内质网相关蛋白靶向轮状病毒感染神经元的轴突和树突

摘要

1.简介

将新合成的分子正确传递到轴突和体干结构域是维持神经元结构和功能的基础，但神经元内靶向蛋白质的机制仍有待更详细地阐明。在上皮细胞中，病毒蛋白利用细胞的代谢机制，为细胞内蛋白质转运提供了有效的标记工具，因为它们可以与细胞的内源性蛋白质区分开来，因此可以追踪蛋白质从其来源地到目的地。包膜核糖核酸（RNA）病毒的某些蛋白质靶向极化上皮细胞的顶面，而其他蛋白质则靶向基底外侧结构域。这种选择性的病毒蛋白分布使蛋白质分类机制的研究成为可能20,38.

病毒蛋白的追踪现在也被用于神经外胚层细胞体内和在体外在这些研究中，已经揭示了病毒向血浆结构域转移的不对称性5,8,19,22,23,27,49为了这些目的，在质膜上萌芽的病毒通常被用作报告病毒，但在细胞内膜上聚集的病毒受到了越来越多的关注[19]在使用在内质网（ER）中聚集的轮状病毒进行的一系列研究中，我们观察到两种病毒蛋白保留在内质网上[28]，显示它们在神经元中的分布差异。非结构蛋白NSP4留在细胞体内，而外衣壳蛋白VP7也出现在轴突中。尽管VP7是一种管腔内质网相关糖蛋白，但其轴突转运不能被布雷费尔丁a抑制[50]这是一种破坏高尔基体组织的药物[7]表明它可以绕过高尔基体到达轴突。本研究旨在比较这些新形成的病毒蛋白的外观与内源性ER染色蛋白在神经元中的分布。

在上皮细胞中，内质网和中间区室，后者参与平滑内质网和上皮细胞之间的分子转移顺式高尔基体蓄水池的成分是不均匀的12,33某些可溶性ER蛋白具有KDEL序列信号，这被认为可以通过受体介导的方式从ER后区提取蛋白质，而其他ER-染色蛋白，例如前面描述的两种轮状病毒蛋白，不包含此序列9,28在本研究中，我们比较了含有KDEL序列的不同ER蛋白与缺乏该序列的蛋白在神经元中的分布。前者包括管腔伴侣免疫球蛋白重链结合蛋白（BiP）1,10,11，蛋白质二硫异构酶（PDI）[11]钙网蛋白也是一种主要的钙²⁺-非肌肉细胞中的结合蛋白29,30,42Calnexin是一种ER-跨膜蛋白，具有细胞质RKPRRE检索序列6,47.

因为神经元中的细胞间蛋白分布只接受了有限的研究[22]，我们还检查了这些蛋白质的定位。ER-Golgi-in-intermediate compartment-protein-53（ERGIC-53）是一种在高尔基体和内质网之间循环的完整膜蛋白[40]rab2是一种GTP-结合蛋白，催化细胞内小泡和靶膜的对接35,46我们研究的一个重点是将分子靶向轴突，即背根神经节（DRG）神经元的使用，因为它们厚厚的轴突束易于识别和分析。为了评估树突中蛋白质的外观，我们使用了海马神经元的培养物。

2.材料和方法

3.结果

3.1. DRG神经元

在本研究中，我们使用了两种类型的DRG培养物。一种类型的特征是DRG神经元附着在胶原基质上，并在补充血清的培养基中维持。神经元长时间保存良好，在培养12~14天后使用。然而，尽管使用了抗有丝分裂剂，非神经元细胞往往会过度生长神经元及其过程。在另一种类型的DRG培养中，细胞接种在Matrigel底物上，虽然Matrigel底物能有效促进神经元突起的生长，但只能在有限的时间内维持培养。这些培养物保持在无血清培养基中，这显著减少了非神经元细胞的存在，这使得可以对轴突进行清晰的观察。这些培养物在培养2天后用于感染。在这两种培养中，DRG神经元的特征是存在发育良好的轴突，轴突通常形成从细胞体伸出的粗束。轴突突用tau抗体标记(图1A） 而MAP2抗体的免疫标记仅限于两种培养物中的细胞体(图1B和C）。轮状病毒感染后，这些微管相关蛋白的分布保持不变。轮状病毒VP7糖蛋白出现在细胞体和轴突中(图1D） 但即使在感染后48小时，NSP4蛋白也仅限于细胞体(图1E和F）。

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图1

DRG神经元培养2天，轴突tau蛋白免疫阳性（A）；而MAP2仅限于胞体（B）。在轮状病毒感染的DRG神经元（感染后24小时）中，VP7蛋白的免疫标记出现在细胞体和轴突（D）中。轮状病毒非结构蛋白NSP4仅限于细胞体（E）。未显示轴突免疫标记的DRG神经元（B和E）用Nomarski干涉对比显微镜观察（C和F）。比例尺=25μm。

管腔内源性ER相关蛋白在分布上表现出明显的异质性：钙网蛋白出现在细胞体和轴突中(图2A） ，而BiP(图2B和C）和PDI，以及包含KDEL序列的肽(图2E和F）仅见于神经元的胞体。使用两种不同的PDI单克隆抗体进行免疫标记没有差异。细胞体和轴突中均可见跨膜ER相关蛋白calnexin(图2D） ●●●●。这也是部分间蛋白rab2免疫阳性的情况，在远端轴突中更为突出(图2G） ●●●●。另一方面，另一种组间蛋白ERGIC-53仅限于神经元胞体周(图2H和I）。甘露糖苷酶II抗体标记了细胞体内的蓄水池（参见图4A） ●●●●。

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图2

培养2天后，DRG神经元的免疫荧光显示内源性ER相关蛋白和部门间蛋白的定位。钙网蛋白（A）、钙连蛋白（D）和rab2（G）均出现在细胞体和轴突中。KDEL肽序列（B）、BiP（E）和ERGIC-53蛋白（H）仅见于胞周；这些神经元的轴突在Nomarski显微镜下可见（C、F和I）。比例尺=25μm。

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图4

DRG神经元免疫标记-顺式/共焦激光扫描显微镜（A）观察到内侧高尔基体相关甘露糖苷酶II抗体显示核周池堆积；海马神经元的甘露糖苷酶II（强荧光）和MAP2（弱荧光）双重标记（B）；轮状病毒感染的海马神经元胞体和树突（C）中VP7和rab2颗粒明显不同；VP7和钙网蛋白免疫标记颗粒在细胞体和树突（D）中明显重叠。比例尺=25μm。

在双标记实验中，VP7和rab2免疫反应性囊泡彼此不同，免疫阳性没有重叠。相反，在神经细胞体和轴突中，VP7的免疫阳性与钙网蛋白和钙连蛋白的免疫阳性广泛重叠。BiP、PDI、KDEL-肽序列和ERGIC-53的免疫阳性均局限于细胞体，并与轮状病毒NSP4蛋白的免疫阳性重叠。即使在感染48小时后，这些蛋白也没有出现在轴突中。

3.2. 海马神经元

海马神经元显示出树突和轴突突起的广泛网络。树突突出，可以通过其锥形和锐角分枝来识别。神经细胞体和树突均用MAP2抗体进行免疫标记（参见图4B） ●●●●。轴突很薄，由于胶质细胞的过度生长，它们比粗大突出的树突更难区分。在轮状病毒感染的神经元中，VP7免疫阳性物质在胞体周围和树突（第三分裂以外）和轴突中均可见明显且相对较大的颗粒(图3A；图4C和D）。颗粒在树突状分支部位聚集成较大的群。NSP4免疫标记在定位于细胞体和树突的颗粒中发现，它们也延伸到第三分裂以外(图3B） 但在轴突样结构中检测不到。钙网蛋白免疫阳性同样延伸到树突和轴突(图3C） 而其他蛋白质（BiP和PDI）和含有KDEL序列的肽仅限于树突的细胞体和近端部分。用钙网蛋白抗体进行免疫标记显示，钙网蛋白类似地延伸到树突和轴突。在海马神经元中，针对部分间蛋白rab2和ERGIC-53的抗体显示出明显的免疫阳性。前者发现于树突第三分裂以外的轴突中。ERGIC-53标记也出现在树突的第一个分支点以外，但不在轴突中。甘露糖苷酶II标记的脑池主要局限于细胞体(图3D类图4B） ●●●●。

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图3

海马神经元内源性蛋白和轮状病毒蛋白VP7和NSP4的免疫荧光定位。VP7蛋白延伸到树突中（A）。NSP4抗体标记大部分体角质结构域（B）；而那些对抗钙网蛋白的药物也标记为轴突样过程（箭头）（C）。甘露糖苷酶II（D）局限于核体周池。比例尺=25μm。

在双标记实验中，轮状病毒VP7蛋白和内源性rab2出现在不同的囊泡池中，没有明显重叠(图4C） ●●●●。另一方面，钙网蛋白和钙连蛋白显示，两者在细胞体和过程中与VP7的免疫阳性反应存在广泛重叠(图4D） ●●●●。然而，与VP7相比，这两种内源性蛋白在树突树中的表达更为丰富。因此，免疫染色重叠出现在仅对钙网蛋白或钙连蛋白呈免疫阳性的树突间颗粒。轮状病毒NSP4蛋白和内源性BiP、PDI和KDEL肽序列的双重标记表明，病毒蛋白的免疫阳性与胞体内和第一个树突状分支位点的内源性蛋白的免疫活性重叠。

4.讨论

ER保留的两种蛋白质BiP和PDI是可溶性的，在蛋白质折叠中起到伴侣的作用[11]虽然最初被描述为仅限于粗略内质网，但这两种蛋白质似乎都位于整个内质网的管腔中，因此被认为是内质网一般标志物[41]如之前和本研究所示，这两种蛋白质都存在于神经元中。Villa等人。52,53据报道，BiP免疫反应从细胞体延伸到大鼠Purkinje细胞的树突状棘体内在超微结构水平上，甚至在小脑皮层的轴突中也能检测到该分子。在培养的海马神经元中，Krijnse-Locker等人。[22]还观察到一些BiP和PDI免疫阳性颗粒出现在薄的轴突样结构中，而KDEL序列的受体几乎局限于细胞体。这与目前的观察结果形成对比，这两种分子以及KDEL肽序列似乎没有进入DRG神经元的轴突，而是延伸到海马神经元的树突。然而，另一种可溶性管腔ER蛋白，钙网织蛋白，出现在DRG的轴突中，尽管该蛋白也含有KDEL序列。钙网蛋白是非肌肉细胞中一种主要的钙结合蛋白29,30,42.蛋白质是半乳糖基化的，这表明它必须通过反式高尔基体池，半乳糖基化发生的地方，在被取回内质网之前[34]据推测，不同的ER蛋白可以逃逸到不同的ER后腔室，因此，ER保留的蛋白质可以沿着分泌途径从一系列位置逐步恢复16,24除钙结合作用外，钙网蛋白还起到内质网伴侣的作用，在内质网中与跨膜内质网蛋白钙连蛋白协同作用，控制糖蛋白的折叠三,13calnexin的细胞质尾部携带一个RKPRRE序列，该序列作为将该蛋白定位到ER的信号。在本研究中，这两个伴侣不仅共同定位于躯体软骨结构域，而且也共同定位于轴突，这证实了先前关于这些蛋白在大鼠和猴小脑神经元中分布的观察17,53.

中间隔室是一个复杂的小管-囊泡组织的广泛结构，它将分子从内质网转移到高尔基体32,33.该隔室中的蛋白质可能占据不同的亚区[21]病毒蛋白已被用作蛋白质通过中间小泡运输的标记物，某些病毒也可以在这个位置组装和成熟。例如，乙型肝炎病毒表面抗原与rab2共定位[15]以及带有rab2和p58的水泡性口炎病毒G蛋白26,36一种冠状病毒，即小鼠肝炎病毒，萌芽进入含有rab2和p58的中间隔室小泡，也进入含有PDI的结构[21]包裹并最终在细胞内痘苗病毒颗粒周围形成双层膜的小泡可能代表中间隔小泡31,43在本研究中，内源性中间隔室蛋白ERGIC-53仅局限于细胞体和树突，而rab2同时存在于树突和轴突中。后一项观察与Krijnse-Locker等人对海马神经元的研究形成对比。[22]其中rab2在轴突中未检出。在DRG轴突中，小的rab2囊泡没有与VP7蛋白共定位，这表明在轴突中，中间隔室囊泡也不同于ER。rab2属于GTP结合蛋白家族，它使用GTP水解来催化识别分子在细胞内小泡和靶膜对接中的结合35,46.Rab2被认为参与了ER和顺式高尔基体池及其在缺乏高尔基体的轴突中的出现是意料之外的。在培养的大鼠胚胎神经元（取自顶盖和中脑腹侧）中，注射纯化的rab2蛋白可增强细胞的粘附性，增加树突样神经突起的生长。这表明该蛋白可能在生长锥水平参与囊泡与质膜的运输和融合[2].

在轮状病毒感染的神经元中，ER相关蛋白的分布与对照组相同，表明神经元极性在观察期间保持不变。两种轮状病毒蛋白VP7和NSP4均缺乏KDEL序列，它们的分布存在显著差异。NSP4蛋白呈极性分布，出现在神经元的体脂蛋白结构域，而VP7蛋白也出现在轴突中。NSP4蛋白的分布似乎与其他ER相关蛋白不同。它没有进入轴突，而是延伸到树突，超过BiP和PDI水平。NSP4是一种非结构跨膜粗糙内质网病毒蛋白。在病毒形态发生过程中，它被认为是胞浆中亚病毒颗粒的受体，通过内质网膜介导其出芽[9]将含有高甘露糖的NSP4保留到粗ER中的基序尚未确定。除了作为受体的作用外，NSP4还被认为可以调节感染细胞的细胞内钙水平。这可能促进在病毒成熟过程中获得正确的蛋白质结构，但也可能与细胞毒性有关[45].

VP7在轴突和树突的分布与ER相关的钙网蛋白和钙连蛋白相似，但与rab2不同。以前，我们观察到VP7在到达轴突的过程中并没有通过高尔基体[50]内切H敏感性VP7保留在内质网中的机制仍然是细胞生物学中一个有趣的问题，因为它不包含KDEL或RKPRRE序列，也不跨越膜。尽管VP7和钙网蛋白在轴突ER样结构中的定位可能相似，但它们到达该隔室的途径可能不同；钙网织蛋白通过高尔基体转移以变成半乳糖基化的，并且VP7被直接转移。在解剖学上，神经细胞体的粗面内质网和轴突的光滑内质网之间的直接通讯被反复提出4,14,25,37因此，VP7可能是研究这种向轴突传递分子的途径的报告员。最近，通过使用轮状病毒，在上皮细胞中也发现了一种绕过高尔基体的非经典的小泡运输至顶端细胞表面的途径[18].

从这些研究来看，神经元中的内质网具有异质性成分。某些内质网蛋白在通过高尔基体转移后可能进入轴突，而另一些可能有直接的通讯。轴突中的钙网蛋白可能是一种钙结合蛋白，但由于它与钙连蛋白有关，因此也可能是通过轴突运输的蛋白质的伴侣。由于病毒蛋白相对容易被基因操纵，它们为将来的研究提供了有用的工具，以剖析蛋白质向内质网各腔室传递的机制。

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