中胚层蛋白在轴形成过程中的关键作用，上皮-间充质转化与内皮层规范鼠标

摘要

介绍

多种信号通路的协调活动包括TGFβ/结节、Wnt和Fgfs控制胚胎轴和调控小鼠早期胚胎原肠胚形成过程中胚层的形成（审核人Beddington和Robertson，1999年;Tam和Loebel，2007年)。不久之后三个原代细胞间的植入相互作用谱系，即滋养层（TE）、外胚层（胚胎的祖细胞正常）和内脏内胚层（VE）建立初始近轴（PD）。前后轴（AP）是后续细胞逐渐形成的结果移动。因此，在远端诱导VE细胞的特殊群体向胚胎未来的前侧迁移形成前侧内脏内胚层（AVE）。当离散总体时，AP轴变得明显诱导近端外胚层细胞形成中胚层并启动原始细胞胚胎背面的条纹（PS）形成（审查人贝丁顿和罗伯逊，1999年;Lu等人，2001年;Tam和Loebel，2007年)。在接下来的12-24小时内，PS逐渐伸长到外胚层的远端。命运图研究已经表明，细胞从条纹附近分层会导致胚外中胚层。侧板和近轴中胚层从中等水平，而位于前原始条纹（APS）的细胞产生中轴肠系膜前体，而后又产生前体最终内胚层（ADE）和索前板中胚层（PCP），以及节点及其衍生物脊索的祖先。

我们和其他人之前已经证明分级Nodal/Smad2信号控制小鼠AP轴的图案。因此，节点表示为外胚层激活VE中的Smad2并促进AV E的形成(Waldrip等人，1998年;Brennan等人，2001年)。AVE的后续迁移是也取决于来自外胚层的节点信号(Norris等人，2002年)（审核人Tam和Loebel，2007年)。原肠胚形成期间沿着PS近端轴的中胚层和内胚层受分级调节结节活动水平(文森特等人。，2003; Ben-Haim等人，2006年）。Nodal/Smad2信令的最高级别是有必要指定APS衍生工具，这些衍生工具有选择地产生内胚层（DE）和PCP中胚层(文森特等人。，2003;Dunn等人，2004年).重要的是，DE祖细胞的规格也取决于转录与Smad4合作(Chu等人，2004年)和福克斯H1(Hoodless等人，2001年;山本等人，2001年).

T-box转录因子中胚层蛋白(脱中胚蛋白)已经是在胚层诱导和图案形成中起重要作用(Ryan等人，1996年;Ryan等人，2000年;Russ等人。，2000;Bruce等人，2003年;Bjornson等人，2005年)。最初确定于爪蟾作为早期的“全中胚层”标记基因，脱中胚蛋白被证明对中胚层是必要的和充分的诱导(Ryan等人，1996年)。至于激活素/结节配体，强制表达脱中胚蛋白戴着动物帽以剂量依赖的方式诱导多种中胚层标记基因背侧腹侧中胚层(Ryan等人。，1996).脱中胚蛋白斑马鱼过度表达导致异位组织者基因的表达和次生体轴的诱导，与母亲的角色脱中胚蛋白管理组织者组成(Bruce等人，2003年)。总的来说斑马鱼的实验表明脱中胚蛋白可能不需要中胚层的形成本身，但在内胚层中起着重要作用规范。Eomes与GATA5和同源域蛋白Bonnie和已知Clyde可以激活必需的Sox转录因子的表达卡萨诺瓦，内胚层形成所必需的(比约恩森等人，2005年)。因此，在低等脊椎动物中，脱中胚蛋白出现在…的下游节点规范这两个领域的发展中胚层和内胚层细胞谱系。

在鼠标中，脱中胚蛋白转录本最初表达在胚泡期TE局限于胚胎外外胚层（ExE）植入后。脱中胚蛋白随后诱导表达在明显条纹形成之前的近端后部外胚层内。期间原肠胚形成，脱中胚蛋白成绩单仅限于PS和新生中胚层，并局限于APS，同时形成形态节点，然后突然下调(Ciruna和Rossant，1999年;Hancock等人，1999年;Russ等人。，2000).脱中胚蛋白对TE的发展至关重要血统和脱中胚蛋白失能突变体植入时的阻滞(Russ等人，2000年;Strumpf等人，2005年)。在四倍体嵌合体中，脱中胚蛋白-ES细胞缺陷导致中胚层有限，但这些胚胎的发育受到严重干扰，很难描述离散组织缺损(Russ等人。，2000).

进一步探索脱中胚蛋白胚胎本身的功能，我们已经生成了脱中胚蛋白条件等位基因。精心设计的Sox2.Cre公司应变，应变(Hayashi等人al.，2002年)用于删除脱中胚蛋白选择性地外胚层衍生物。脱中胚蛋白初始AP不需要中胚层标记的模式化或诱导。然而，新生中胚层未能分层并远离原始条纹。中胚层的失败迁移与不能有效下调E-cadherin和经历上皮-间质转换（EMT），但令人惊讶的是E-cadherin上游调节器Fgf8型及其下游目标蜗牛以正常水平表示。引人注目的是，在缺少脱中胚蛋白胚完全在外胚层中表达缺乏明确的内胚层。至于Smad2公司(Tremblay等人，2000年)，嵌合体，埃姆斯-空ES细胞可以有效地促进中胚层谱系，但完全是排除在DE之外。我们还描述了发育异常Eomes/Nodal公司双杂合子。胚胎阻滞的一个子集由于未能旋转初始PD轴而提前；其他形成AP轴，但是未能指定APS衍生工具。此外，有些出生后仍能存活。我们展示了这些不同的表型反映了脱中胚蛋白和节点不同组织部位的相互作用。我们的实验共同证明那个脱中胚蛋白在AP轴形成、EMT和DE中起着关键作用规范。

材料和方法

的生成脱中胚蛋白条件等位基因和无效等位基因

靶向载体包含8.25kbHpaI-HpaI型的碎片脱中胚蛋白基因座，具有单个LoxP和XbaI公司站点集成在后面的III站点内含子1和LoxP侧翼PGK.hygro选择盒集成在SacI公司内含子5的位点(图。1)。这两个同源区域两侧都有阴性选择磁带（PGK.DTA和pMCI.TK）。电穿孔线性化靶向载体Southern对CCE ES细胞和耐药ES细胞集落进行了筛选用3′外探针在N个coI-消化DNA（野生型等位基因5.7kb；靶向等位基因3.5kb）。单身人士的存在LoxP位点通过内部探针在Xbal公司-消化的DNA。生成条件和null用pMCI转染等位基因、正确靶向克隆。Cre和通过Southern blot使用3′外探针筛选产生的亚克隆后面的III-digested DNA。三个独立的正确目标携带条件等位基因的ES细胞克隆用于产生生殖系嵌合体。F1后代通过Southern印迹进行基因分型，然后对动物进行基因分型通过PCR进行基因分型。PCR基因分型在59°C退火温度，在标准条件下检测野生型（313 bp）、floxed（356 bp）和null configuration（435 bp）使用以下方法引物：正向引物5′-CCTTACTCCTAGGCACCTGTAGC-3′；颠倒引物1 5′-AGCTCAACCGACTTCTTTCTGCTC-3′；反素数25′-AATATGTCCTCAGGGATGATGACTC-3′。要生成脱中胚蛋白突变的ES细胞，正确靶向的ES细胞瞬时转染Cre以生成空配置和接受第二轮靶向和Cre切除。

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图1

Cre介导切除一个新的脱中胚蛋白条件等位基因结果在一个空突变中。(A类)有条件地停用脱中胚蛋白，编码Tbox结构域的外显子2-5两侧LoxP站点（蓝色箭头）和LoxP侧翼的可选标记(PGK.湿度计）在内含子5-6中介绍。ES细胞克隆通过Southern blot在Ncol公司-消化的DNA和5′LoxP现场的存在于Xbal公司-消化的DNA如图所示。(B类)正确定向的克隆受到Cre重组酶的瞬时表达。(C类)印地语II消化的DNA通过Southern blot分析以检测各种配置。绿色箭头代表PCR的起始位点基因分型。(D类)培养的囊胚来自脱中胚蛋白 ^N个/+72年后对交叉进行分析小时。鉴于野生型和脱中胚蛋白 ^N个/+杂合的囊胚发育出具有典型巨细胞的滋养层细胞（箭头所示），脱中胚蛋白 ^无胚泡不能形成外生长（一） 或显示巨细胞数量严重减少（II）。(E类)用引物对断奶龄小鼠尾部DNA进行多重PCR分型如B所示，表明脱中胚蛋白 ^CA/CA公司和脱中胚蛋白 ^CA/N公司动物。H、，印地语二;血红蛋白，HpaI；Nc中，Ncol公司; Sa、，Sa公司d；X、，Xbal公司.

结果

损失脱中胚蛋白外胚层的功能破坏中胚层细胞迁移和DE形成

停用脱中胚蛋白在胚胎中我们利用了父亲继承的Sox2.Cre公司转基因，特别是从早期着床阶段开始以内细胞质量（ICM）表达(Hayashi等人，2002年).脱中胚蛋白 ^N个/+ ; Sox2.Cre公司男性交叉至脱中胚蛋白 ^CA/CA公司收集的雌性和胚胎来自E6.5-E7.5。在E6.5脱中胚蛋白 ^{不适用于CA};Sox2.Cre公司胚胎（以下称为埃姆斯-缺陷胚胎）在表型上无法区分来自控制室友。全山原位杂交（WISH）分析显示初始AP图案不受埃姆斯。因此，AVE正常形成，如表达十六进制的和证书1(图2A-D）。类似地，后标志基因例如重量3(图2E、 F）和短梗(图2一、 J）表示正常情况下。

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图2

表晶特异性脱中胚蛋白缺失阻断原肠胚形成原始条纹阶段。(A-F公司)整体原位杂交带有AVE的分子标记(十六进制和证书1)和后部外胚层(重量3)在E6.5显示了正确的AP轴规格脱中胚蛋白 ^{不适用于CA};Sox2.Cre公司突变体胚胎。(G-H’)在E7.5，脱中胚蛋白外胚层突变体显示出外胚层明显的后部增厚，并且缺乏中胚层组织层如组织切片所示。(我，J型)后部（短肢/运动内衣)以及(K-N公司)中间物(混合物1，Tbx6)条纹标记以脱中胚蛋白外胚层突变体，但节点由于缺乏嘘表达(O（运行），P（P）)。(问，R（右）)一致扫描电子显微镜显示，在突变胚胎的末端（方框区域表示节点形成区域）。(S公司，吨)相反其他2表达式域在中展开脱中胚蛋白突变体。(U-X型)DE标记的E7.5表达证书1和AME标记福克斯2迷失方向(Y（Y），Z轴)VE标记的表达法新社不能局限于胚胎外区域。

从E7.0开始，脱中胚蛋白突变胚胎可以通过PS异常增厚导致形状不规则(图2G、 H）。与野生型外胚层相比细胞被诱导形成中胚层，经历EMT并从中胚层迁移向胚胎更外侧和前部的条纹(图2G′），突变胚胎显示具有间充质形态的细胞在PS和E7.5时VE和外胚层之间完全没有中胚层细胞(图2H′）。此外外胚层变得不规则增厚，并从E7.5以上。到头皮晚期，突变胚胎含有多个囊性细胞外胚层内陷，完全缺乏中胚层的离散层（数据不是如图所示）。

Brachyury和英国标准普尔4后胚层和胚外胚层中胚层标记分别强烈表达于突变胚胎(图2一、 J和数据不如图所示）。Tbx6型和混合物1，中间PS标记被表达(图2K-N）在强度略有降低。然而，简短的表达式无法扩展在前面(图2J） 和突变胚胎完全缺乏APS衍生物标记的表达，例如证书1，嘘和福克斯2(图2O、 P、U-X）。这并不是应得的未能建立前身份，因为其他2表达模式表明神经外胚层发育正常(图2S、 T）。然而其他2表达结构域通常局限于前部胚胎区域在脱中胚蛋白外胚层突变胚胎。同样，十六进制和证书1在AVE中E6.5处正常表达，但通常标记新生DE的相应表达域缺失(图2A-D）。评估是否缺席DE标记仅反映发育迟缓，我们分析了内胚层标记在以后的时间点。野生型胚胎中E7.5福克斯2是表达于淋巴结和前肠系膜（AME），而证书1标记ADE细胞(图2U、 W）。这两个表达域在突变株中均未检测到胚胎(图2五、 X），演示DE完全缺失。与APS和DE表达失败一致标记，扫描电子显微镜分析显示突变胚胎不能发展形态节点(图。2Q、 R）。

在野生型胚胎中，当E7.5时，VE被移向近端来自远端外胚层的DE细胞的胚外区向前和近距离迁移。探讨内胚层的起源脱中胚蛋白突变体，我们进行了体内命运定位实验。ROSA26^R（右） lacZ公司报告基因(索里亚诺，1999)被引入脱中胚蛋白 ^CA/CA公司背景。在两人交配后恢复的胚胎中脱中胚蛋白 ^N个/+ ; Sox2.Cre公司男性和脱中胚蛋白 ^CA/CA公司 ;俄罗斯26^{R/R（右/右）}女性，lacZ公司表达式已激活在外胚层谱系中。在野生型胚胎中E7.75时lacZ公司-阳性细胞对应于DE(图3A-A”）形成鲜明对比脱中胚蛋白内胚层缺乏的突变体lacZ公司活动，因此代表VE近距离移位(图3B-B”）。与此解释一致，Afp公司-VE阳性细胞在对照胚胎中仅覆盖胚外组织，而Afp公司在内胚层中均匀表达脱中胚蛋白突变体(图。2Y、 Z）。总的来说，这些实验证明脱中胚蛋白功能损失会破坏DE的规范。

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图3

Eomes突变的外胚层细胞不能参与内胚层。外胚层通孔的命运图分析Sox2.Cre公司和俄罗斯26^R（右）报告基因显示外胚层（箭头）覆盖在胚胎上(A-A“)E7.75控制胚胎完全来源于ROSA26阳性的外胚层细胞。(B-B“)脱中胚蛋白 ^{不适用于CA};Sox2.Cre公司; 俄罗斯26^对/+突变体外胚层细胞失败有助于内胚层（箭头）。偶尔，单身lacZ公司-在内胚层中发现阳性细胞，大多数可能是由于来自Sox2.Cre公司转基因。

脱中胚蛋白对E-cadherin的下调至关重要电子病历

在脱中胚蛋白-胚胎中胚层诱导不足启动，但细胞无法从条纹中迁移并在胚胎后侧(图4A） ●●●●。这种表型很容易让人联想到由于不能下调上皮细胞粘附分子E-cadherin(Ciruna和Rossant，2001年)。E-cadherin是在整个外胚层中强烈表达，但在中胚层中特别缺失原肠胚形成期间PS内的细胞。Fgf8-介导的转录阻遏因子蜗牛(Ciruna和Rossant，2001年)，直接沉默E-钙粘蛋白转录(Batlle等人。，2000;Cano等人，2000年).此外，E-钙粘蛋白降解降低表达水平(Zohn等人，2006年)。我们分析了E-cadherin免疫荧光染色在突变胚胎中的表达。有趣的是PS部位积聚的独特组织块维持E-cadherin的表达水平与外胚层和上胚层类似五(图4B） ●●●●。E-钙粘蛋白的持久性可能反映持续转录和/或蛋白质缺乏退化。为了检验这些可能性，我们分析了Fgf8型，蜗牛，喷洒2和E-cadherin转录物E7.5野生型和突变型胚胎。有趣的是，两者都是Fgf8型和它的目标蜗牛(Ciruna和罗桑特，2001)和喷洒2(Nutt等人，2001年)在PS中稳健表达突变胚胎(图4C、 D）。尽管如此，E-cadherin转录没有下调(图4D） ●●●●。

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图4

埃姆斯-缺乏外胚层表现正常Fgf8/蜗牛表达，但未能下调E-cadherin。(A类)横截面扫描电子显微镜E7.5控制和脱中胚蛋白突变胚胎显示间充质突变胚原始条纹处积累的细胞形态。脱中胚蛋白突变体缺乏中胚层细胞层。(B类)使用抗E-钙粘蛋白的免疫荧光染色E7.5中的抗体脱中胚蛋白突变胚胎显示PS期E-cadherin下调。而野生型胚胎的中胚层没有E-cadherin（箭头），突变体中独特的组织块保留E-cadherin(C类，D类)Fgf8型和蜗牛在适当的位置表达，正常强度in脱中胚蛋白 ^{不适用于CA};Sox2.Cre公司通过全山原位杂交（C）或原位杂交分析的胚胎截面（D）上的杂交。突变体PS显示重叠表达E-钙粘蛋白和蜗牛，而在野生类型中控制表达域是互斥的。（C） Fgf靶喷洒2广泛表达于脱中胚蛋白突变体。(E类)野生型和脱中胚蛋白突变原语条状外植体培养显示出难以区分的迁移行为和有效下调迁移细胞中的E-cadherin。虚线表示E-cadherin阳性外植体的边界。

接下来，评估脱中胚蛋白结果为广义细胞迁移缺陷我们进行了外植体实验。基本体从突变和野生型胚胎上切下的条纹区培养72个如前所述，在涂有纤维连接蛋白的盘子上放置数小时(Ciruna和Rossant，2001年;Zohn等人，2006年)。令人惊讶的是，脱中胚蛋白-缺陷外植体与野生外植体难以区分并显示出有效的迁移行为，与E-钙粘蛋白(图4E） ●●●●。因此，在这些体外培养条件脱中胚蛋白-缺乏的外胚层细胞是对Fgf8/蜗牛信号有反应，下调E-cadherin，并经历EMT。因此，突变胚胎中的局部环境有助于细胞迁移缺陷。

脱中胚蛋白在显性条纹形成，在E7.5之前保持原始条纹，当表达突然下调时。要删除脱中胚蛋白从PS，我们使用了最近描述的T.Cre公司删除器应变(Perantoni等人，2005年)，其中由短梗基因的条纹增强子表达的Cre在新生中胚层从第6.5天开始。在这种情况下，我们找到了孟德尔数量（7/26；27%）T.Cre公司; 脱中胚蛋白^{不适用于CA}后代。因此，我们得出结论：脱中胚蛋白功能活动仅在大脑皮层周围期的后部外胚层中暂时需要使新生中胚层有效地经受EMT。

小区自治脱中胚蛋白细胞迁移所需的功能和DE规范

EMT和迁移缺陷是否反映了细胞的自主性脱中胚蛋白要求？为了评估这种可能性，我们检查了脱中胚蛋白突变型ES细胞。纯合子脱中胚蛋白无效的(脱中胚蛋白 ^无)ES细胞(图5A） 注入ROSA26囊胚(图5B） ●●●●。lacZ公司染色E7.5嵌合体胚胎表明lacZ公司-阴性脱中胚蛋白-缺乏的ES细胞能有效定植外胚层(图5D-G）但只有少数突变细胞融入新生中胚层。有趣的是，脱中胚蛋白-缺乏的细胞无法在E7.5促进DE。相反，这些lacZ公司-阴性细胞在后PS区，经常形成组织突入羊膜空腔，类似于在脱中胚蛋白外胚层突变体胚胎(图5E、 F）。

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图5

细胞自主脱中胚蛋白从原始条纹和内胚层规格。(A类)埃姆斯-通过重新定位剩余野生型等位基因脱中胚蛋白 ^N个/+杂合的ES细胞。(B类)脱中胚蛋白 ^无ES细胞引入ROSA26^LacZ公司囊胚，如图所示和嵌合体胚胎在E7.5时的组织学分析(C-G公司)和E9.5(氢-氮)。（C-G）/acZ公司-阴性脱中胚蛋白 ^无ES细胞（用曙红复染）随机分布在E7.5（C′，D-G）的外胚层中，但失败退出PS并在羊膜腔内的细胞团中积聚。（H） 高度E9.5的嵌合体胚胎发育延迟，表现出相对不足中胚层衍生物，导致影响心脏的严重异常，体节、轴伸长和胚胎转向。（识别号）脱中胚蛋白 ^无突变的ES细胞不能参与明确的内胚层衍生物，在任何情况下都无法在肠管内找到水平（H-N中的箭头）。（N） 嵌合体胚胎偶尔表现为后部神经管复制（箭头）。

我们还分析了晚期嵌合体胚胎。在E9.5，所有胚胎，无论ES细胞的贡献程度如何，显示出分级的分布lacZ公司-沿着AP轴的阴性细胞在更多的后部区域发现的突变细胞数量增加(图5H-M）。组织学分析表明脱中胚蛋白突变细胞有助于所有的中胚层和外胚层起源，但即使在胚胎中该区域来自突变的ES细胞，仅lacZ公司-积极的，积极的野生型细胞对肠管有贡献(图。5I-M）。

突变细胞高贡献（>80%）的胚胎发育迟缓，表现出多效性缺陷，包括受干扰躯体发生、心脏异常和神经管闭合缺陷(图5H） ●●●●。偶尔，我们观察到后部神经管重复，令人想起Fgfr1级突变嵌合体实验(Ciruna等人，1997年) (图。5N） ●●●●。然而，在之前的报告中，重复的神经管完全由Fgfr1级-突变细胞，而这里组织由野生型和突变型细胞组成。

脱中胚蛋白和节点协同工作以布置AP轴

节点突变体缺乏脱中胚蛋白中的表达式TE中的外胚层和表达没有维持(Brennan等人，2001年;Guzman-Ayala等人，2004年).节点和脱中胚蛋白都需要在外胚层中进行规范APS衍生物(文森特等人，2003年)(图2)。调查脱中胚蛋白和节点遗传相互作用，我们交叉的脱中胚蛋白 ^N个/+和节点 ^LacZ公司/+动物。胚胎基因分型不同的发育阶段揭示了三种不同的表型(表2)。大约三分之一的双杂合子受到严重影响，并在原肠胚形成前后停止。另一类突变体有原肠胚，但表现出严重的截短前体轴、心脏异常并在E9.5附近死亡。最后，大致是三分之一的双杂合子突变体发育正常，可以成活。

表2

EomesN/+致死的不同时间点；NodalLacZ/+胚胎

脱中胚蛋白N个/+×节点LacZ公司/+交叉
年龄	Eo公司+/+; 节点+/+	Eo公司N个/+; 节点+/+	Eo公司+/+;节点LacZ公司/+	Eo公司N个/+;节点LacZ公司/+	总计
第7.5页	32 (22%)	31 (21%)	49 (33%)	32 (32%)	144
E9.5第20页	35 (24%)	39 (26%)	50 (33%)	21 (17%)	148
第20页	25 (28%)	28 (31%)	29 (33%)	7 (8%)	89

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这个受影响最严重的类别脱中胚蛋白 ^N个/+;节点 ^LacZ公司/+胚胎显示可见E7.0左右开始出现异常。这些胚胎不能形成PS，并且经常在胚胎和胚外发育发音收缩概念区域(图6P） ，一个干扰通常与不良AP轴形成有关。在E6.5，节点 ^LacZ公司表达式通常限制为后表皮母细胞，但在我们发现的突变体中节点 ^LacZ公司在整个近端外胚层(图6A、 B）。我们还检测AVE表达的调节结节的细胞外拮抗剂活动和定位节点表达式域(Beck等人，2002年;Brennan等人，2001年;Perea-Gomez等人，2002年)。突变胚胎表达证书1和十六进制在远端尖端。因此AVE被正确诱导，但未能向前迁移(图6C-F）。因此，后标记基因，包括克里特语、短促语和脱中胚蛋白其本身得到了广泛的表达整个突变胚胎的近端(图6G-L）。然而，脱中胚蛋白和节点在double中表达水平不受影响杂合子(图6A、 B、I、J、O、P；数据不是如图所示）。

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图6

受到严重影响脱中胚蛋白 ^N个/+; 节点^LacZ公司/+双杂合子不能旋转PD轴。(A类，A’)结节表达正常受限E6.5处的后部外胚层(B类，B’)持续存在于脱中胚蛋白 ^N个/+ ;节点 ^LacZ公司/+双杂合胚胎。(首席财务官)AVE标记(十六进制和证书）保持局限于双胎的远端杂合突变胚胎。(G-L公司)因此后标记基因（cripto，脱中胚蛋白和brachyury）贯穿始终近端外胚层。(M（M），N个)特殊用途4是在突变胚胎的ExE中以正常水平表达近距离移位。(O-P’)从原肠胚形成晚期此外，双杂合突变体显示出生殖层的严重干扰骨髓中间充质细胞的形成和大量细胞堆积羊膜腔（P′箭头，lacZ公司染色）和胚胎和胚胎外区域之间的严重收缩胚胎（P中的箭头）。(Q-T（质量-温度）)在E7.5处，中胚层标记Fgf8型在突变体中广泛表达，而证书1标志着新形成的DE，未能表达。

外胚层内的节点信号阈值控制编队以及AV E的迁移(诺里斯等人al.，2002年)。一种可能性是节点信号可能在双杂合子胚胎中受损，因为ExE内合成的转化酶Furin和PACE4/Spc4(康斯坦姆和罗伯逊，2000年;Beck等人，2002年;Guzman-Ayala等人，2004年; Ben-Haim等人，2006年）。我们检测野生型特殊用途4E6.5 ExE的表达水平突变胚胎，但由于缺乏胚外中胚层形成(图。6M、 N）。到原肠胚形成晚期，双杂合胚胎严重紊乱，羊膜内经常出现组织堆积空洞和缺乏可见的胚层(图。6O、 P）。中胚层标志物，如Fgf8型(图6Q、 R）或蜗牛（数据未显示）以E7.5表示，但缺少DE标记(图6S、 T）。

第二类Eomes/Nodal公司双杂合子建立正常的AP轴，启动原肠胚形成，但无法指定APS。E7.0时十六进制表达式，标记中线DE(图7A、 B）和证书1，标记大多数初生DE都大大减少了(图7C-D′）。Brachyury通常表示为新生中胚层和新形成的脊索。在变异胚胎中由于缺少脊索，短表达域被截断规范(图7E、 F）。同样，福克斯2轴中线组织的表达减少未能扩展到最前面的区域（未显示数据）。在E8.0，嘘通常表示为节点和开发轴向中线组织。双杂合子显示大大减少或完全缺乏嘘在轴向组织中表达，但节点表达式域保持不变(图。7G-H′）。来自APS及其衍生产品指南的信号提示并维持前部结构。如损失所示其他2E8.5时前神经外胚层的表达(图7一、 J），Eomes/Nodal公司杂合突变体缺乏正确确定中轴肠系膜的能力未能保持先前的身份。到E9.5，突变体缺乏头部结构嘴侧到耳板并表现出心脏和LR模式异常(图7K-N），由于APS损失和中线结构。

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图7

第二类脱中胚蛋白 ^N个/+; 节点^LacZ公司/+双杂合子突变体不能指定前部原始条纹和显示部分轴复制。化合物的比例杂合胚胎正确指定AP轴，但表现出表达减少DE标记(A类，B类)十六进制和(C-D’)证书1在E6.5和E7.5，分别是。前轴中线组织丢失，如图所示(E类，F类)前截短表达PS（星号）和(G-H’)缺少嘘（箭头表示节点中剩余的表达式）。（H，H’）头部褶皱在突变胚胎中存在E8.0（星号），但(我，J型)前神经同一性与Otx2表达E8.5时丢失。(K-N公司)在E9.5处，双杂合突变体出现严重的前部截断和不同程度的心脏缺损，包括（L） 环状缺陷（箭头）至（N）伴有贲门裂的严重畸形，而后天发育仍然没有受到明显影响。(O（运行），P（P）)一部分脱中胚蛋白 ^N个/+ ;节点 ^LacZ公司/+复合杂合突变体显示节点和脊索的重复，如所示嘘标记节点和脊索的表达式，或(Q-R′)染色节点 ^LacZ公司节点中的表达式。缺乏节重复的胚胎节点中的表达式左侧板中胚层（箭头所示）。

此外，E8.5节点的发展在突变胚胎的子集。在某些情况下，嘘和节点 ^LacZ公司表达域扩大（数据未显示），并且还完成节点复制，同时形成观察到副脊索(图。7O-R′）。因此，神经管的底板膨胀，继而导致体节行间距增加公式9.5(图7N） ●●●●。在最严重的情况下受影响的胚胎，我们观察到后体有更多完整的重复轴，包括额外的体节行（未显示数据）。

区分减少引起的异常脱中胚蛋白在里面外胚层或ExE，节点 ^LacZ公司/+;Sox2.Cre公司男性和脱中胚蛋白 ^CA/CA公司雌性被杂交到特别减少脱中胚蛋白在外胚层中。胚胎前轴截断出现在低频率，但我们未能做到恢复严重受损的胚胎。因此，APS缺陷与节点和脱中胚蛋白在外胚层，而早期阻滞和AP模式缺陷反映了脱中胚蛋白ExE中的要求。

Wnt3调节节点外胚层的表达水平通过依赖Tcf/Lef的5′PEE增强子元件（Ben-Haim等人，2006年）。调查Eomes是否影响节点表达式级别通过调节Wnt3活性间接地，我们跨越了脱中胚蛋白 ^N个/+和重量3 ^N个/+动物，并在E9.5检查胚胎。未观察到表型异常在一个大面板中脱中胚蛋白 ^N个/+ ;重量3 ^N个/+双杂合胚胎(n个=19). 同样，我们恢复了孟德尔数脱中胚蛋白 ^N个/+;节点 ^ΔPEE/ΔPEE后代交叉于脱中胚蛋白 ^N个/+;节点 ^ΔPEE/+老鼠。总的来说，这些数据表明，形成APS模式的Nodal/Eomes信号没有通过Wnt3途径。

讨论

遗传学研究已确定几个T-box转录因子是关键的脊椎动物发育调节器（综述Naiche等人，2005年;Showell等人。，2004)。根据保守DNA结合位点的上下文T-box转录因子可以激活或抑制靶基因。不同T-box家族成员和/或其他转录物之间的伙伴关系因素也可能有助于功能特异性（由Naiche等人，2005年)。由于这个原因个体的合作性和部分重叠表达模式、功能家庭成员仍不明确。脱中胚蛋白，第一个T-box基因在发育中的小鼠胚胎中表达，在滋养层中至关重要血统(Russ等人，2000年;Strumpf等人，2005年).脱中胚蛋白作用于下游Cdx2以维持和扩展早期植入后胚胎(Niwa等人。，2005;Strumpf等人，2005年).此外脱中胚蛋白表达于原肠胚形成前阶段，并保持相对短暂的36小时间隔在原肠胚形成和原始条纹伸长期间。在这里，我们检查了脱中胚蛋白外胚导数中的一个条件函数失活策略。我们证明了这一点脱中胚蛋白中的表达式后部外胚层对于EMT和新生中胚层的分层至关重要。第二，脱中胚蛋白在APS规范和其衍生物，即DE细胞谱系。

以前的工作表明节点-介导互惠外胚层和ExE之间的信号传导负责局部中胚层胚胎前瞻性后极的诱导(Brennan等人，2001年)（审核人Lu等人，2001年)。Fgf家族成员也控制着这个过程EMT的。Fgfr1受体激活对Fgf4型和Fgf8型由新生中胚层表达反过来激活表达属于蜗牛，一种沉默的Zn-finger转录阻遏物E-钙粘蛋白转录(Batlle等人，2000年;卡诺等人，2000年)并导致快速粘附连接处E-cadherin的丢失，导致细胞分层和迁移。在这里，我们证明了这一点脱中胚蛋白-缺乏外胚层细胞可以有效激活这些信号级联并表达新生的中胚层标记，包括重量3和短梗。引人注目的是，然而，新生的中胚层不能进行EMT，并且不能从原始条纹。与…对比Fgfr1级，Fgf8型和蜗牛-缺乏胚胎，显示中胚层减少迁移(Ciruna和Rossant，2001年;Sun等人，1999年;Carver等人，2001年),脱中胚蛋白功能性损失有效且深刻地阻止EMT。此外，Fgf8型和蜗牛转录本强烈表达于脱中胚蛋白-细胞缺陷，强烈表明胎儿生长因子信号功能正常。最明显的可能性是Eomes与蜗牛共同调节E-cadherin的表达。然而，这种简单的情况似乎不太可能发生，因为我们未能确定E-cadherin启动子区上游的T盒结合位点。Eomes可能是需要激活蜗牛转录伙伴，或者Eomes可以在表观遗传重编程中起作用。可能是蜗牛绑定站点控制E-cadherin表达下调在突变的外胚层细胞中可能无法实现。与此建议一致，脱中胚蛋白后期灭活在原始条纹中T.Cre公司删除程序无法中断发展。因此，我们确定了一个关键的时间表脱中胚蛋白流前早期外胚层组织的功能。

有效的中胚层分层还取决于E-钙粘蛋白。有趣的是，最近的研究表明E-钙粘蛋白p38IP突变胚胎中的蛋白持续存在(Zohn等人2006年)EMT受损。然而，原肠胚形成与效率降低，并导致形成具有丰富的中胚层衍生物，包括体节(Zohn等人，2006年)。不同于脱中胚蛋白突变外植体p38缺失原生质体的外植体在体外表现出正常的迁移行为条纹区域在体外无法迁移。总的来说，p38IP表型共享最小与本文所述Eomes突变胚胎特征的共同特征。因此，p38通路的成分不太可能作为脱中胚蛋白目标。总的来说，我们的实验场所脱中胚蛋白作为早期小鼠EMT的新型上游调节器胚胎。

在原肠胚形成期间，外胚层中的细胞从前部进入原始条纹嵌入上覆内脏内胚层，引起DE.Chimera研究揭示了福克斯1和Smad2公司，的下游效应器节点通路，用于DE谱系的规范(Tremblay等人，2000年;Hoodless等人。，2001)。在这里，我们在嵌合体胚胎中观察到脱中胚蛋白-缺陷细胞被邻近的野生型新生细胞包围中胚层细胞可以分层并继续形成中胚层衍生物。一致用这个脱中胚蛋白突变的ES细胞已被证明形成中胚层畸胎瘤组织(Russ等人，2000年).然而，对于Smad2公司-和福克斯1-ES不足细胞，脱中胚蛋白突变的ES细胞不能参与DE细胞血统。因此，目前的实验首次证明脱中胚蛋白对小鼠内胚层的形成至关重要。

在斑马鱼中，边缘卵裂球中表达的Eomes直接相互作用用Nodal靶向Faust/Gata5和同源结构域蛋白Bon进行组装激活的转录复合物Cas公司，Sox家族成员这是关键的内胚层决定因素(比约恩森等人，2005年)。因此，众所周知节点和脱中胚蛋白协同管理DE规范(Bjornson等人，2005年)（审核人Stainier，2002年)。的同源词苯教和卡斯尚未在小鼠中识别。重要的是要确定Eomes伴侣和控制基因的靶基因小鼠内胚层规范。

本研究确定节点和脱中胚蛋白基因相互作用。因此，双杂合子胚胎在两个不同的时间点表现出明显的发育异常（总结于图8)。第一类双杂合子胚胎节点内含子靶向缺失的信号传递自动调节增强子(Norris等人，2002年)或ExE转化酶的缺陷表达(Beck等人，2002年)。外胚层产生的结节维持脱中胚蛋白-ExE内的阳性滋养层干细胞(Guzman-Ayala等人，2004年)和英国标准普尔4由该组织表达反过来诱导重量3活动和放大节点中的活动外胚层（Ben-Haim等人，2006）。减少脱中胚蛋白和节点表达水平可能会影响这些调节协调ExE和epiblast早期开发的反馈回路。

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图8

的模型脱中胚蛋白原肠胚形成中的作用。(A类)在原肠胚前期，脱中胚蛋白和节点表达分别限于ExE和外胚层（Epi）。节点信号是首先需要诱导DVE的形成，这需要升高节段向前侧迁移的信号电平。正反馈回路ExE中的Eomes和外胚层中的Nodal之间需要保持较高的DVE迁移所需的节点信令阈值。尽管Nodal信号可以直接调节脱中胚蛋白在ExE中Eomes在维持节点水平方面的要求可能是间接的，可能通过ExE中前蛋白转化酶Furin和/或SPC4水平的调节。(B类)在原肠胚形成过程中，脱中胚蛋白表达式是起始于后部近端外胚层和PS，与之重叠节点.脱中胚蛋白参与E-cadherin下调的转录控制，对细胞横穿PS并分层为中胚层和内胚层。此外，脱中胚蛋白需要指定DE血统和行为与Nodal信号协同激活负责APS的靶基因规范。

第二类双杂合子突变胚胎选择性缺乏APS祖细胞和一些显示轴复制。选择性降低脱中胚蛋白在外胚层中产生类似的表型。这个启动子区非洲爪蟾基因含有激活素响应元件(Ryan等人，2000年),与以下观点一致：节点和脱中胚蛋白是协调监管。然而，老鼠脱中胚蛋白发起人缺少Foxh1/Smad结合位点的保守簇（数据未显示）。5′节点近端外胚层增强子（PEE）含有Tcf/Lef结合以及一些潜在的T盒半结合位点。这些Tcf/Lef站点是在包括人类、啮齿动物、，奶牛和犰狳（Ben-Haim等人，2006年）。然而，相比之下，PEE与T盒半位点不保守（数据未显示），因此不太可能对于控制Nodal/Smad2信令至关重要。节点/Eomes外胚层中的相互作用可能是间接的。斑马鱼的Lim-domain基因长x1是节点目标(Watanabe等人，2002年)已知能共同调节cerberus表达(山本等人，2003年)。Lim-domain域蛋白质以前被证明与T-box蛋白质组装(Krause等人，2004年)。和斑马鱼一样(Bjornson等人，2005年),始端/节点路径可以协同调节规范APS祖细胞。或者，Nodal可以通过翻译后机制吨-打赌-调解的辅助性T祖细胞分化的控制。在这种情况下，磷酸化调节T-bet与Gata3的相互作用，并阻止DNA在一种途径中结合抑制Th2细胞的发育(Hwang等人。，2005)。类似的机制可能调节控制细胞的T盒活动早期胚胎的命运决定。未来的实验旨在鉴定Eomes调控EMT和内胚层的转录伙伴和下游靶点鼠标中的规格。

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