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病毒研究。2005年12月；114(1): 70–79.
2005年7月25日在线发布。 数字对象标识：2016年10月10日/j.virusres.2005.06.001
预防性维修识别码：PMC7114190型
PMID：16046244

严重急性呼吸综合征冠状病毒特异性编码的非结构蛋白3b的核苷酸定位

袁晓玲,1 姚振宇,1 山亚军,陈波（Bo Chen）,甄扬,吴杰,赵振虎,陈佳培、和宇文聪⁎
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）基因组的开放阅读框3（ORF3）编码一个预测的154-氨基酸蛋白，该蛋白与任何已知蛋白都缺乏相似性，命名为3b。本研究表明，3b蛋白主要定位于细胞核，其N或C端带有EGFP标记。不同转染细胞的定位模式相似。免疫荧光分析表明，3b蛋白与C23在细胞核内共定位良好。C23、B23和纤维蛋白都是重要的核仁蛋白，定位于核仁区域。p3b-EGFP与pC23-DsRed、pB23-DsRed和pfibrillarin-DsRed共转染进一步证实了3b的核仁定位。通过构建序列截断的3b突变体，在3b蛋白中确定了一个负责核仁定位的区域（残基134–154 aa）。这些结果为SARS-CoV 3b蛋白的进一步功能研究提供了新的见解。

缩写：DMEM，Dulbecco改良Eagel培养基；ECL，增强化学发光；增强型绿色荧光蛋白EGFP；N、 核衣壳；NLS，核定位信号；NoLS，核仁定位信号；ORF，开放式阅读框；PBS，磷酸盐缓冲盐水；严重急性呼吸综合征；SARS-CoV、SARS冠状病毒

1 介绍

2002年11月初在中华人民共和国广东省爆发的严重急性呼吸综合征（SARS）疫情对全球构成了巨大威胁。共有32个国家或特别地区向世界卫生组织报告8422例病例，报告916例相关死亡(Fan等人，2004年,Lee等人，2003年,Peiris等人，2003年,Tsang等人，2003年,世界卫生组织，2003年). SARS是一种损害许多器官（如肺、肝和免疫器官）的系统性疾病。呼吸窘迫和免疫功能下降被认为是SARS患者死亡的主要原因(Ding等人，2003年,Lang等人，2003年,Nicholls等人，2003年). 在世界卫生组织的领导和协调下，发现SARS是由一种新型冠状病毒引起的，命名为SARS冠状病毒（SARS-CoV）。随后，几个研究小组确定了SARS-CoV基因组的完整序列(Drosten等人，2003年,Fouchier等人，2003年,Ksiazek等人，2003年,世界卫生组织，2003年). 结果表明，SARS-CoV基因组包含11到14个开放阅读框（ORF），编码复制酶1A、复制酶1B、4种结构蛋白（穗蛋白、S蛋白、包膜蛋白、E蛋白、膜蛋白、M蛋白、核衣壳蛋白、N蛋白）和5到8种潜在的非结构蛋白(Marra等人，2003年,Rota等人，2003年). 已发表的数据表明，冠状病毒辅助蛋白在冠状病毒基因组中的大小和位置不同，可能对病毒复制（至少在细胞培养系统中）是不必要的，但对病毒与宿主的相互作用可能很重要(Haijema等人，2004年). 例如，据报道，其中一种蛋白的突变或缺失，如猫冠状病毒7b基因或猪肠道和呼吸道冠状病毒基因3，与毒力降低和发病有关(Herrewegh等人，1995年,Paul等人，1997年).

SARS-CoV X2的ORF由Thiel命名为3b，编码154个氨基酸（CDS:25680-26144），与ORF3a和E蛋白完全重叠，并且可以使用内部核糖体进入位点从ORF3表达(Rota等人，2003年,Thiel等人，2003年). 生物信息学分析表明，SARS-CoV 3b蛋白与任何已知序列以及其他冠状病毒成员的3b蛋白均不匹配(Marra等人，2003年). 已知冠状病毒中的ORF3被证明是功能性双顺反子或三顺反子，编码3a、3b和3c（E）蛋白(Le等人，1994年,Liu和Inglis，1992年). 已发表的研究表明，ORF3b在冠状病毒感染性支气管炎病毒（IBV）和猪传染性胃肠炎（TGEV）感染细胞中表达(Curtis等人，2002年,Liu等人，1991年,沈等，2003). 据进一步报道，IBV的3b蛋白定位于细胞核，参与了IBV的发病和复制(沈等，2003). 到目前为止，还没有关于SARS-CoV 3b蛋白的报道。在本研究中，我们提供的数据表明：（i）3b蛋白能够在没有任何额外病毒蛋白的情况下定位到细胞核，（ii）3b蛋白质与转染细胞中的核仁标记蛋白C23/核仁蛋白、B23/核磷蛋白和纤维蛋白共定位，（iii）并确定了核仁定位所需的区域。

2 材料和方法

2.1. 细胞培养和转染

293（人类胚胎肾成纤维细胞）细胞、Vero（非洲绿猴肾上皮）细胞和COS-7（非洲绿猴肾成纤维组织）细胞在添加10%FBS的Dulbecco改良Eagel培养基（DMEM）（Gibco BRL）中生长。A549（人类肺癌）细胞在37°C含10%FBS的Ham’s F12K培养基中培养，培养箱中供应5%CO2当培养板中的细胞密度达到70%时，根据制造商的说明，使用Lipofectamine™2000（Invitrogen）将1.5μg/ml质粒DNA转染细胞。转染后5 h用新鲜培养基替换培养基，然后培养至实验。

2.2. p3b-EGFP、pEGFP-3b、截断3b蛋白系列和pC23-DsRed、pB23-DsRed、pfibrillarin-DsRed的构建

本研究使用的3b是从SARS-CoV（ZJ01，AY297028号)使用Taq DNA聚合酶（NEB）进行基因组分析。用正向引物（含有Xho公司I站点）和反向底漆（包含生态RI位点）与3b的3′端互补，无终止密码子，便于读取。这个产品是用Xho公司我和生态RI，将获得的基因克隆到pEGFP-N1载体（Clontech）的多克隆位点（MCS），产生p3b-EGFP质粒。pEGFP-3b，截短的3b结构以类似的方式制作，使用的寡核苷酸引物列于表1从COS-7细胞基因组中扩增C23、B23和纤维素酶基因，并分别克隆到pDsRed-N1载体中。所有质粒序列均经测序分析证实。

表1

用于野生型和缺失3b结构的素数一

构件名称极性序列
p3b表皮生长因子P感觉b条5′-立方厘米CTCGAGCGCACC公司ATGGTCCAACTACTTGTGTGCGCAC-3′
反义c（c）5′-重心GAATTC公司CACGTACCTGTTTCTCCCGAAACG-3′


3b 133-EGFP公司感觉5’-CCGCTCGAGCGCACC公司ATGGTCCAACTACTTGTGTGCGCAC-3′
反义5′-重心GAATTC公司CACAAGGCACGCTAGTAGTC-3′


3b 100-EGFP型感觉5′-连铸CTCGAGCGCACC公司ACCATGGTCCAACTACTTGTGTTGGCAC-3′
反义5′-重心GAATTC公司CGTGGGTCTTAACAAGCTTG-3′


3b 80-EGFP型感觉5′-连铸CTCGAGCGCACC公司ATGGTCCAACTACTTGTGTGCGCAC-3′
反义5′-CGGAATTC公司ctagtaattgtagactcaagctggtag-3′


3b 68-EGFP公司感觉5′-连铸CTCGAGCGCACC公司ATGGTCCAACTACTTGTGTGCGCAC-3′
反义5′-重心GAATTC公司CCGGTGAATAGCATGTAC-3′


3b 45-EGFP公司感觉5′-连铸CTCGAGCGCACC公司ATGGTGCCAACTACTTTGTTTGCTGGCAC-3′
反感应5′-重心GAATTC公司CTTTGGTTAGTCTTCTTTGAGTTTTGG-3′


3b D18-EGFP型感觉5′-连铸CTCGAGGCCACC公司ACCATGGATAAACAGTCATACAG-3′
反义c（c）5′-重心GAATTC公司CACGTACCTGTTTCTCCCGAAACG-3′


3b D39-EGFP系列感觉5′-连铸CTCGAGGCCACC公司ATGGCAAAGAAGACTACCAATTG-3′
反义c（c）5′-重心GAATTC公司CACGTACCTGTTTCTCCCGAAACG-3′


3b D45-EGFP型感觉5′-连铸CTCGAGGCCACC公司ATGGAATTGGTTATTCTGAGAGG-3′
反义c（c）5′-重心GAATTC公司CACGTACCTGTTTCTCCCGAAACG-3′


3b D68-EGFP型感觉5′-立方厘米CTCGAGGCCACC公司ATGGCGAGTTTACTACCAGC-3′
反义c（c）5′-重心GAATTC公司CACGTACCTGTTTCTCCCGAAACG-3′


3b D80-EGFP感觉5′-连铸CTCGAGGCCACC公司ACCATGGTACTACACACTGGTATTGAAAAATG-3′
反义c（c）5′-重心GAATTC公司cacgtacctgtttcttccgaaacc-3′


3b D124-EGFP基因感觉5′-连铸CTCGAGGCCACC公司CACCATGAGCCGACGACGACTAC-3′
反义c（c）5′-重心GAATTC公司TGTTTCTTCCGAAACG-3′


3b D134-EGFP公司感觉5′-立方厘米CTCGAGGCCACC公司ATGAAGCAGAAAGTGAGTAC-3′
反义c（c）5′-重心GAATTC公司CACGTACCTGTTTCTCCCGAAACG-3′


pC23-Ds红色感觉b条5′-中央控制室CTCGAGCGCACC公司ATGGTGAGCTCGCGAAGGCAGG-3′
反义c（c）5′-重心GAATTC公司TTCAAACTCGT CTTCTTTCCTTGGCTTG-3′


pB23-Ds红色感觉b条5′-中央控制室CTCGAGCGCACC公司ATGGAAGATCTCGATGATGACAC-3′
反感应c（c）5′-重心GAATTC公司AAGAGACTTCCTCCACTGCCA-3′


纤维素酶-DsRed感觉b条5′-连铸CTCGAGCGCACC公司ACCATGAGCAGAGATCCCG-3′
反义c（c）5′-重心GAATTC公司GTTCTTCACCTCTGGGGGGTGGC-3′


第EGFP-3b页感觉5′-立方厘米CTCGAGCGGCCACC公司ACCATG gtgcca作用ttgtttgctggcac-3′
反义c（c）5′-重心GAATTC公司ACTACGTACCTGTTTCTCCCGAAACG-3′
一基因序列与SARS-CoV（ZJ01）相对应。
b条下划线的核苷酸表示起始密码子（ATG）前的限制位点和Kozak序列。
c（c）下划线的核苷酸表示限制位点并删除终止密码子。

2.3. p3b-EGFP和pEGFP-3b的表达

转染后48小时收集转染细胞。根据上述程序进行总细胞裂解物制备和Western blot分析(袁等，2004). 简言之，制备细胞裂解物，在SDS-PAGE上运行，并转移到PVDF膜上。在TBST（20 mM Tris pH7.5、150 mM NaCl和0.05%Tween20）中用5%的非脂肪乳封闭膜，并用单克隆抗GFP抗体（1:10000）（Sigma）孵育。用TBS缓冲液清洗膜，并与标记有辣根过氧化物酶的相应二级抗体（Santa Cruz）孵育1h。用增强化学发光（ECL）试剂（Cell Signaling Inc.）观察蛋白质。

2.4. 共焦显微镜分析

根据上述程序制备SARS-CoV 3b蛋白的细胞定位(袁等，2005). 在用p3b-EGFP转染或与pC23-DsRed、pB23-Ds红色或pfibrillarin-DsRed联合转染后24 h，用放线菌素D（Sigma）以10μg/ml孵育玻璃盖玻片上的细胞3 h。然后用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗细胞，用3.7%多聚甲醛固定30分钟，并用0.2%Triton X-100渗透。对于免疫荧光分析，将渗透细胞与抗C23抗体（1:1000）和TRITC标记的二级抗体（1:100，Santa Cruz）依次孵育1小时。然后用Hoechst 33342（0.1μg/ml）（分子探针）或PI（50μg/ml，Sigma）对细胞核进行染色。样品在Bio-Rad Radiance 2100系统上通过共焦荧光显微镜进行检查。

2.5. 核定位信号（NLS）和亲水性曲线的预测

通过PSORT II服务器运行SARS-CoV 3b蛋白序列(http://psort.nibb.ac.jp)，并且NLS被预测为预设定义(Nakai和Kanehisa，1992年). 简而言之，NLS分类如下。经典NLS富含碱性氨基酸，通常符合三个基序之一：（1）四残基模式（pat4）由三个或四个与组氨酸或脯氨酸相关的碱性氨基酸（K或R）的连续残基组成；（2） 七残留模式（pat7）从脯氨酸开始，然后是四分之三的基本残基；（3） 另一类NLS（二部）由两个基本残基、一个10-残基间隔基和一个包含至少三个五个基本残基团的区域组成。根据Hopp和Woods预测了Hopp–Woods的亲水性(霍夫曼和哈奇，1987年).

三。 结果和讨论

3.1. SARS-CoV 3b蛋白的细胞定位

先前的研究表明，SARS-CoV 3b编码一种154-氨基酸蛋白，与任何已知的蛋白质都缺乏显著的相似性(Drosten等人，2003年,Marra等人，2003年). 利用PSORT II服务器进行的生物信息学分析表明，在3b蛋白中预测了两个潜在的核定位信号（NLS）。位于aa135–138（KHKK）的NLS1包含模式4序列，位于aa137–153（KKVSTNLCTHSFRKKQV）的二分NLS与模式4序列重叠。此外，3b蛋白的Hopp–Woods亲水性分析(霍夫曼和哈奇，1987年)结果表明，预测的假定NLS位于亲水区域，且易于获取。未检测到信号肽、线圈区域和跨膜区域分配。为了进一步了解其功能，从SARS-CoV基因组（ZJ01，AY297028号)克隆到pEGFP-N1和pEGFP-C1载体并在293细胞中表达(图1A） ●●●●。用抗GFP抗体进行的Western blot分析表明，嵌合蛋白的表达和迁移的预期分子量约为44kDa(图1B） ●●●●。

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3b在转染细胞中的表达和细胞定位。（A） p3b-EGFP和pEGFP-3b的构造。将SARS-CoV基因组中的3b作为C端融合蛋白克隆到pEGFP-N1载体，并作为N端融合蛋白与pEGFP-C1载体。（B） 蛋白质印迹分析。分别用pEGFP-N1、p3b-EGFP、pEGFP-3b和pEGFP-C1质粒瞬时转染293细胞。转染后24 h制备细胞裂解物并用SDS-PAGE分离。用单克隆抗GFP抗体检测转移到PVDF膜上的蛋白。分子质量标记的大小（kDa）显示在右侧。（C） 3b蛋白的细胞定位。将所述质粒分别转染293细胞，共聚焦荧光显微镜观察3b的细胞定位。绿色表示来自原始pEGFP、p3b-EGFP或pEGFP-3b的EGFP荧光（1、4和7）；蓝色（2、5和8）代表Hoechst 33342染色细胞核；图像3、6和9显示绿色和蓝色荧光重叠。一行的所有三个面板具有相同的视野。（D） 3b蛋白在不同细胞中的细胞定位。分别用p3b-EGFP瞬时转染COS-7、Vero和A549细胞。转染后24小时观察3b的细胞定位。绿色代表来自不同细胞中表达的p3b-EGFP的EGFP荧光；叠加图像显示绿色和红色（来自PI染色细胞核）荧光。一行的所有三个面板具有相同的视野。

接下来，用荧光共聚焦显微镜检测与EGFP融合的3b蛋白在N或C端的细胞定位。如所示图1C、 EGFP蛋白在转染293细胞的细胞质和细胞核中广泛分布。然而，3b-EGFP和EGFP-3b的荧光模式在细胞核内显示出小的亮点，在细胞质中显示出一些中等至微弱的信号。研究还发现，其N或C末端的EGFP标签对3b的细胞定位几乎没有影响(图1C） ●●●●。在Vero、COS-7和A549细胞中观察到类似的3b-EGFP细胞分布(图1D） 表明3b蛋白的核定位是一个保守属性。

3.2. SARS-CoV 3b蛋白的亚细胞定位

生物信息学分析和3b的细胞分布模式均表明SARS-CoV3b可能是核仁定位蛋白。以前的研究表明，一些病毒蛋白，如冠状病毒核衣壳蛋白和HIV rev蛋白，通过与C23、B23或纤维蛋白的结合定位于核仁(Chen等人，2002年,Cheng等人，2002年,Dundr等人，1995年,Yoo等人，2003年). C23/核仁蛋白、B23/核磷蛋白和纤维蛋白都是重要的核仁蛋白，定位于核仁中，参与核糖体组装和生物生成、rRNA转运和RNA转录加工。为了确认3b的核仁定位，我们用C23、B23和纤维蛋白对p3b-EGFP进行了共定位分析。首次使用抗C23单克隆抗体的间接免疫荧光法显示核仁。如所示图2A、 3b-EGFP主要积聚在转染COS-7细胞的核仁中。分别用pC23-DsRed、pB23-DsRed和pfibrillarin-DsRed共转染p3b-EGFP，进一步证实3b主要定位于COS-7细胞的核仁中(图2B） ●●●●。使用293个细胞，获得了类似的结果（数据未显示）。从以上结果可以推断，蛋白3b中存在核仁定位信号（NoLS），能够将外源性EGFP蛋白靶向核仁。

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3b蛋白的亚细胞定位。（A） 用C23抗体对3b蛋白进行亚细胞定位。转染p3b-EGFP或pEGFP-N1质粒的COS-7细胞生长24h，然后固定并与抗C23单克隆抗体孵育，用TRITC标记的二级抗体检测，同时用Hoechst 33342染色细胞核DNA。显示p3b-EGFP和pEGFP（绿色，1和5），C23抗体的荧光（红色，2和6）和合并图像（4和7）。一行的所有四个面板具有相同的视野。（B） 3b与C23、B23或纤维蛋白的共扩增。用共聚焦荧光显微镜分析p3b-EGFP与pC23-DsRed、pB23-DsRed和pfibrillarin-DsRed共转染的细胞。合并图像表示p3b-EGFP（绿色）和pC23-DsRed、pB23-Ds红色或pfibrillarin-DsRed（红色）图像之间的重叠区域。一行的所有四个面板具有相同的视野。

3.3. 蛋白质3b核仁定位信号的测定

为了确定核仁靶向所需的最小决定簇，从3b的N端氨基酸中构建了一系列截短的突变体，并分别对其亚细胞定位进行了检测(图3A） ●●●●。如前所述，使用C23抗体显示核仁。如所示图3B、 3b D18-EGFP和D39-EGFP主要定位于核仁，似乎比野生型3b-EGFP对核仁的积累更多。进一步删除45至124 aa的3b（3b D45-EGFP、D68-EGFP，D80-EGFP和D124-EGFP）都能有效地将EGFP靶向核仁，但定位模式(图3B） 由核仁中特有的明亮荧光改变为细胞质中的一些点状分布。这些结果表明，125至154 aa的C末端区域可能含有功能性NoLS。还注意到3b D18-EGFP和D39-EGFP的核仁定位比野生型的更清楚，并且与3b D45-EGFP的核仁定位显著不同，提示40～45个氨基酸残基可能含有另一个功能性NoLS或具有稳定核仁定位域构象的能力。

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3b的N末端截断突变体与C23的共放大。（A） 融合蛋白的DNA结构。将截短的3b克隆到pEGFP-N1质粒中，并将其表达为与EGFP的C末端融合蛋白。左侧给出了蛋白质3b的氨基酸位置。蓝线表示GFP。核仁定位状态如右图所示，Y表示是，N表示否。（B）3b的N末端截断突变体与C23的共定位。在使用指定构建物转染后24小时，COS-7细胞被固定、渗透并与TRITC抗体检测到的抗C23抗体孵育，而核DNA用Hoechst 33342染色。样品在共焦荧光显微镜下进行检查。合并后的图像表示C23（红色-）和p3b-EGFP缺失（绿色-）图像的重叠区域。一行的所有四个面板具有相同的视野。

为了确定C末端残基是否是核仁定位所必需的，构建了3b的C末端缺失子，并像以前一样检查了它们的亚细胞定位(图4A） ●●●●。如所示图4B、 3b 133-EGFP缺失133至154个氨基酸，在细胞质和细胞核中广泛分布。在转染COS-7细胞中，3b 133-EGFP的核仁定位不明显。从100到45 aa的更多3b缺失（缺失子3b 100-EGFP、80-EGFP，68-EGFP和45-EGFP）完全取消了核仁定位，细胞质中只观察到一个强的点信号(图4B、 B–e）。这些结果进一步支持了功能性NoLS可能位于3b的C末端的观点。

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3b的C末端截断突变体与C23的共放大。（A） 融合蛋白的DNA结构。左侧给出了蛋白质3b的氨基酸位置；核仁定位的状态如右图所示。蓝线表示GFP。（B） p3b-EGFP蛋白C末端截断突变体与C23的共扩增。合并后的图像表示C23（红色-）和p3b-EGFP缺失（绿色-）图像的重叠区域。一行的所有四个面板具有相同的视野。

为了进一步确定蛋白质3b中的功能性NoLS，制备了3b D134-EGFP和3b D39-68-EGFP的结构(图5A） ●●●●。两种构建物均瞬时转染COS-7细胞，并分别检测这些融合蛋白与C23的共定位。如所示图5B、 3b D134-EGFP结构，包含预测的NLS，与C23在细胞核中共同定位良好。然而，不含计算机预测NLS的蛋白3b D39-68-EGFP，如pEGFP-N1载体，广泛分布于细胞质和细胞核中。综上所述，蛋白3b的核仁定位信号可能定位在134到154个氨基酸的C末端区域，其中包含两个NLS：NLS1和二分NLS。

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3b蛋白核仁定位信号（NoLS）的鉴定。（A） 融合蛋白的DNA结构。左侧给出了氨基酸位置，右侧显示了核仁定位的状态。蓝线表示GFP。（B） NoLS的测定。在转染3b D39-68-EGFP或3b D134-EGFP融合质粒的COS-7细胞中观察荧光分配。3b D39-68的表达没有导致EGFP保留在细胞核中。然而，3b D134-EGFP的荧光主要集中在核仁中。一行的所有四个面板具有相同的视野。

为了评估蛋白质3b从细胞质向核仁的转运，在转染后的不同时间观察3b-EGFP的细胞定位。结果表明，p3b-EGFP的分布随时间没有变化，转染后12小时即检测到核仁定位（数据未显示）。已发表的数据表明，诸如放线菌素D等转录抑制剂可以中断某些病毒蛋白（如HTLV Rex蛋白和HIV-Rev蛋白）的核质穿梭，导致病毒蛋白在细胞质中积聚(Dundr等人，1995年,Kubota等人，1996年). 然而，在我们的实验中，蛋白3b的核仁定位并没有被放线菌素D的添加所中断(图6)表明蛋白3b在核仁定位中的机制可能不同于HTLV Rex和HIV Rev蛋白(斯特雷贝尔，2003年).

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放线菌素D对3b蛋白定位的影响。将转染3b-EGFP质粒的COS-7细胞与放线菌素D孵育3h。荧光分配与以前一样。一行的所有四个面板都具有相同的视野。

核仁是细胞核内的一种结构，在核糖体的生物发生中起着关键作用(佩德森，1998年). 许多病毒蛋白已被证明定位于核仁，核仁功能失调，用于病毒复制，包括人类免疫缺陷病毒（HIV）I型Rev和Tat(斯特雷贝尔，2003年)，人类T细胞白血病病毒（HTLV）雷克斯(Kubota等人，1996年)和单纯疱疹病毒（HSV）1型γ（1）34.5蛋白(Cheng等人，2002年). 核仁也是博尔纳病病毒复制和转录的场所(Pyper等人，1998年). 已知冠状病毒在细胞质中复制和组装。用电子显微镜观察到SARS-CoV感染Vero E6细胞后48h细胞核内的病毒样颗粒，其外观与VMMV中的核衣壳相似(秦芬等人，2004). 这种现象在已知的冠状病毒研究中没有报道。还需要用免疫电子显微镜进行测定。

核仁定位被认为是冠状病毒N蛋白的一个共同特征，如IBV N蛋白、TGEV N蛋白和MHV N蛋白(Hiscox等人，2001年,Wurm等人，2001年). TGEV N蛋白的表达可以调节细胞周期并诱导细胞周期延迟或停滞，这意味着N蛋白的核仁定位可能通过干扰新核糖体的形成而干扰宿主细胞的翻译。最近，有报道称SARS-CoV N主要分布在细胞质中，在SARS-CoV感染和转染Vero-E6细胞的核仁中未发现(Chang等人，2004年). 有趣的是，在本文中，我们观察到SARS-CoV蛋白3b通过其潜在的NoLS主要定位于许多转染细胞的细胞核。这些结果表明SARS-CoV不仅在基因组上不同于已知冠状病毒，而且在某些冠状病毒蛋白的功能上也不同，这些差异可能有利于SARS-CoV在感染细胞中的复制和组装(Stavrinides和Guttman，2004年). 到目前为止，SARS-CoV蛋白3b在细胞核中的功能尚不清楚。在确定3b在严重急性呼吸系统综合征冠状病毒感染细胞中的表达以及阐明3b在严重急性呼吸系统综合征冠状病毒生命周期中的潜在功能方面，还有很多工作要做。

致谢

我们感谢周涛博士的技术援助，感谢刘洪燕博士、李素燕博士、于祖音博士和李建勇博士的质粒制备，感谢魏康教授对原稿的批判性阅读。这项研究得到了中国自然科学基金（30470093）的资助。

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文章来自病毒研究由以下人员提供爱思维尔