中性氨基酸转运蛋白B的作用⁰AT1（SLC6A19）在Hartnup障碍和蛋白质营养中的作用

摘要

HARTNUP疾病、生理和临床方面

Hartnup障碍（OMIM 234500）是一种常染色体隐性疾病，在欧洲人群中发生频率约为1:30000(1,2). 1956年，Baron等人首次描述了这种紊乱(三)该出版物的标题以最简洁的方式描述了该疾病的主要临床特征：“遗传性薄膜样皮疹伴暂时性小脑共济失调、持续性肾氨基酸尿和其他奇怪的生化特征。”Hartnup障碍的名字来源于第一个描述的病例Eddie Hartnup（Eddie H.在原始出版物中）。

尽管Eddie Hartnup的病例中记录了这些临床症状，但这些天来大多数病例都是无症状的。例如，在最近描述的澳大利亚家庭中，除了婴儿期的皮疹或腹泻外，没有其他临床症状报告(2,4,5). 在Scriver等人描述的几个案例中(6)Hartnup障碍患者的身高和体重往往低于其兄弟姐妹，但大多数患者没有临床症状。然而，中国和日本报告了两例具有所有“典型”症状的病例(7,8). 此外，土耳其最近的一例病例报告了肝肠杆菌肢端皮炎，这是一种更严重的皮肤损伤类型(9). 中国患者入院时的临床症状描述如下：“三个月前，她感到膝盖以下麻木、寒冷和疼痛。她不能稳定行走，写字时拿不紧钢笔。入院前20天，出现了更严重的症状，即她的头部、面部和双侧上肢出现间歇性的不自主运动，进一步发展为持续性和侵袭性在情绪低落时加重的肢体运动。她的情绪有点不稳定，情绪低落，经常发脾气。她有光敏性皮炎病史。面部、颈部和手背等暴露在阳光下的部位的皮疹每年夏天都会复发，夏天结束后皮疹就会消失。”(7).

由于其他症状的变异性，肾性氨基酸尿是该疾病的特征，大多数（如果不是所有的话）患者都是通过尿液分析确诊的。一个典型的例子是Cusworth和Dent报道的Eddie Hartnup自己的尿液分析(10)（图。​（图1）。1). 氨基酸尿仅限于中性氨基酸，但谷氨酸含量也经常略有升高。特别相关的是色氨酸含量的增加（图。​图1），1)表明缺乏色氨酸重吸收。氨基酸尿和临床症状是由中性氨基酸的主要肾和肠转运蛋白缺陷引起的，称为B⁰（表示具有广泛特异性的中性氨基酸（0）的转运体；大写表示Na⁺依赖性）(11,12)或中性刷边界（NBB）(13).

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图1

Cusworth和Dent报告的参考受试者和Eddie Hartnup的氨基酸肾脏清除率(10)（经许可修改）。肾清除率为120表示肾小管既没有再吸收也没有排泄的物质。

哈特诺普病的临床症状与糙皮病或烟酸缺乏症非常相似。这种维生素缺乏症的特征是光敏性皮炎。晚期糙皮病伴有抑郁性精神病和腹泻(14). 烟酸由烟酸和烟酰胺组成，这两种化合物具有这种维生素的生物活性。烟酸被用作NAD（P）H生物合成的前体(14). 虽然烟酸被认为是一种维生素，但人体可以从色氨酸合成大量NAD（P）H。皮疹的生化基础尚不清楚，但在哈特努普病中，似乎对补充烟酸有反应，这表明色氨酸的可用性降低是皮疹最可能的原因。此外，据报道，pellagrins皮肤中组氨酸代谢产物urocanic酸的含量减少(14). 该化合物对正常皮肤吸收紫外线很重要，组氨酸转运在Hartnup病中受损（图。​（图1）。1). 在遗传性缺锌引起的肝顶皮病中也观察到尿酸水平降低，如上文所述，在一例Hartnup病中观察到了这种情况。此外，哺乳动物的皮肤含有转化的整个代谢途径我色氨酸到褪黑激素(15). 褪黑素具有多种皮肤保护作用，被认为是皮肤功能和结构的重要调节因子。

共济失调也可能与色氨酸代谢及其转化为血清素（5-羟色胺）有关。血清素作为一种神经递质在调节愤怒、攻击、体温、情绪、睡眠、性欲、食欲和新陈代谢方面发挥着重要作用。虽然B水平较低⁰AT1存在于大脑中，其主要表达部位是肾脏和肠上皮细胞的刷状缘。然而，大脑中的血清素水平与血液中的色氨酸水平相对应，因为K（K） _米色氨酸羟化酶是血清素生物合成的限速步骤，其浓度高于大脑或循环中的色氨酸浓度(14). 因此，色氨酸具有抗抑郁特性，其代谢物5-羟基色氨酸可导致各种形式的小脑共济失调的消退(16). 目前尚不清楚其他神经递质前体氨基酸（如酪氨酸或组氨酸）血浆水平的变化是否会导致神经症状。已经注意到，血浆氨基酸水平低的人更有可能出现临床症状(6).

另外，也有人提出可能涉及色氨酸的有毒细菌降解产物(17). 哈特努普病患者的尿液中发现了色氨酸的细菌降解产物，如吲哚化合物（硫酸吲哚氧基、吲哚乙酸、吲哚乙酸基谷氨酰胺）和其他氨基酸，表明它们被肠道吸收并分布在全身。这些细菌降解产物的出现确实是氨基酸在肠道运输受损的第一个证据(18). 然而，鉴于Hartnup障碍的渐进性病例，吲哚化合物参与共济失调的发病似乎不太可能，在这种情况下，色氨酸的降解产物仍会产生。

HARTNUP基因紊乱是复杂的还是简单的

Hartnup病是一种典型的常染色体隐性遗传病，根据其特征性氨基酸尿判断。然而，临床表型的变异性表明存在可降低疾病外显率的修饰因素。在蛋白质含量丰富的西方饮食国家，症状似乎很少出现，因为肠中的肽吸收由肽转运蛋白PepT1介导(19)‐弥补氨基酸摄入不足。为了支持这一观点，已经证明Hartnup障碍患者的肽摄取没有受到影响(20,21). 在生长过程中，对氨基酸的需求增加，这解释了为什么症状主要发生在儿童身上。在碳水化合物丰富、蛋白质缺乏的地区，如中国农村，可能会出现各种症状。Scriver等人观察到营养作为Hartnup障碍的一种调节因子的可能作用(6)世卫组织注意到，有临床表现的人似乎血浆氨基酸浓度较低。在同一项研究中，通过对一名患有未确诊的Hartnup疾病的儿童进行检查，进一步强调了这一点，在该儿童中，牛奶过敏被怀疑会导致腹泻。饮食改为豆奶导致该儿童出现皮疹并显著减轻体重。令人惊讶的是，大豆蛋白和牛奶蛋白的氨基酸组成相似(22)但Scriver等人的研究并未报告豆奶中的蛋白质浓度。除了环境因素外，还发现了遗传复杂性的证据。例如，Hartnup病的单纯肾脏病例已被描述(6,23)还有一个纯粹的肠道疾病(24). 其他伴有一般性氨基酸尿的疾病是MODY3（年轻人的成熟型糖尿病）(25)、范科尼综合征(26)、糖尿病(27)和怀孕(28). 在其中一些疾病中，现在可以解释氨基酸尿，这表明了氨基酸吸收生理学中有趣的联系。尽管在很大程度上是一种简单的孟德尔障碍，但观察到的Hartnup障碍的复杂性指向了修饰因子，其中一些现已在分子水平上被鉴定。

基因/蛋白质的鉴定

2001年，Nozaki等人(29)报道了一个患有Hartnup障碍的家庭，由于近亲结婚，该家庭可以对与该疾病相关的区域进行纯合子定位。这项研究指出，5号染色体的尖端是与该疾病相关的区域。人类基因组的同时完成，为确定致病基因提供了一种候选方法。对编码具有多个跨膜跨域蛋白质的基因的研究表明，该区域存在两个相关基因(30). 其中一个基因已被鉴定为神经递质转运体SLC6家族的成员，命名为XT2、XTRP2或ROSIT(31,32). 另一个是新颖的，在人类和小鼠基因组的第一稿中注释为“类似于XT2”。这两个基因位于5号染色体上，跨越约50kB的区域。小鼠“类似于XT2”的旁白在非洲爪蟾卵母细胞证明它是中性氨基酸的一般转运蛋白(33). 因此，它被命名为B⁰AT1（B⁰氨基酸转运体）并给出正式的基因名称（SLC6A19）。它有助于Na⁺基质依赖于上坡运输(34,35). 转运蛋白偏好大的脂肪族中性氨基酸。值得注意的是，它运输10种必需氨基酸中的8种，即亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、苏氨酸和组氨酸。大多数氨基酸具有类似的最大转运速率，但K（K） _米差异从1.1 mM（亮氨酸）、约4 mM（丙氨酸、苯丙氨酸）到11 mM（甘氨酸）不等。在肠道，B⁰AT1似乎是色氨酸的主要转运活性，缺乏色氨酸是Hartnup病病理学的关键。与SLC6系列B的其他成员不同⁰AT1不依赖氯离子，仅能协同转运1 Na⁺每个氨基酸。随后，证明人类B⁰AT1与小鼠直系亲属具有相同的运输活性(4,5)以及对底物的相似亲和力。转运体的低表达水平非洲爪蟾直到最近，卵母细胞阻碍了对转运蛋白的进一步表征。转运体主要表达在小鼠近曲小管的S1段，但在人类组织的近曲小管所有段中都有表达(36,37).

突变

B的标识⁰AT1（SLC6A19）作为Hartnup疾病的基因，在几个Hartnup病家族中启动了测序尝试。这些发现了SLC6A19的突变，该突变与疾病和失活的运输功能共同分离(4,5). 虽然最初有一些关于额外Hartnup障碍基因的猜测，但对迄今为止确定的家族的重新评估和新家族的测序显示，所有病例中SLC6A19都有突变(38). 迄今为止，已经在20多个家族中发现了21种不同的突变（表​（表11和图。​图2）。2). 原始Hartnup病例的样本导致在干预序列8中识别出一个剪接突变(4).

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图2

人类SLC6A19拓扑模型中Hartnup障碍相关突变概述。螺旋的排列反映了基于亮氨酸转运体LeuT结构的SLC6家族的共识模型超嗜热菌(40). 由于这种布局，主干在螺旋线5和6之间以图形方式中断。底物和底物结合所涉及的残留物以绿色显示。Na人⁺离子以红色显示，钠中含有残留物⁺‐结合用红色环装饰。与Hartnup疾病相关的突变被标记为橙色，并显示为蓝色环。被认为形成转运蛋白两个门的残基通过虚线连接，并涂上蓝色（碱性残基）或黄色（酸性）。

西欧血统中最常见的突变似乎是D173N等位基因。遗传分析表明，它可能在50代前起源于中欧，并由携带等位基因的移民引入澳大利亚和加拿大(39). Hartnup障碍相关突变的功能分析揭示了进一步的复杂性。D173N等位基因只能部分灭活蛋白质(5). 由于Hartnup障碍是隐性的，部分失活不太可能导致Hartnup疾病。类似地，R240Q突变甚至增加了运输活性(5). 这些突变现在由B解释⁰AT1相关蛋白（见下文）。细菌SLC6同源物LeuT的高分辨率结构显著改善了SLC6A19突变的功能分析，LeuT是一种从超嗜热菌(40). 细菌转运体具有与B相似的底物特异性⁰一个显著的例外是色氨酸，它是LeuT的竞争性抑制剂(41)但B的基质，尽管很弱⁰自动变速箱1(34). 这两种转运蛋白的另一个区别是2 Na的共转运⁺在LeuT的情况下，而只有1 Na⁺由B共同运输⁰AT1.有充分证据表明Na⁺结合位点1是B中的活性结合位点⁰AT1.值得注意的是，底物亮氨酸的羧基构成Na的一部分⁺细菌转运蛋白中的结合位点(42). 这很好地解释了在转运体的功能表征期间注意到的一种行为，即钠增加⁺浓度降低表观K（K） _米用于基板，反之亦然(34). 与构成Na部分的基质一致⁺结合位点，Camargo等人(35)提出亮氨酸首先以有序机制结合，而博默提出了一个更随机的模型(34). 因此Na⁺也可能有助于亮氨酸结合位点。第二个Na的作用⁺‐B中的结合位点⁰AT1仍不清楚。结合位点保守，第二个Na⁺可能在转运体中起结构作用而不被转位。

与LeuT的序列相似性允许产生同源模型，这有助于解释某些突变中的功能丧失(42). 例如，G284位于输送器的螺旋6中（图。​（图22和​和3）。三). 与螺旋1一起，它与底物转位途径相连，并被建议在转运周期中以摇杆开关模式移动(40). 在膜的中心，两个螺旋部分展开，使主链残基接触到共同转运的钠⁺离子。由于其缺乏侧链所提供的灵活性，残基G284允许在该区域内展开螺旋。位于螺旋1的R57突变破坏了转运蛋白的细胞外门（图。​（图2）。2). 该闸门对于通过与D486相互作用关闭孔隙的传输机制至关重要（图。​（图4）。4). R57突变为中性残基消除了这种相互作用。根据同源模型，R240Q突变的作用模式完全不同。残留物位于向外突出的蛋白质的顶端(37). 因此，它似乎不太可能影响转运蛋白本身，而是指向与辅助蛋白的相互作用位点。

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图3

Hartnup疾病相关突变G284的位置。B的同源模型⁰AT1（SLC6A19）是根据LeuT的结构从超嗜热菌螺旋线1显示为黄色，螺旋线6显示为蓝色。该动画显示了两个螺旋的非螺旋部分，靠近基板结合部位。其他螺旋线用红色表示。两个Na⁺离子的描述类似于细菌的结构。实验证据表明Na<trans data-src=" "> </trans><trans data-src="1">1</trans><trans data-src="+">+</trans>在B中共同运输⁰AT1.钠的存在和功能<trans data-src=" "> </trans><trans data-src="2">2</trans><trans data-src="+">+</trans>是推测性的。G284位于螺旋6的中心，螺旋结构在此中断。该图是使用Pymol（DeLano Scientific）生成的。

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图4

Hartnup障碍相关突变R57。B的同源模型⁰AT1（SLC6A19）是根据LeuT的结构从超嗜热菌螺旋线1显示为黄色，螺旋线6显示为蓝色。其他螺旋以红色表示。底物亮氨酸和假想钠的位置<trans data-src=" "> </trans><trans data-src="2">2</trans><trans data-src="+">+</trans>显示。残基R57与D486紧密接触并形成离子键，从而关闭向细胞外空间的转运孔。该图是使用Pymol（DeLano Scientific）生成的。

相关蛋白

我们对B的理解有了重大突破⁰AT1功能是发现缺乏蛋白质收集器蛋白的小鼠在尿液中排出大量中性氨基酸，类似于Hartnup障碍(43,44). 当尿液冷却时，这些氨基酸以沉淀的形式出现。随后对肾刷状缘膜囊泡的分析显示，B几乎完全缺失⁰笔刷边界中的AT1。Collectrin是一种27kDa的I型膜蛋白（也称为TMEM27）。该蛋白与水泡运输、胰岛β细胞中的胰岛素释放以及集合管中纤毛细胞的功能有关（因此被称为collectrin）(45). 然而，迄今为止，收集素缺乏小鼠唯一值得注意的表型似乎是一般性氨基酸尿⁰AT1和收集器爪蟾卵母细胞导致转运活性增加5到10倍(43). 因此B⁰AT1似乎需要与collectrin进行异二聚以稳定和表面表达。已知Collectrin通过与snapin相互作用绑定到SNARE复合体(46)（图。​（图5）5)并似乎与细胞骨架的元素如肌球蛋白重链II‐A和γ‐肌动蛋白相互作用(47). 很容易推测它参与了B的融合⁰含AT1的囊泡和质膜。对collectrin的需求也解释了表达不佳的原因，尤其是人类B⁰AT1英寸爪蟾卵母细胞。有趣的是，collectrin在肾脏中表达，但在肠道中不表达，其中B⁰AT1含量丰富。随后，据报道，在肠道中，收集素相关肽酶血管紧张素转换酶2（ACE2）作为B的伴侣发挥作用⁰自动变速箱1(37,48). ACE2是一种具有多种生理功能的羧肽酶。通过将其转化为血管紧张素1-7（图。​（图5）。5). 在肠道中，它参与肽消化，为B提供中性氨基酸⁰AT1运输机(37). ACE2也被确定为SARS病毒受体(49)ACE2缺乏会导致肾小球硬化(50). 共表达B的卵母细胞中一些突变的重新评估⁰AT1和ACE2（或集合蛋白）表明，突变D173N完全抑制转运活性，而不是在表达B的卵母细胞中分析时观察到的部分⁰单独使用AT1(37). 联合表达系统中的R240Q突变也导致运输活性显著降低。因此B的相互作用⁰含有ACE2/集合蛋白的AT1有助于解释迄今为止发现的所有致病等位基因。肾脏和肠道中两种不同蛋白质的相互作用也为单纯的肾脏或肠道Hartnup疾病提供了解释。这些可能是由影响与一种蛋白质相互作用而非另一种蛋白质的突变引起的。或者，ACE2或collectrin的突变可以消除与B的相互作用⁰AT1，但尚未在Hartnup疾病中发现。有两个证据支持这一理论。首先，收集素缺乏的小鼠表现为肾性Hartnup障碍(43)，而ACE2缺陷小鼠表现为肠道Hartnup障碍和ACE2相关病理(48). 其次，与Hartnup病相关的一些突变显示出与ACE2或collectrin的轻微差异性相互作用(48). 还没有研究B基因突变⁰AT1还影响ACE2的表面表达，从而可能影响血压调节。最近的一项研究报告了SLC6A19基因（SLC6A19-MS7）中的一个特定微卫星与高血压的相关性(51)，但尚不清楚为什么位于该基因中的其他微卫星缺乏这种关联。

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图5

SLC6A19相互作用蛋白概述。蛋白质-蛋白质相互作用用完整的箭头表示。转录调控用虚线箭头表示。生理反应如括号所示。

B的相互作用⁰含collectrin的AT1也解释了MODY3患者的氨基酸尿，MODY3是由转录因子HNF1α（肝核因子1α）突变引起的(52). HNF1α是控制肾脏集合蛋白表达的主要转录因子之一。HNF1α失活将导致集合蛋白表达缺失，进而导致B的表达减少⁰AT1和脯氨酸转运体IMINO（图。​（图5）。5). HNF1α在小鼠中失活会导致肝功能障碍、苯丙酮尿症和肾范科尼综合征。因此，在范科尼综合征中观察到的氨基酸尿可能与collectrin丢失或HNF1α表达下调有关。与这个概念一致，HNF1α也被证明可以控制顶端葡萄糖转运蛋白SGLT1的表达(53)可能是阳离子氨基酸转运体rbAT/b^0,+自动变速箱(54). 在糖尿病或妊娠中观察到的氨基酸尿仍然无法解释，但也可能涉及集合蛋白水平的降低。

如上所述，肽转运可能会弥补Hartnup障碍中氨基酸的缺失。到目前为止，在肽转运蛋白PepT1中发现了大量同义单核苷酸多态性（SNP）(55). 仅检测到一个突变（F28Y）降低了转运活性。目前尚未研究启动子或内含子区域的SNP是否会改变转运蛋白的表达，从而调节Hartnup疾病的表型。也没有研究过最近的典型Hartnup疾病病例是否携带PepT1中的F28Y突变从而加重症状。

新家庭的婚礼

如上所述，B⁰AT1是神经递质转运体SLC6家族的成员。当这个家族被发现时，同源克隆揭示了一个相关转运体的亚家族，其功能无法确定。这些运输者被命名为XT1（别名NTT4）(56,57)，XT2（别名ROSIT）(31,32)，XT3型(58)，NTT5(59)和v7‐3(60). SLC6家族的这一分支因此被称为孤儿运输分支。B的发现⁰AT1将其放在孤儿转运蛋白分支，表明“孤儿”实际上可能是氨基酸转运蛋白(61)（表​（表2）。2). 随后证实XT3为心尖系统IMINO转运体(66,67)，一种对脯氨酸、羟脯氨酸、甜菜碱和MeAIB具有特异性的转运蛋白。下一个v7‐3被确定为B⁰AT2是一种性质与B相似的运输工具⁰AT1，但具有更窄的底物特异性，更喜欢支链氨基酸和甲硫氨酸(62,63). 最近发现NTT4是一种中性氨基酸转运蛋白(64,65)，要么是Na⁺或H⁺依赖，得名B⁰AT3.XT2似乎更喜欢甘氨酸和丙氨酸（手稿正在准备中）。孤儿运输者因此组成了Na的大家庭⁺依赖性中性氨基酸转运蛋白。

结论

虽然最初被描述为一种简单的常染色体隐性遗传病，但潜在基因SLC6A19的分子鉴定揭示了转运蛋白及其相关蛋白集合蛋白和ACE2之间的复杂相互作用。SLC6A19的相互作用（图。​（图5）5)可能与糖尿病、血压调节功能障碍和肾小球硬化等复杂疾病有关。

脚注

参考文献