲型流感病毒感染的影响。按照中所述进行感染和量化图4E.误差条表示SD。

（E） 细胞在冰上用秋水仙素（10μM）处理3小时，然后用抗α-微管蛋白抗体染色并用共焦显微镜分析。

（F和G）细胞用秋水仙素或MG132预处理，然后感染UUKV或甲型流感病毒。将数据归一化为忽略抑制剂的样品。误差条指示SD。

通过EE和传染性

为了确定感染性是否需要通过内体隔室，我们首先评估了UUKV在表达Rab5a组成活性突变体（EGFP-Rab5a Q79L）的细胞中的内化和感染。如图所示，该突变体的表达导致EE增大图4C和4D(Stenmark等人。，1994). LE的成熟和货物运输到溶酶体受到损害(Hirota等人。，2007,罗森菲尔德等人。，2001). 在表达EGFP-Rab5a Q79L的A549和BSC40细胞中，我们发现与仅表达EGFP-Rab5a野生型或EGFP的细胞相比，UUKV感染减少了50%-70%(图4E） ●●●●。与EGFP-Rab5a相比，与EGFP_Rab5a Q79L阳性囊泡共定位的病毒数量即使在30分钟后也显著增加(图4C和4D）。此时，几乎所有内化颗粒都与巨大的EE相关，这与向LE和溶酶体的转运受阻相一致。

沃特曼是磷脂酰肌醇（PI）3-激酶（Rab5a的一个重要效应物）的抑制剂，已被证明可以诱导类似的、扩大的早期内吞囊泡的形成(Houle和Marceau，2003年). 当细胞用沃特曼预处理时，感染也被有效抑制(图4G） ●●●●。

Rab5a显性活性突变体（EGFP-Rab5a S34N）的表达，它取消了新形成EE的成熟(Stenmark等人。，1994)也导致两种细胞系的感染率大幅下降（80%-90%）(图4E） ●●●●。对另一种晚穿透病毒甲型流感病毒也观察到类似的结果(图4F） ●●●●。有趣的是，Rab5a S34N而不是Rab5aQ79L减少了SFV感染，这表明pH6.0到6.2之间的融合阈值的病毒可以融合在巨大的Rab5a-Q79L阳性EE中，而UUKV和流感a病毒不能融合(图4E和4F）。总之，这些结果表明，感染进入途径包括通过Rab5a阳性内体，但生产性感染也需要运输到下游细胞器。

UUKV感染进入的低pH依赖性

为了测试内体液泡中的酸性pH值在UUKV感染中是否重要，将病毒添加到细胞中，并加入中和液泡pH值的试剂。溶酶体弱碱NH₄氯和氯喹在所有三种细胞系中均诱导了对UUKV感染的剂量依赖性抑制(图S4A） ●●●●。在这些实验中，我们确保培养基中的pH值不会降至pH～7.0以下，以确保药物的有效性(Mercer等人。，2010).

液泡型H的两种抑制剂⁺-ATP酶（vATP酶）、巴非霉素A1和刀豆霉素B的结果相似(图S4B） ●●●●。药物溶于乙醇或甲醇中，与二甲基亚砜不同，乙醇或甲醇对感染没有不良影响(图S5). 我们使用四种不同的siRNA来耗尽这些质子泵的V1亚单位A（vATPV1A），从而证实了vATPase的参与。经western blotting检测，vATPV1A蛋白水平降低了85%–95%(图S4C） ●●●●。沉默导致了对UUKV感染的强烈抑制（从75%到95%）(图S4D） ●●●●。总之，这些结果表明，UUKV感染依赖于液泡酸化。

低pH值是UUKV融合的充分必要条件

为了确定酸诱导步骤是否涉及膜融合，我们评估了UUKV介导细胞-细胞融合（“融合-无融合”）的能力，正如之前对其他包膜病毒所描述的那样(怀特等人。，1981). 简单地说，大量病毒在低温下与汇合的BHK-21细胞结合，并使用不同pH值的缓冲液对细胞进行加热。当缓冲液的pH值为5.4或更低时，观察到有五个或更多核的融合体的形成(图5A） ●●●●。

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图5

UUKV膜融合的pH阈值为5.4

（A） 将汇合的单层细胞暴露在冰上的UUKV（moi～1000）中，然后在37°C下用指定pH值的缓冲液处理5分钟。加热3小时后，分别用双苯甲酰亚胺和CellMask深红色对细胞核和细胞质进行染色。

（B） 显示（A）中获得的数据的量化。融合指数如下所示如果= (1 − [c（c）/n个])，其中c（c）是融合后字段中的细胞数n个核的数量。误差条指示SD。

（C） 将细胞汇合单层暴露于冰上的UUKV（moi～5–30）中，在37℃下用不同pH值处理1.5分钟，然后在37℃和NH存在下培养18小时₄Cl（50 mM）阻止内吞小泡进一步渗透。感染由FACS测定。误差条指示SD。

（D） 显示使用（C）中描述的协议，UUKV-RED（moi～2）与质膜在一个共焦平面内融合。角部（白色方块）显示了较高放大倍数的质膜。

融合指数表示每个原始单核细胞融合事件的平均数，用以确定细胞间融合的程度(图5B）(怀特等人。，1981). 当显微镜视野中的所有细胞核都位于单个细胞中时，该指数达到1；当所有细胞都有一个细胞核时，该值为0。pH～5.2及以下时，BHK-21细胞的融合指数达到0.4(图5B） ●●●●。

为了更准确地定义pH值阈值并将融合与感染联系起来，我们评估了UUKV与细胞质膜融合的能力，从而绕过了生产性感染期间内吞作用的需要，正如前面对SFV的描述一样(Helenius等人。，1980). 简单地说，UUKV被允许与冰上的细胞结合，在具有不同pH值和NH的缓冲液中，温度迅速移动到37°C，持续1.5分钟₄在剩余感染期添加中性pH的含氯培养基，以防止通过内体感染。确认NH的添加₄低H处理细胞后，Cl通过内吞病毒防止感染，细胞首先在pH～4.5下处理，然后在NH存在下暴露于UUKV₄Cl.低pH处理的细胞与模拟处理的细胞一样有效地被感染，并且NH₄Cl在两种条件下都能完全抑制感染(图S6).

如所示图5C、 旁路手术导致了有效的感染。与病毒结合量相同的正常感染相比，感染水平实际上增加了一倍（数据未显示）。原因可能是病毒的内吞无效。有趣的是，在使用旁路方案时，通常未感染的raji细胞被感染。当moi为10时，70%的raji细胞可以通过将病毒与质膜融合而感染。在A549和BSC40细胞中，旁路的pH值为5.8及以下，而在BHK-21细胞中，所需的pH值略低。在所有细胞系中，pH～5.4时达到50%的最大感染(图5C） ●●●●。

结果表明，pH值的降低足以触发病毒RNP通过质膜融合和感染性渗透到胞浆中。显然，激活融合或感染该病毒不需要在内胚体隔室中进行额外的处理步骤。旁路涉及病毒膜的融合，荧光标记糖蛋白G的扩散显示了质膜_N个和G_C类酸化后进入BHK-21细胞的质膜(图5D） ●●●●。相反，在中性pH条件下，荧光糖蛋白在细胞表面保持焦点。观察到与质膜结合的高密度病毒是由于使用了相对较高的moi（～2）。

结合和内化分析

如前所述，病毒与细胞结合是在冰上进行的(Johannsdottir等人。，2009). 为了与未标记病毒颗粒竞争，在添加UUKV-RED之前，用不同浓度的未标记颗粒在4°C下预培养细胞30分钟。为了内化，病毒结合细胞在固定前快速转移至37°C达40分钟。³⁵如前所述，进行S标记的UUKV内化(马什和海伦尼乌斯，1980年).

电子显微镜

如前所述，在pH～7.4的条件下，用磷钨酸对含有UUKV-RED的样品进行阴性染色(冯·邦斯多夫和佩特森，1975年). 对于薄片EM，暴露于病毒（moi～100）后，细胞被固定并按前述方法处理(Johannsdottir等人。，2009).

荧光显微镜

对于共聚焦显微镜，细胞在暴露于UUKV-RED之前被转染，然后用蔡司LSM510 Meta显微镜或旋转圆盘Visitech显微镜进行分析。对于活细胞成像，在存在病毒的情况下进行分析。对于基于TCEP的内化测定，用蔡司Axiovert显微镜监测UUKV-RED的摄取。为了区分内部颗粒和外部颗粒，使用50 mM TCEP（Pierce，补充50 mM Tris-HCl[pH～8.0]、125 mM NaCl、50 mM HEPES和1 mM MgCl）对样品进行三次处理₂)固定前，在4°C下保持10分钟。

UUKV感染检测

细胞在37°C下暴露于UUKV（moi从1到10）1小时。随后用培养基替换病毒上清液，并将细胞在37°C下培养指定时间（最多18小时）。对于所有感染实验，感染细胞通过流式细胞仪进行定量，如图S1B和之前描述的(Quirin等人。，2008). 对于抑制试验，细胞在37°C下用药物预处理30分钟（除秋水仙素外，在冰上3小时），然后在药物存在下暴露于UUKV（moi～2）1小时。随后将UUKV暴露的细胞在37°C的培养基中培养6小时，并补充药物。在我们未观察到对细胞活力有任何影响的浓度下使用药物。对于基于siRNA的感染检测，在感染前1小时清洗转染细胞。对于基于EGFP-Rabs的感染检测，转染细胞并在6小时后清洗。转染细胞在转染后18小时暴露于病毒。

细胞-细胞和血浆膜病毒融合检测

如前所述，进行细胞-细胞和质膜-病毒融合分析(Helenius等人。，1980,怀特等人。，1981). 为了使荧光粒子在质膜（moi～2）处融合，在低pH处理后，将病毒结合细胞固定在中性pH条件下，然后如上所述通过共焦显微镜进行分析。

天然气₄Cl添加时间进程

病毒结合（moi～1）在冰上同步。病毒结合细胞迅速加热至37°C，NH₄在指定时间（最多80分钟）添加Cl（50 mM）。随后将细胞在37°C下孵育，并在温移后7小时收获。

温度相关性

病毒结合（moi～1）在冰上同步。病毒结合细胞在水浴中在指定温度下培养1小时，NH₄然后添加Cl（50 mM）以阻止进一步渗透。随后将细胞移到37°C，并在升温6小时后收获。

这项工作得到了瑞士国家研究基金会（Swiss National Research Foundation）、欧洲研究委员会（ERC）高级研究员拨款苏黎世联邦理工学院（ETH Zurich）以及玛丽·居里（Marie Curie）在第七届欧洲共同体框架计划（7th European Community Framework Programme）内为P.-Y.L.提供的欧洲内部研究金的支持。我们感谢F.Rey和J.Huiskonen对手稿的批判性阅读，感谢L.Burleigh和A.Smith对本文的校对。我们还感谢苏黎世理工大学光学显微镜中心（LMC）的J.Kusch提供的帮助，以及J.Mercer提供的有益讨论。