肝病学。作者手稿；PMC 2020年4月7日提供。
以最终编辑形式发布为：
预防性维修识别码：PMC7137387号
尼姆斯：尼姆斯1576165
Toll样受体（TLR）4在酒精性肝病中的关键作用与常见TLR适配器MyD88无关
马萨诸塞大学医学院医学系，马萨诸塞州伍斯特马萨诸塞州立大学。
- 补充资料
补充图1。
GUID:49478811-D80A-4B5C-AD3A-A76400A09B6C
补充图2。
GUID:565D7ACC-801A-41D0-8A28-40E75F88F609
补充信息。
GUID:F8CAB5D0-9E9E-4244-8324-ACDC17874E6D
摘要
识别内毒素（酒精性肝病（ALD）炎症的触发因素）的Toll样受体4（TLR4）利用不同的适配器分子激活两条信号通路：普通TLR适配器、髓样分化因子88（MyD88）或Toll/白细胞介素免疫应答-含域适配器诱导干扰素（IFN）-βMyD88途径诱导促炎细胞因子激活，这是ALD的关键介质。在这里，我们评估了服用Lieber-De-Carli饮食（4.5%体积/体积乙醇）或等热量液体对照饮食5周后，MyD88在野生型、TLR2缺乏、TLR4缺乏或MyD88缺乏（敲除[KO]）小鼠酒精诱导肝损伤中的作用。酒精喂养导致血清丙氨酸氨基转移酶水平、肝脏脂肪变性和甘油三酯水平显著升高，表明WT、TLR2-KO和MyD88-KO小鼠存在肝脏损伤，但TLR4-KO小鼠没有。炎症介质的表达（肿瘤坏死因子-α与对照组相比，喂食酒精的WT、TLR2-KO或MyD88-KO小鼠的肝脏中的白细胞介素-6）和TLR4共受体（CD14和MD2）显著升高，但TLR4-KO小鼠中没有。细胞色素P450和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸复合物产生的活性氧自由基有助于酒精性肝损伤。酒精摄入诱导的细胞色素P450和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸复合物的表达和激活被TLR4缺乏所阻止，而不是被MyD88缺乏所阻止。干扰素调节因子3（IRF3）是MyD88诱导的依赖性信号分子，在WT小鼠或任何KO小鼠的整个肝脏中，其肝脏表达均不受慢性酒精治疗的影响。然而，在酒精喂养的WT小鼠的Kupffer细胞中发现了IRF7（一种IRF3诱导基因）的诱导。饮酒也会诱发核因子-κB以TLR4依赖性MyD88非依赖性方式激活。
结论：
虽然TLR4缺乏具有保护作用，但MyD88缺乏未能预防酒精诱导的肝损伤和炎症。这些结果表明，普通TLR适配器MyD88在ALD中TLR4介导的肝损伤中是不可或缺的。
酒精性肝病（ALD）以脂肪肝、脂肪性肝炎和肝硬化等多种肝脏病理学为特征，是美国肝移植的第二大病因。1肠源性脂多糖（LPS）是革兰氏阴性菌壁的一种成分，被认为是ALD发病机制中的关键因素。2–4长期饮酒期间接触LPS会导致炎症介质的产生增加，以及活性氧（ROS）的诱导，从而导致肝脏损伤的进展。5,6事实上，缺乏肿瘤坏死因子α（TNF）的小鼠α)保护I型受体免受酒精诱导的肝损伤。7在不同来源的活性氧中，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶激活的作用是通过减弱p47phox（NADPH-氧化酶复合物的诱导成分）缺乏小鼠的肝损伤诱导而得到的。8最近的研究表明，脂多糖诱导NADPH氧化酶活化。9,10然而，LPS、酒精或两者是否激活ALD中的NADPH尚待确定。
包括内毒素在内的病原衍生分子的识别通过模式识别受体发生，例如Kupffer细胞以及肝脏中其他细胞类型上表达的Toll样受体（TLR）。11–13LPS由TLR4及其共受体CD14和MD2识别。12先前的研究表明，由于LPS结合蛋白、CD14缺乏或TLR4突变而无法诱导LPS信号传导，可以保护小鼠免受酒精诱导的肝损伤。14–16这些观察表明LPS传感和/或下游信号通路中的受体可能在ALD的发病机制中起重要作用。
TLR4通过招募适配器分子激活两条信号通路。17普通TLR适配器髓样分化因子88（MyD88）的招募导致核因子的快速激活κB（NFκB） 并增加TNFα产生，同时招募Toll/白细胞介素-免疫应答-包含域的适配器诱导干扰素（IFN）-β（TRIF）是TLR4和TLR3共享的一种适配器，激活tank-binding kinase 1/κB激酶抑制剂–¦Β和干扰素调节因子3（IRF3），导致产生I型干扰素和延迟NF-κB激活。17,18两种不同下游途径的意义以及TLR4激活的不同适配器分子在酒精性肝病中的作用尚待评估。
考虑到LPS诱导的ROS和炎症级联激活在ALD中的重要性以及TLR4信号在LPS诱导下游通路中的作用，我们假设TLR4在酒精诱导的肝病中至关重要，TLR4通过MyD88依赖性下游通路发挥作用。我们进一步假设TLR4可能在酒精性肝损伤中诱导ROS中起关键作用。因此，在本研究中，我们评估了长期饮酒对TLR4、TLR2或普通TLR适配器MyD88缺陷小鼠肝损伤、脂肪变性、炎症和ROS诱导相关酶的影响。
材料和方法
动物研究。
所有动物都按照马萨诸塞大学医学院动物使用和护理委员会批准的动物协议接受了适当的护理。6周龄至8周龄雄性野生型（WT）小鼠（C57BL/6）、TLR2-缺乏型、TLR4-缺乏型和MyD88缺乏型小鼠（均为C57BL-6背景，5-6只小鼠/组）连续5周接受Lieber-DeCarli饮食（Bio-Serv，新泽西州Frenchtown），含4.5%（体积/体积）乙醇（32.4%乙醇衍生热量）；配对喂养的对照组小鼠摄入的热量与用右旋糖酐-麦芽糖替代的酒精衍生热量的酒精喂养组小鼠相同。从全血中分离血清，并在−80°C下冷冻。肝脏在液氮中进行snap冷冻，或储存在RNAlater（德国希尔登Qiagen GmbH）中进行RNA提取，或固定在10%中性缓冲福尔马林中进行组织病理学分析。
生化分析。
血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）用动力学方法测定（新泽西州南普莱恩菲尔德高级诊断公司），内毒素水平用鲎属阿米巴细胞裂解物分析（瑞士Lonza有限公司）和使用酒精分析仪的酒精含量（马萨诸塞州Analox Lunenberg）。使用L型甘油三酯H试剂盒（Wako Chemicals USA Inc.，VA）评估肝脏甘油三酸酯水平。
RNA分析。
使用RNeasy试剂盒（美国马里兰州Qiagen Sciences）和柱上DNA消化法纯化RNA。cDNA通过逆转录系统转录（Promega Corp.，Madison，WI）。如前所述，使用iCycler（加州Hercules Bio-Rad Laboratories Inc.）进行实时定量聚合酶链反应19; 引物序列如所示.
表1。
| 目标基因 | 正向引物（5′→3′） | 反向底漆（5′→3′） |
|---|
| 18秒 | gta acc cgt tga acc cca tt | cca-tcc-aat-cgg标签cg |
| CD-14光盘 | gga-agc-cag-aga-aca-cca-tc | cca-gaa-gca-aca gca-aca-ag |
| MD-2型 | gac gct gct ttc tcc cat a | 猫tgg ttc ccc tca gtc tt |
| 红外线3 | aac cgg aaa gaa gtg ttg cg | gca ccc aga tgt acg aag tcc |
| IRF7型 | aca ggg cgt ttt atc ttg cg | tcc aag ctc ccg gct aag t |
| TNF公司α | cac cac猫caa gga ctc aa | agg-caa-cct-gac-cac-tct-cc |
| 白细胞介素-6 | aca acc acg gcc ttc cct法案 | cac-gat-ttc-cca-gag-aac-atg-tg |
| CYP2E1型 | aag cgc ttc ggg cca g | 标签cca tgc agg acc acg a |
| p22照片 | tgg-agc-gat-gtg-gac-aga-ag | ccc-gga-cgt-agt-aat-tccc-tgg |
| p47凤凰 | cca-ggg-cac-tct-cac-tga-ata | atc-agg-ccg-cac-ttt-gaa-gaa |
| p67凤凰 | gct gcg tga aca cta tcc tgg | agg tcg tac ttc tcc att ctg ta标签标签标签标签标签标签标签标签标签标签标签标签标签标签标签标签标签标签标签标签标签标签标签标签标签标签标签标签标签标签标签标签标签标签标签标签标签标签标签标签标签标签标签标签标签标签标签标签标签标签标签标签标签标签标签标签标签标签标签标签 |
| gp91手机 | ctg-ctc-tcc-ttt-ctc-agg-ggt | gtg-tgc-agt-gct-atc-caa |
| 第4个 | agg att gtg ttt aag cag agc at | ccg gca cat agg taa aag gat g |
蛋白质印迹和NF-κB活性分析。
如前所述，从肝脏中提取全细胞裂解物或核组分。19含有等量蛋白质的样品在10%的聚丙烯酰胺凝胶中分离，并在硝化纤维素膜上用特定的一级抗体进行鉴定，然后用辣根过氧化物酶标记的二级抗体进行检测，并使用化学发光法进行检测。NF公司-κ如前所述，在整个肝脏提取物中测量B活性。19
组织病理学分析。
福尔马林固定的肝脏切片用苏木精和伊红染色或4-羟基壬醛染色，并用显微镜进行分析。
膜制备。
通过Nagamatsu等人的方法分离出总肝细胞膜。20稍作修改。简单地说，在1 mL 10 mM Tris-HCl、pH 7.4、1 mM乙二胺四乙酸、200 mM蔗糖和1 mM苯甲基磺酰氟中均质肝组织；细胞核和细胞碎片在900℃离心去除克在4°C下保温10分钟；所得上清液在110000下离心克在4°C下持续75分钟。在4°C下将膜颗粒溶解在10 mM Tris-HCl、pH 7.4、1 mM乙二胺四乙酸、0.5%Triton X-100和1 mM苯甲基磺酰氟中1小时，在14000离心克在+4°C和1下持续10分钟μ在分析之前，向溶解的膜样品中添加g/mL抑肽酶。
微粒体制剂。
在冷KP缓冲液（0.1 M K）中均质肝组织2高性能操作4/千赫2人事军官4pH值为7.4）。在冰上对匀浆进行超声处理（40%占空比，四次输出）20秒，然后在12000下离心克在+4°C下保持15分钟；用KP缓冲液以100000的速度清洗颗粒克在+4°C下放置1小时，并使用BioRad蛋白质测定法测定蛋白质含量。
Kupffer细胞和肝细胞的分离。
小鼠接受氯胺酮（100 mg/kg）和木聚嗪（10 mg/kg）麻醉；用生理盐水灌注肝脏5分钟，然后体内用游离酶（20 mg/L）消化5分钟在体外在37°C下再消化30分钟。通过在300℃下离心5分钟来分离肝细胞克将非肝细胞含量加载到50%–25%Percoll梯度的顶部，并在800℃下离心60分钟克.在Dulbecco改良的Eagle’s培养基+5%胎牛血清中清洗夹层部分并粘附在塑料上；清洗非粘附部分，将粘附的Kupffer细胞数调整为2×106/在Dulbecco改良的Eagle's培养基中加入mL+10%胎牛血清。
统计分析。
使用非参数Kruskal-Wallis检验和Mann-Whitney检验确定统计显著性。数据显示为平均值±标准差，在P（P）<0.05。
结果
慢性酒精摄入会导致MyD88缺乏小鼠的肝损伤，但不会导致TLR4基因敲除小鼠的肝损害。
使用Lieber-DeCarli饮食的小鼠慢性酒精喂养类似于人类酒精性肝炎的几个特征，包括肝细胞损伤、脂肪变性和炎症细胞激活。4–8,14–16在这里，我们给WT、TLR4缺乏和MyD88缺乏小鼠喂食Lieber-DeCarli或等热量控制（配对喂食）饮食，以诱导早期酒精性肝损伤。慢性酒精喂养会导致肝损伤，与配对喂养的WT和MyD88基因敲除（KO）小鼠相比，酒精喂养小鼠的血清ALT水平更高，但TLR4-KO小鼠没有这种情况(). 在TLR4-KO小鼠中，血清ALT没有增加，表明肝损伤，但所有动物的血清酒精浓度都是可比的(). 此外，我们发现，无论基因背景如何，与双喂对照组相比，所有饮酒小鼠的血清内毒素水平都有适度但显著的增加().
TLR4缺乏而非MyD88缺乏可防止酒精诱导的肝损伤。C57BL/6（WT）、TLR4缺乏或MyD88缺乏小鼠（每组5至6只）接受含4.5volume/volume%乙醇或等热量液体对照饮食的Lieber-DeCarli饮食5周。5周喂养期后，处死小鼠。从全血中分离血清，并分析（A）ALT、（B）酒精和（C）内毒素水平。显示了平均值±标准偏差（SD）。
TLR4缺乏但MyD88缺乏可防止酒精引起的脂肪变性。
组织病理学分析表明，慢性酒精摄入导致慢性乙醇摄入WT和MyD88缺乏小鼠的微泡和大泡脂肪变性和炎症细胞募集，但在TLR4-KO小鼠中没有(;补充图1). 与组织病理学研究结果一致，与配对喂养的对照组相比，酒精喂养的WT和MyD88缺乏小鼠的肝脏甘油三酯水平显著升高，但TLR4-KO小鼠的肝甘油三酸酯水平没有升高(). 为了进一步评估MyD88的作用，我们还测试了TLR2缺陷小鼠，因为TLR2诱导的信号传导仅依赖于MyD88。11与MyD88缺陷小鼠类似，TLR2缺陷小鼠没有受到酒精诱导肝脂肪变性的保护(,). 长期饮酒也会导致WT、TLR2缺乏和MyD88缺乏小鼠的肝/体重比增加，但TLR4-KO小鼠没有(). 总的来说，这些数据表明，长期酒精喂养导致WT和MyD88缺陷动物出现ALD特征，但TLR4缺陷动物没有。
慢性酒精摄入会导致WT、TLR2缺乏和MyD88缺乏小鼠的肝脏脂肪变性，但TLR4缺乏小鼠没有。C57BL/6（WT）、TLR2-defient、TLR4-defient或MyD88-defient小鼠（每组5-6只）接受了材料和方法中描述的Lieber-DeCarli饮食。（A） 每组福尔马林固定石蜡包埋肝脏的代表性切片用苏木精和伊红染色，显示为×100（放大倍数较高，见补充图1). （B） 肝脏甘油三酯水平和（C）肝脏/体重比显示为N=5只小鼠/组的平均值±标准差（SD）。
TLR4，但不是TLR2或MyD88，缺乏可防止酒精诱导的炎症细胞因子和TLR4辅受体表达增加。
LPS诱导的TLR4介导的MyD88依赖性信号通路导致促炎细胞因子的产生。14,17,18我们发现TNF的表达α与配对喂养的对照组相比，酒精喂养的WT和MyD88缺乏小鼠的肝脏中IL-6信使RNA（mRNA）显著升高。相反，肝脏TNF没有增加α或TLR4缺乏小鼠的IL-6 mRNA(,). 与MyD88-KO小鼠相似，TLR2-KO小鼠增加了TNFα与双喂对照组相比，喂食酒精后肝脏中IL-6 mRNA水平(,).
慢性酒精摄入增加TNF肝脏mRNA表达αWT、TLR2缺乏和MyD88缺乏小鼠中的IL-6和TLR4共受体CD14和MD2，但TLR4-KO小鼠中没有。C57BL/6、TLR2-defient、TLR4-defient或MyD88-defient小鼠接受Lieber-DeCarli饮食。（A）TNF的肝脏RNA水平α采用实时定量聚合酶链反应（qPCR）分析（B）IL-6、（C）CD14和（D）MD2。这些值被归一化为18S，并显示为与双喂饲WT对照组相比，每组N=5-6倍的增加。
先前的研究表明，慢性乙醇摄入导致肝脏损伤和炎症反应的机制涉及LPS识别和LPS触发信号传导相关基因的上调，21–24我们发现，在WT、MyD88-KO和TLR2-KO小鼠中，慢性酒精喂养增加了TLR4共受体CD14和MD2的肝脏mRNA水平，而TLR4-KO小鼠与双喂对照组相比没有增加(,).
慢性乙醇摄入增加WT和MyD88缺陷小鼠肝脏中CYP2E1水平的表达，但在TLR4-KO小鼠中没有。
乙醇诱导的肝损伤中氧化应激的诱导涉及CYP2E1的上调，CYP2E1是一种具有强大代谢乙醇和产生酒精衍生毒性底物能力的酶。8,25,26此外，最近的研究表明，脂多糖也上调CYP2E1。26,27因此，我们研究了慢性酒精暴露对TLR4缺乏和MyD88缺乏小鼠肝脏中CYP2E1的影响。我们发现慢性酒精喂养后，WT和MyD88缺陷小鼠的肝脏CYP2E1 mRNA水平上调，而TLR4-KO小鼠的肝脏则未上调(). 与此相一致，与双喂对照组相比，酒精喂养的WT和MyD88缺乏小鼠的肝微粒体CYP2E1蛋白水平显著升高(,). 相反，在TLR4缺乏小鼠中，酒精喂养未导致肝脏CYP2E1蛋白水平增加().
TLR4缺乏可防止酒精诱导的肝脏CYP2E1表达增加。C57BL/6、TLR4缺乏或MyD88缺乏小鼠（每组5至6只）接受Lieber-DeCarli饮食。（A） 采用实时定量聚合酶链反应（qPCR）分析CYP2E1的肝脏RNA水平。western blot分析（B）WT、（C）TLR4缺乏和（D）MyD88缺乏小鼠肝微粒体组分中CYP2E1蛋白水平；calnexin表达作为内务管理控制。图中显示了一个代表性斑点（顶部）和从N=3（底部）归一化为载荷控制的密度分析。
TLR4依赖性但MyD88依赖性通过酒精喂养诱导NADPH复合物。
LPS和其他微生物病原体激活吞噬细胞中的NADPH复合体产生ROS，并且在乙醇处理后，NADPH氧化酶复合体在Kupffer细胞中生成ROS。8,9,28经典NADPH复合物由至少六个蛋白质组分组成，其中包括两个跨膜黄细胞色素b组分（gp91phox和p22phox）和四个细胞溶质组分（p47phox、p67phox，p40phox以及Rac-1蛋白）。29,30LPS是NADPH转录和功能活性的强诱导剂。9,10,28我们发现在酒精喂养的WT、MyD88-KO和TLR2-KO小鼠中(–)NADPH氧化酶亚单位，即p22phox、gp91phox，p47phox和p67phox的肝脏mRNA水平显著高于配对喂养的对照组(–). 相反，与配对喂养的对照组相比，酒精喂养的TLR4-KO小鼠未观察到此类变化(–). 为了响应广泛的刺激，NADPH复合体的胞浆亚单位被磷酸化并转移到质膜，形成活性复合体并产生超氧阴离子。29,30我们发现，与双喂小鼠相比，酒精喂养小鼠的肝脏质膜中p47phox蛋白水平增加，这为NADPH氧化酶的功能激活提供了证据().29–31与配对喂养的对照组相比，NADPH在TLR4依赖性但MyD88依赖性酒精诱导的肝损伤中的作用是一致的，我们发现在WT、TLR2缺乏和MyD88缺乏但TLR4缺乏的酒精喂养动物的肝脏中，4-羟基壬醛染色增加，提示氧化组织损伤(补充图2).
慢性酒精摄入增加了WT、TLR2缺乏和MyD88缺乏小鼠NADPH复合物亚单位的肝脏mRNA表达，但TLR4-KO小鼠没有。C57BL/6、TLR2-defient、TLR4-defient或MyD88-defient小鼠（每组5-6只）接受Lieber-DeCarli饮食。采用实时定量聚合酶链反应（qPCR）分析肝脏中（A）p22phox、（B）gp91phox，（C）p47phox和（D）p67phox以及（F）Nox4的RNA水平。这些值被标准化为18S，并显示为双喂饲WT对照组的倍数增加。（E） 用western blot分析了酒精喂养和配对喂养WT小鼠全肝膜组分中p47phox蛋白的表达；pancadherin表达作为负荷对照。显示了p47phox蛋白表达的密度分析（归一化为pan-cadherin；N=3）。
虽然非吞噬细胞中的NADPH复合物在结构和功能上与吞噬细胞的NADPH-氧化酶相似，29,31NADPH氧化酶的几个同源物已被鉴定。肝细胞中表达的gp91phox同源物之一是NADPH氧化酶4（Nox4）。32然而，无论是酒精喂养的小鼠还是配对喂养的小鼠，无论其遗传背景如何，其肝脏中Nox4的mRNA水平都没有增加(). 这些数据表明，肝巨噬细胞中典型的NADPH氧化酶可能在慢性乙醇治疗后的肝损伤中起作用。
慢性酒精摄入调节MyD88非依赖性TLR4信号。
到目前为止，我们的结果表明，TLR4在ALD的所有检查方面都至关重要，但在TLR4启动的两条下游信号通路中，MyD88依赖性信号是不必要的。IRF3是MyD88依赖性、TLR4介导和TLR3介导信号的标记。17MyD88依赖性通路的激活导致IRF3激活并导致晚期NFκB活化和生产I型干扰素。17,18我们发现，无论是遗传缺陷还是慢性酒精喂养，所有分析动物的肝脏IRF3 mRNA总水平都具有可比性(). 为了评估IRF3可能的细胞特异性上调，我们还测试了分离肝细胞和Kupffer细胞中IRF3 mRNA的表达，发现与对照组相比，喂食酒精后IRF3的mRNA表达没有差异(). 然而，与双喂对照组相比，IRF3诱导基因IRF7在分离的Kupffer细胞中上调，但在酒精喂养的WT小鼠肝脏的肝细胞中没有上调(). 与整个肝脏中Kupffer细胞丰度较低相一致，在酒精喂养的WT小鼠中，整个肝脏IRF7 mRNA显示出轻微但具有统计学意义的增加(). 与TLR4依赖性MyD88依赖性信号传导在ALD中很重要的假设相关，我们发现与配对喂养的对照组相比，酒精喂养的MyD88缺乏小鼠的肝脏IRF7增加，但TLR4缺乏小鼠的肝IRF7没有增加().
慢性酒精摄入导致TLR4介导的MyD88依赖性通路激活。C57BL/6、TLR4缺乏或MyD88缺乏小鼠（每组5至6只）接受Lieber-DeCarli或配对饮食5周。（A） 采用实时定量聚合酶链反应（qPCR）分析整个肝脏中IRF3和（C）IRF7 RNA水平，以及纯化肝细胞和Kupffer细胞中（B）IRF3与IRF7水平。（D） NF公司-κ用电泳迁移率变化法分析全肝B活性；显示了代表性凝胶（顶部）和来自N＝5只小鼠/组的密度计分析（底部）*P（P）与相应的双馈控制相比，<0.05。
最后，我们询问TLR4或MyD88缺陷是否会影响NF的激活-κALD期间为B。NF公司-κB通过MyD88依赖性和MyD88独立性途径激活，前者更健壮、更直接，后者以延迟的方式适度。11酒精饮食导致中度NF诱导-κ与配对喂养的对照相比，WT和MyD88缺陷小鼠的整个肝脏中的B活化(). 相反，NF-κ在TLR4缺乏小鼠的肝脏中喂食酒精后未观察到B激活(). 这些数据支持TLR4而非MyD88导致信号机制激活的论点，包括NF-κB通路，ALD期间。
讨论
LPS诱导的炎症通路激活和活性氧自由基生成是ALD的关键组成部分。2–9在本研究中，我们证实了TLR4缺乏小鼠对酒精诱导的肝损伤的保护作用，16我们首次表明，ALD的TLR4依赖性保护与通用TLR适配器MyD88的表达无关。
对于观察到MyD88依赖性但TLR4介导的酒精诱导肝损伤，至少有两种可能的解释：第一，MyD88介导的TLR4信号通路参与酒精性肝病；其次，乙醇对TLR4的激活绕过MyD88适配器，导致促炎性激活。我们的数据显示，慢性酒精喂养后，小鼠体内IRF7（一种IRF3诱导的基因）水平增加，这为第一种情况提供了支持。LPS激活MyD88依赖性通路是通过TRAM（Toll/IL-1抗性域相关适配器诱导的1FN）的募集介导的β-相关的衔接子分子）/TRIF衔接子，其中TRIF也被TLR3利用，导致IRF3的激活和核转位，导致IRF3诱导型基因如IRF7和I型IFN的诱导。17,18,33MyD88依赖性通路的激活也可能导致NF的晚期激活κB。17,18以前的研究表明，长期饮酒会增加NF-κB在整个肝脏和Kupffer细胞中激活。34,35这里我们发现了NF-κB的激活反映了TLR4（而非MyD88）对ALD的保护作用。在这种情况下，只有TLR4依赖性激活途径近端缺陷的小鼠；也就是说，TLR4缺乏的小鼠，但WT、TLR2缺乏的小鼠和MyD88缺乏的小鼠没有表现出NF的缺乏-κ喂食酒精后肝脏中的B激活。这些结果表明，在ALD中NF的激活-κB可能独立于MyD88发生。此外，我们确定了ALD中IRF3依赖通路的激活。虽然与配对喂养的对照组相比，酒精喂养后肝脏中IRF3的mRNA没有差异，但IRF7（一种IRF3依赖性基因）在整个肝脏中上调，在分离的Kupffer细胞中上调幅度更大，但在肝细胞中没有上调，这表明MyD88依赖性IRF3通路的功能激活。我们的观察进一步表明了MyD88依赖性通路激活与TLR4之间的联系，即喂食酒精后，IRF7在MyD88缺陷小鼠中增加，但在TLR4缺陷小鼠中没有增加。总之，这些结果表明TLR4在ALD期间MyD88诱导的依赖性肝损伤中的作用，可能涉及两种NF-κB和IRF3/IRF7途径。
LPS诱导的TLR4依赖性MyD88依赖性通路参与的第二个可能的解释是，酒精导致信号绕过MyD88诱导炎症通路。最近的研究表明，MyD88依赖性和MyD88独立性通路之间存在串扰，36酒精性肝也可能发生。此外，脂多糖诱导的MyD88依赖性通路的激活与CD14共受体的参和特别相关。37重要的是，CD14缺乏可以保护肝脏免受酒精诱导的肝损伤15; 然而，MyD88依赖性通路的特定成分在ALD发病机制中的参与尚待研究。
氧化应激已被确定为ALD的关键因素。8,25与慢性饮酒一致，我们发现参与酒精代谢的微粒体酶CYP2E1在WT和MyD88-KO小鼠中的水平上调。然而，在喂食和不喂食酒精的TLR4-KO小鼠中，CYP2E1水平没有差异，这表明TLR4-d缺乏可能保护小鼠免受酒精诱导的CYP2E2介导的氧化应激。该观察结果与LPS在转录和转录后水平诱导CYP2E1的报道一致。27此外，CYP2E1诱导被显示为放大LPS诱导的肝损伤。26诱导型一氧化氮合酶（iNOS）-KO中CyP2E1增加的报道38和早期生长反应1（Egr1）-KO小鼠39反映TLR4下游分子的保护作用；因此，这些分子可以使LPS-TLR4介导的CyP2E1上调。与TLR4在酒精诱导的ROS激活中的作用一致，我们还发现TLR4-KO小鼠对NADPH氧化酶复合物激活的保护作用。酒精喂养不仅诱导NADPH复合物成分的mRNA水平，而且还导致调节成分p47phox向质膜募集。TLR4缺乏阻止了p47phox向质膜的募集，这表明在酒精性肝病中TLR4和NADPH氧化酶激活之间可能存在联系。在其他研究中，NADPH的激活与MyD88依赖性和MyD88依存性TLR4信号通路的激活有关，40–43提示ALD在NADPH氧化酶激活和TLR4之间存在潜在联系。虽然TLR4与Nox4相互作用，9肝细胞中主要的NADPH亚型，44我们观察到Nox4没有变化，但p47phox和其他吞噬细胞相关的NADPH氧化酶成分上调，这表明非实质细胞而非肝细胞中NADPH复合物的激活可能参与ALD。
最后，我们的结果证实了以下报告：在ALD期间，肠道通透性增加导致内毒素水平增加。然而，我们的新发现表明，TLR4缺乏的保护作用并不发生在肠道通透性水平，因为我们发现，无论TLR4或MyD88的表达如何，LPS水平在酒精诱导的肝损伤中适度增加。这些数据还表明，TLR4缺乏的保护作用发生在肝脏中LPS靶向细胞水平，可能发生在库普弗细胞和肝细胞中。
综上所述，我们的数据表明，TLR4在ROS水平和炎症细胞因子诱导的酒精诱导肝损伤中起着关键作用，与常见TLR适配器MyD88的表达无关。这些观察结果表明TLR4诱导的和MyD88诱导的依赖性通路可能在ALD的发病机制中发挥重要作用。
致谢
美国国立卫生研究院（NIH）资助AA11576（发给G.S.）。Istvan Hritz目前隶属于匈牙利布达佩斯Semmelweis大学第二医学系。
缩写：
| ALD公司 | 酒精性肝病 |
| 中高音 | 丙氨酸氨基转移酶 |
| 体重。 | 体重 |
| CYP2E1型 | 细胞色素P450 |
| 干扰素 | 干扰素 |
| 伊利诺伊州 | 白细胞介素 |
| 静脉注射。 | 腹腔内的 |
| 红外线 | 干扰素调节因子 |
| 科 | 淘汰赛 |
| 液化石油气 | 脂多糖 |
| 信使核糖核酸 | 信使RNA |
| 我的D88 | 髓系分化因子88 |
| NADPH公司 | 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 |
| 第4个 | NADPH氧化酶4 |
| 核因子-κB | 核因子κB |
| 外径 | 光学密度 |
| 玫瑰红 | 活性氧物种 |
| TLR公司 | Toll样受体 |
| TNF公司 | 肿瘤坏死因子 |
| TRIF公司 | Toll/IL免疫应答——诱导IFN-β的含结构域衔接子 |
| 重量 | 野生型 |
脚注
潜在利益冲突：无需报告。
其他支持信息可以在本文的在线版本中找到。
工具书类
1酒精性肝病的肝移植。会议记录马里兰州贝塞斯达，12月6–7, 1996. 肝脏移植外科1997年；3:197–350. [公共医学][谷歌学者] 2博德·C、博德·JC。先天免疫系统激活与酒精性肝病：乙醇本身的影响还是乙醇诱导细菌毒素的肠道易位增强？
酒精临床实验研究2005;29(供应商)：166S–171S。[公共医学][谷歌学者] 4南麂AA。Kupffer细胞在酒精性肝炎中的作用.酒精2002;27: 13–15. [公共医学][谷歌学者] 5Dey A，Cederbaum AI。酒精和氧化性肝损伤.肝病学2006;43(补充1)：S63–S74。[公共医学][谷歌学者] 6Arteel通用电气。氧化剂和抗氧化剂在酒精性肝病中的作用.胃肠病学2003;124：778–790。[公共医学][谷歌学者] 7Yin M、Wheeler MD、Kono H、Bradford BU、Gallucci RM、Luster MI等。肿瘤坏死因子α在小鼠酒精性肝损伤中的重要作用.胃肠病学1999;117:942–952. [公共医学][谷歌学者] 8Kono H、Rusyn I、Yin M、Gabele E、Yamashina S、Dikalova A等。NADPH氧化酶衍生自由基是酒精诱导肝病的关键氧化剂.临床研究杂志2000;106:867–872.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 9Park HS、Jung HY、Park EY、Kim J、Lee WJ、Bae YS。前沿：TLR4与NAD（P）H氧化酶4同工酶的直接相互作用对于脂多糖诱导的活性氧生成和NF-κB的激活至关重要.免疫学杂志2004;173:3589–3593. [公共医学][谷歌学者] 10Pacquelet S、Johnson JL、Ellis BA、Brzezinska AA、Lane WS、Munafo DB等。IRAK-4和NADPH氧化酶之间的串扰.生物化学杂志2007;403:451–461.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 11武田K、阿基拉S。TLR信号通路.Semin免疫学2004;16: 3–9. [公共医学][谷歌学者] 12Su GL、Klein RD、Aminlari A、Zhang HY、Steinstraesser L、Alarcon WH等。脂多糖对大鼠枯否细胞的激活：脂多糖结合蛋白和toll样受体4的作用.肝病学2000;31: 932–936. [公共医学][谷歌学者] 13Szabo G、Dolganiuc A、Mandrekar P。模式识别受体：肝脏疾病的当代观点.肝病学2006;44:287–298. [公共医学][谷歌学者] 14Uesugi T、Froh M、Arteel GE、Bradford BU、Wheeler MD、Gabele E等人。脂多糖结合蛋白在小鼠早期酒精性肝损伤中的作用.免疫学杂志2002;168:2963–2969. [公共医学][谷歌学者] 15Yin M、Bradford BU、Wheeler MD、Uesugi T、Froh M、Goyert SM等。降低CD14缺陷小鼠早期酒精诱导的肝损伤.免疫学杂志2001;166:4737–4742. [公共医学][谷歌学者] 16Uesugi T、Froh M、Arteel GE、Bradford BU、Thurman RG。Toll样受体4参与小鼠早期酒精性肝损伤的机制.肝病学2001;34:101–108. [公共医学][谷歌学者] 17卡瓦伊·T、阿基拉·S。TLR信号.Semin免疫学2007;19:24–32. [公共医学][谷歌学者] 18Palsson-McDermott EM，O'Neill LA。脂多糖受体Toll-like受体-4的信号转导.免疫学2004;113:153–162.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 19Romics L Jr、Kodys K、Dolganiuc A、Graham L、Velayudham A、Mandrekar P等人。小鼠非酒精性脂肪肝NF-kappaB和过氧化物酶体增殖物激活受体的多样性调节.肝病学2004;40:376–385. [公共医学][谷歌学者] 20Nagamatsu S、Kornhauser JM、Burant CF、Seino S、Mayo KE、Bell GI。大脑中葡萄糖转运蛋白的表达。小鼠GLUT3、脑促葡萄糖转运蛋白亚型的cDNA序列及原位杂交鉴定表达位点.生物化学杂志1992;267: 467–472. [公共医学][谷歌学者] 21第CP天。决定酒精性肝病和非酒精性脂肪性肝病的基因或环境.肝脏国际2006;26：1021–1028。[公共医学][谷歌学者] 22Deaciuc IV、Arteel GE、Peng X、Hill DB、McClain CJ。灌胃饮酒大鼠肝脏的基因表达.酒精2004;33:17–30. [公共医学][谷歌学者] 23Colmenero J、Bataller R、Sancho-Bru P、Bellot P、Miquel R、Moreno M等人。酒精性肝炎患者候选基因的肝脏表达与疾病严重程度的相关性.胃肠病学2007;132:687–697. [公共医学][谷歌学者] 24Romics L Jr、Mandrekar P、Kodys K、Velayudham A、Drechsler Y、Dolganiuc A等。酒精性脂肪肝脂多糖敏感性的增加与瘦素缺乏和TLR4或TLR2 mRNA表达无关.酒精临床实验研究2005;29:1018–1026. [公共医学][谷歌学者] 25Dey A，Cederbaum AI公司。酒精和氧化性肝损伤.肝病学2006;43(补充1)：S63–S74。[公共医学][谷歌学者] 26Lu Y，Cederbaum AI公司。吡唑增强小鼠脂多糖诱导的肝损伤：细胞色素P450 2E1和2A5的作用.肝病学2006;44:263–274. [公共医学][谷歌学者] 27Abdulla D、Goralski KB、Renton KW。细胞色素P450 2E1在LPS诱导的大鼠炎症过程中的调节.毒理学应用药理学2006;216:1–10. [公共医学][谷歌学者] 28Thakur V、Pritchard MT、McMullen MR、Wang Q、Nagy LE。慢性乙醇喂养增加大鼠Kupffer细胞中脂多糖对NADPH氧化酶的激活：活性氧增加在LPS刺激的ERK1/2激活和TNF-α生成中的作用.白细胞生物学杂志2006;79: 1348–1356.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 29Quinn MT，Gauss KA公司。中性粒细胞呼吸爆发氧化酶的结构与调控：与非吞噬细胞氧化酶的比较.白细胞生物学杂志2004;76：760–781。[公共医学][谷歌学者] 30博科公司总经理，Knaus UG。NADPH氧化酶：不再只是白细胞！
生物化学科学趋势2003;28:502–508. [公共医学][谷歌学者] 31De Minicis S、Bataller R、Brenner DA。肝脏中的NADPH氧化酶：防御型、进攻型还是纤维化？
胃肠病学2006;131:272–275. [公共医学][谷歌学者] 32Cheng G、Cao Z、Xu X、van Meir EG、Lambeth JD。gp91phox同源基因：Nox3、Nox4和Nox5的克隆和组织表达.基因2001;269:131–140. [公共医学][谷歌学者] 33O'Neill LA，Bowie AG公司。五口之家：Toll样受体信号传导中含有TIR结构域的衔接子.Nat Rev免疫学2007;7:353–364. [公共医学][谷歌学者] 34Gobejishvili L、Barve S、Joshi-Barve S、Uriart S、Song Z、McClain C。慢性乙醇介导的cAMP减少可激发巨噬细胞增强LPS诱导的NF-kappaB活性和TNF表达：与酒精性肝病的相关性.美国生理学杂志胃肠测试肝脏生理学2006;291：G681–G688。[公共医学][谷歌学者] 35Matsumoto H、Sato Y、Azumi J、Kato J、Niitsu Y、Tamaki K。内毒素在乙醇激活大鼠肝细胞NF-kappaB中的作用.酒精临床实验研究2002;26(供应商)：6S–10S。[公共医学][谷歌学者] 36Bagchi A、Herrup EA、Warren HS、Trigilio J、Shin HS、Valentine C等。TLR激动剂之间协同、启动和耐受中的MyD88依赖性和MyD88诱导依赖性通路.免疫学杂志2007;178:1164–1171. [公共医学][谷歌学者] 37Jiang Z、Georgel P、Du X、Shamel L、Sovath S、Mudd S等。MyD88-independent LPS信令需要CD14.自然免疫2005;6: 565–570. [公共医学][谷歌学者] 38McKim SE、Gäbele E、Isayama F、Lambert JC、Tucker LM、Wheeler MD等。酒精诱导肝损伤需要诱导型一氧化氮合酶：对敲除小鼠的研究.胃肠病学2003;125:1834–1844. [公共医学][谷歌学者] 39McMullen MR、Pritchard MT、Wang Q、Millward CA、Croniger CM、Nagy LE。早期生长反应蛋白-1转录因子对乙醇诱导的小鼠脂肪肝损伤至关重要.胃肠病学2005;128:2066–2076.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 40Li Q、Harraz MM、Zhou W、Zhang LN、Ding W、Zhang Y等人。Nox2和Rac1调节TRAF6向胞内白细胞介素-1受体复合体的H2O2依赖性募集.分子细胞生物学2006;26:140–154.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 41Laroux FS、Romero X、Wetzler L、Engel P、Terhorst C。前沿：MyD88控制吞噬细胞NADPH氧化酶功能和对革兰氏阴性菌的杀灭.免疫学杂志2005;175:5596–5600. [公共医学][谷歌学者] 42Kumatori A、Yang D、Suzuki S、Nakamura M。STAT-1和IRF-1在干扰素γ诱导的gp91（phox）基因转录中的协同作用.生物化学杂志2002;277:9103–9111. [公共医学][谷歌学者] 43Luo W，Skalnik总经理。干扰素调节因子-2指导gp91phox启动子的转录.生物化学杂志1996;271:23445–23451. [公共医学][谷歌学者] 44Murillo MM、Carmona-Curenca I、Del Castillo G、Ortiz C、Roncero C、Sanchez A等人。肝细胞转化生长因子β激活NADPH氧化酶通过核因子-κB依赖机制介导表皮生长因子受体配体上调.生物化学杂志2007;405:251–259.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 
