柳叶刀。2004年6月26日；363(9427): 2122–2127.
非洲绿猴的粘膜免疫(Cercopithecus aethiops）表达SARS冠状病毒尖峰蛋白的减毒副流感病毒用于预防SARS
，博士，a、，* 、理学学士、，一 ，博士，一 ，理学硕士，一 、DVM、，一 、DVM、，b条 ，医学博士，一 、MBBS、，一和，博士一
亚历山大·巴克利耶夫
一美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家过敏和传染病研究所传染病实验室，20892
伊莱恩·拉米兰德
一美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家过敏和传染病研究所传染病实验室，邮编：20892
乌苏拉·J·巴赫霍尔茨
一美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家过敏和传染病研究所传染病实验室，邮编：20892
Leatrice N Vogel公司
一美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家过敏和传染病研究所传染病实验室，邮编：20892
威廉·埃尔金斯
一美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家过敏和传染病研究所传染病实验室，20892
玛丽莎·圣克莱尔
b条马里兰州Rockville Bioqual，20850
布莱恩·墨菲
一美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家过敏和传染病研究所传染病实验室，20892
坎塔·苏巴拉奥
一美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家过敏和传染病研究所传染病实验室，邮编：20892
彼得·柯林斯
一美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家过敏和传染病研究所传染病实验室，邮编：20892
一美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家过敏和传染病研究所传染病实验室，邮编：20892
b条马里兰州Rockville Bioqual，20850
*通信地址：Alexander Bukreyev，Building 50，Room 6505，NIAID，NIH，50 South Drive，Bethesda，MD 20892vog.hin@v671BA 自2020年1月以来，爱思唯尔创建了一个新冠肺炎资源中心，免费提供新冠肺炎英文和中文信息。新冠肺炎（COVID-19）资源中心位于公司的公共新闻和信息网站Elsevier Connect上。爱思唯尔特此授予许可，允许其在新冠肺炎资源中心提供的所有与新冠肺炎相关的研究——包括本研究内容——立即在PubMed Central和其他公共资助的存储库中提供，例如WHO COVID数据库，该数据库有权以任何形式或任何方式进行不受限制的研究重复使用和分析，并确认原始来源。只要新冠肺炎资源中心保持活动状态，爱思唯尔将免费授予这些权限。
总结
背景
2002年爆发的严重急性呼吸综合征（SARS）是由一种以前未知的冠状病毒-SARS冠状病毒（SARS-CoV）引起的。我们开发了一种实验性SARS疫苗，用于呼吸道的直接免疫，呼吸道是SARS冠状病毒传播和疾病的主要场所。
方法
我们表达了来自重组减毒副流感病毒（BHPIV3）的完整SARS冠状病毒包膜棘突蛋白（S），该病毒是一种针对人类副流感病毒3型（HPIV3）的减毒活鼻内儿科疫苗。我们对八只非洲绿猴进行了免疫，其中四只使用单一剂量的BHPIV3/SARS-S，四只使用经呼吸道给药的对照药物BHPIV3/4trl。免疫28天后，对所有猴子进行SARS冠状病毒挑战。
调查结果
用BHPIV3/SARS-S对动物进行免疫可诱导产生SARS-冠状病毒中和血清抗体，表明粘膜免疫可引起全身免疫反应。对照组的所有猴子在感染SARS冠状病毒后都会流下SARS冠病毒，流下时间为5-8天。BHPIV3/SARS-S免疫组无病毒脱落。
解释
单独表达SARS冠状病毒S蛋白的载体粘膜疫苗可能以单剂量形式对预防SARS非常有效。
引言
严重急性呼吸系统综合征（SARS）于2002年末在东南亚出现，随后在国际上传播。迄今为止，已导致8000多例病例和774人死亡。1病原体很快被确认为先前未知的冠状病毒科家庭。2,三,4,5,6,7,8此后，通过感染控制措施控制了SARS对人类的感染。然而，死灰复燃仍然是一个威胁，因为致病因子仍然存在于动物蓄水池中，而动物蓄水池尚未完全被了解，并且仍有零星病例报告。我们对SARS冠状病毒（SARS-CoV）的起源还不完全了解，可能会出现具有更大传播能力的变异体。冠状病毒是一种包膜病毒，其基因组是一条长度为30千碱基或更长的正义RNA单链。通过对SARS冠状病毒RNA基因组的序列分析，确定了11个编码冠状病毒典型蛋白的开放阅读框，包括病毒颗粒的包膜棘（S）蛋白。5,6,7
尽管出现了系统性疾病迹象，并在其他器官中检测到病毒或病毒RNA，但人类的SARS疾病主要是一种肺炎。4,9,10SARS的主要传播方式似乎是通过眼睛、鼻子或嘴巴的粘膜；1,9也有人建议通过粪口传播，但其发生率和相对重要性尚未有文献记载。呼吸道在SARS传播和疾病中的突出作用表明，直接免疫呼吸道粘膜将是预防SARS的有效策略。此外，呼吸道粘膜免疫接种减毒呼吸道病毒活疫苗可有效诱导全身和局部免疫。11,12,13,14,15,16
作为开发SARS冠状病毒疫苗的一种方法，我们利用了一种现有的减毒活疫苗病毒BHPIV3，该病毒正在开发中，用于对HPIV3感染和疾病进行鼻内儿科免疫。11,14BHPIV3来源于牛（B）PIV3，14,16一种与HPIV3密切相关的牛对应物，在灵长类动物中由于自然宿主范围限制而减弱。它还被证明在人类中具有减毒和免疫原性，是抗HPIV3的候选疫苗。14,16先前用重组DNA方法对BPIV3进行了修饰，用HPIV3对应物替换其F和HN保护性表面抗原基因，从而产生BHPIV3。11BHPIV3是一种改进的HPIV3疫苗，因为它携带与HPIV3完全匹配的保护性抗原。11
在我们的研究中，通过插入包含SARS冠状病毒全长S蛋白编码序列的转录盒，对BHPIV3进行了进一步修饰。之所以选择S蛋白，是因为与其他冠状病毒的研究表明，它是一种重要的病毒表面蛋白，在引发感染中起着重要作用。此外，用其他冠状病毒的S蛋白免疫实验动物，可诱导病毒特异性免疫，在某些情况下，可保护动物免受随后的攻击。17,18,19我们研究了这种实验性BHPIV3/SARS-S疫苗在非洲绿猴体内的复制、免疫原性和保护作用(欧硫磷Cercopithecus aethiops).
方法
BHPIV3/SARS-S和BHPIV3/4trl病毒的构建
SARS冠状病毒Urbani株由美国佐治亚州亚特兰大市疾病预防控制中心的L J Anderson和T G Ksiazek提供，并在Vero细胞中繁殖。20所有涉及传染性SARS冠状病毒的实验均在批准的生物安全等级3条件下进行。20分离病毒基因组RNA并用于RT-PCR，以合成和扩增包含SARS-冠状病毒S完整编码序列的3768 bp cDNA。该cDNA的设计使SARS编码序列两侧有短的HPIV3特异性转录信号，这些信号是外源基因通过BHPIV3载体的转录程序表达所必需的（寡核苷酸引物的序列以及RT-PCR和DNA构建的详细信息可从A Bukreyev获得）。11,12
纯化预期长度的PCR产物并插入不是I限制性内切酶位点，之前已导入BHPIV3的完整克隆cDNA，11并确定了插入区和侧翼区的序列。在这种结构中，SARS冠状病毒S插入物作为位于BHPIV3 P和M基因之间的附加基因存在()并通过BHPIV3聚合酶表达为单独的mRNA。HPIV3分子遗传学的某些特殊特征也得到了适应：插入物的设计使BHPIV3基因组长度保持为6的偶数倍，这是高效HPIV3复制所必需的，并被认为反映了核衣壳间距要求。21此外，插入的目的是保持这个六聚体组织内转录单位的间距。21重组BHPIV3/SARS-S病毒被回收并在其他地方描述的细胞培养中繁殖。11,12
BHPIV3/SARS-S和对照BHPIV3/Ctrl病毒的RNA基因组图谱
N=核衣壳蛋白。P=磷蛋白。F=融合糖蛋白。HN=血凝素-神经氨酸酶糖蛋白。L=聚合酶蛋白。每个基因开头和结尾的黑色条表示PIV3特异的转录信号，矩形之间的间隙表示PIV3-基因间三核苷酸。PIV3基因组3′端和5′端的先导（Le）和拖尾（Tr）序列是包含启动子序列的短外源区域。
我们使用与BHPIV3/SARS-S相同的方法构建和恢复了对照病毒，只是插入物的S开放阅读框被相同长度的外来序列（源自人类呼吸道合胞病毒基因组的互补拷贝）所取代没有任何重要的开放式阅读框架。因此，该控制基因将作为单独的mRNA表达，但不会编码重要的外源蛋白（该结构的详细信息可从Bukreyev获得）。
病毒生长及病毒学和血清学检测
BHPIV3/SARS-S和BHPIV3/4trl在LLC-MK2猴肾细胞上繁殖，并通过使用豚鼠红细胞（HPIV3 HN蛋白的特性）进行血液吸附以检测病毒感染，通过在相同细胞上限制稀释来测定病毒滴度。11,12标题以50%感染剂量（TCID）的组织培养单位表示50)其大小与斑块形成单位相似。
通过血凝抑制（HAI）测定法对HPIV3特异性血清抗体进行定量，在该测定法中，与已知的阳性和阴性对照标准平行，测试血清稀释液中HPIV3体外阻断豚鼠红细胞凝集的能力。11,12SARS冠状病毒在Vero猴肾细胞中繁殖，通过对相同细胞的稀释度进行限制，以50%的可见细胞病理学终点来测量病毒滴度。20
通过测试稀释液每孔中和100 TCID50单位SARS冠状病毒的能力，以及已知的阳性和阴性对照标准，在Vero细胞中定量SARS冠病毒特异性血清抗体。20每个样品在96孔板中每稀释4孔，在第3天和第4天读取病毒细胞病变效应，并表示为50%的终点。
S蛋白的检测
LLC-MK2细胞被BHPIV3/SARS-S或对照病毒感染5倍TCID50每细胞感染单位，感染后18h收获细胞。12此外，在感染后48小时收集覆盖其他感染细胞的培养基，并通过在4°C下8000 g离心18小时来浓缩病毒。重新悬浮病毒颗粒，并在30–60%w/v不连续蔗糖梯度下在130℃下离心000g在4°C下放置90分钟，然后收获带状病毒。使用NuPage蛋白电泳系统和WesternBreeze免疫检测试剂盒（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）进行Westernblot分析。我们用SARS冠状病毒感染小鼠的血清样本检测了S蛋白20和碱性磷酸酶结合山羊抗鼠IgG（Invitrogen）的第二抗体。
非洲绿猴的感染和挑战
我们使用了八只成年非洲绿猴，雌雄各半（体重3.6-5.9公斤），经证实没有检测到抗HPIV3或SARS冠状病毒的血清抗体。我们用BHPIV3/SARS-S免疫四只动物，用BHPIV3/Ctrl免疫四只。我们使用了一种单一的鼻内和气管内联合接种6TCID公司50每个部位1mL接种液中的病毒单位（合并剂量为106.3TCID公司50单位）。
首先用肌肉注射10mg/kg剂量的盐酸氯胺酮对动物进行麻醉，然后将其置于背部卧位。通过每个鼻孔，我们用无菌鲁尔注射器向每个鼻孔注入约3-5 mm的0.5 mL接种物。气管内接种时，使用无菌不锈钢喉镜观察会厌，1mL接种物通过一根无菌软管输送，该软管插入会厌口约3cm处。我们对每只动物都使用了单独的消毒器械。在第0-10、12和14天取鼻咽拭子，在第2、4、6、8、10和14天进行气管灌洗，22如前所述，滴定BHPIV3/SARS-S和BHPIV3/4trl。对于气管灌洗，我们使用喉镜和如上所述放置的导管，以及2毫升冲洗量的磷酸盐缓冲盐水，然后将其滴入并吸回。在SARS冠状病毒挑战中，动物被给予类似的鼻内和气管内联合接种106TCID公司50每个部位1mL接种液中的病毒单位。鼻咽拭子和气管灌洗液的获取时间与初次免疫后使用的时间相同。这些实验是在批准的动物生物安全3级设施中进行的。如前所述进行病毒滴定。我们在免疫前1天（第1天）、激发前1天、激发后28天（第27天）采集了血清样本，并对其进行了上述病毒特异性抗体分析。
灵长类动物研究由美国国立卫生研究院动物护理和使用委员会批准，并在国际实验动物护理评估和认证协会批准的实验室进行。
资金来源的作用
研究发起人在研究设计、数据收集、数据分析、数据解释或报告撰写过程中没有任何角色。
结果
改良BHPIV3表达SARS冠状病毒包膜棘突S蛋白(). 回收重组BHPIV3/SARS-S病毒，并在细胞培养物中与对照病毒BHPIV3/Ctrl平行繁殖。外源插入物的存在并不影响载体体外复制的效率。BHPIV3基因组是一条15·5千碱基的单链负义RNA，包含6个非重叠基因(). 病毒编码的聚合酶在基因组的左端启动，依次将每个基因，包括任何插入的外源基因转录到一个单独的mRNA中。通过对感染BHPIV3/SARS-S的LLC-MK2细胞分离的细胞内RNA进行northern blot分析，确认S序列作为一个单独的mRNA的正确表达（数据未显示）。
用SARS冠状病毒感染小鼠血清对BHPIV3/SARS-S感染细胞的裂解物进行western blot分析，证实SARS-冠状病毒S蛋白的表达20(，车道3）。这表明S蛋白以两条主要的扩散带的形式迁移，约170和200 kDa。S蛋白的两种形式可能因糖基化程度不同而不同；根据核苷酸序列，预测的全长未修饰S蛋白为138kDa，具有23个潜在的糖基化位点。5,6,7没有证据表明SARS S蛋白被蛋白水解分解为两个亚单位，就像某些冠状病毒一样。由于SARS-冠状病毒S蛋白是一种跨膜病毒成分，而BHPIV3也是一种包膜病毒，我们想确定S蛋白是否并入BHPIV4颗粒中。Western blot分析未检测到纯化、浓缩的BHPIV3/SARS-S病毒颗粒中的S蛋白(，车道1），直接考马斯染色条件下(，lane 2）表明病毒蛋白的数量大于western blot检测所需的数量。S蛋白在病毒中没有显著掺入，这表明其表达不太可能影响载体的向性，并且是一个安全因素。
BHPIV3/SARS-S在细胞培养中表达SARS-冠状病毒S蛋白及其在BHPIV3病毒颗粒中的缺失
A： western blot分析显示，在感染BHPIV3/SARS-S的细胞裂解液中存在SARS-冠状病毒S蛋白（第3道），而在感染BHPI V3/Ctrl的细胞裂解物中不存在该蛋白（第4道）。在纯化、浓缩的BHPIV3/SARS-S病毒颗粒（通道1）或阴性对照BHPIV3/4trl（通道2）中未检测到S蛋白。B： 对装有纯化、浓缩BHPIV3/Ctrl（第1道）和BHPIV3/4AS-S（第2道）复制样品的凝胶直接考马斯染色显示，病毒蛋白的存在超出了通过western blot分析检测所需的量。
显示了猴子对免疫的反应。对免疫后采集的鼻拭子样本的分析表明，峰值滴度（3.9与4.3对数10TCID公司50/mL）和脱落持续时间（5.8与7·8天）。对气管灌洗液样本的分析表明，感染BHPIV3/SARS-S的四只动物中有两只没有检测到病毒的脱落，而另外两只在2天后出现了一些脱落，但这比BHPIV3/4免疫动物的脱落要少(). 因此，SARS S蛋白的表达对载体的复制有减弱作用，尤其是在下呼吸道。然而，通过HAI检测，BHPIV3/SARS-S和BHPIV3/4trl均诱导了适度滴度的HPIV3特异性抗体(). 此外，BHPIV3/SARS-S诱导了在体外中和SARS-S冠状病毒的可检测血清抗体水平（平均相互滴度为3.9 log2).
表1
BHPIV3/SARS-S和BHPIV3/Ctrl对粘膜免疫的反应
|
| BHPIV3脱落
| 血清抗体
|
|---|
|
| 鼻咽拭子 | 气管灌洗 |
|---|
| | 持续时间（天） | 峰值滴度（对数10TCID公司50/毫升） | 持续时间（天） | 峰值滴定度（log10TCID公司50/毫升） | HPIV3 HAI滴度（倒数对数2) | SARS冠状病毒中性化滴度（倒数对数2) |
|---|
| BHPIV3/SARS-S |
| 猴子 |
| V101（F） | 三 | 3·7 | 0 | ≤0·5* | 9 | 4·1 |
| V104（F） | 5 | 3·5 | 0 | ≤0·5 | 8 | 3·2 |
| V117（F） | 7 | 3·2 | 1 | 2·0 | 8 | 4·2 |
| V191（百万）
| 8
| 5·0
| 三
| 2·5
| 9
| 4·2
|
| BHPIV3/控制 |
| 猴子 |
| V099（F） | 9 | 4·5 | 9 | 3·5 | 8 | ≤2† |
| V103（F） | 6 | 5·0 | 5 | 6·5 | 9 | ≤2 |
| V107（F） | 6 | 3·5 | 三 | 3·5 | 9 | ≤2 |
| 122（F） | 10 | 4·2 | 5 | 2·7 | 10 | ≤2 |
显示了对SARS冠状病毒挑战的反应。所有四只接种了BHPIV3/Ctrl的猴子都从上下呼吸道感染了SARS冠状病毒。相比之下，任何一天接种BHPIV3/SARS-S的动物都没有从上呼吸道或下呼吸道传播SARS冠状病毒。挑战28天后SARS冠状病毒中和血清抗体滴度如所示激发后BHPIV3/SARS-S组的滴度增加可能是对病毒接种物中的抗原产生免疫反应或SARS冠状病毒复制水平低的结果。
表2
接种BHPIV3/SARS-S或BHPIV3/4trl的猴子对SARS冠状病毒攻击的反应
|
| SARS冠状病毒脱落
| 血清抗体
|
|---|
|
| 鼻咽拭子
| 气管灌洗
|
|---|
| | 持续时间（天） | 峰值滴定度（log10TCID公司50/毫升） | 持续时间（天） | 峰值滴定度（log10TCID公司50/毫升） | SARS冠状病毒中和滴度（倒数对数2) |
|---|
| BHPIV3/SARS-S |
| 猴子 |
| V101（F）版本 | 0 | ≤0·5* | 0 | ≤0·5* | 7·2 |
| V104（F） | 0 | ≤0·5 | 0 | ≤0·5 | 8·2 |
| V117（F） | 0 | ≤0.5 | 0 | ≤0·5 | 7·2 |
| V191（百万）
| 0
| ≤0·5
| 0
| ≤0·5
| 7·2
|
| BHPIV3/控制 |
| 猴子 |
| V099（F） | 7 | 1·5 | 三 | 3·5 | 7·1 |
| V103（F） | 5 | 1·7 | 0 | ≤0·5 | 6·2 |
| V107（F） | 7 | 3·0 | 三 | 2·5 | 7·0 |
| V122（F） | 7 | 1·5 | 1 | 3·0 | 7·2 |
讨论
我们利用现有的HPIV3减毒活疫苗候选株BHPIV3作为表达SARS冠状病毒S蛋白的载体，开发了一种实验性SARS疫苗。使用这种呼吸道病毒作为载体可以对呼吸道进行直接免疫，呼吸道是SARS冠状病毒传播和疾病的主要场所。接种了BHPIV3/SARS-S疫苗的猴子对挑战性感染具有高度保护作用。这一发现确定了S蛋白是SARS冠状病毒的主要保护性抗原，并表明SARS疫苗应包括该蛋白。
呼吸道局部免疫也可诱发可检测到的SARS冠状病毒中和血清抗体，这是系统免疫反应的证据。然而，BHPIV3/SARS-S诱导的免疫后滴度几乎是BHPIV3/4免疫动物SARS-冠状病毒感染的八倍。这种免疫原性的差异可能反映了HPIV3对呼吸道的自然限制，而SARS冠状病毒至少在非人灵长类动物中会系统传播。8,9没有证据表明免疫介导的感染或疾病增强，这是一种冠状病毒，即猫传染性腹膜炎病毒。23因此，我们的结果表明，用载体SARS S蛋白进行一次粘膜免疫足以防止大剂量SARS冠状病毒攻击后的脱落。
一些食蟹猴(束状猕猴)据报道，感染SARS冠状病毒后出现临床症状，包括短暂皮疹、呼吸窘迫和嗜睡。24,8我们调查了三种猴子，即食蟹猴、恒河猴(穆拉塔)，以及非洲绿猴，因为SARS冠状病毒复制和可能的疾病的许可性（未公布的数据）。在这三只猴子中，非洲绿猴支持最高水平的复制，这是通过病毒脱落来衡量的，因此被用于本研究。这三个物种中的任何一个物种的12只动物都没有出现明显的疾病迹象，我们在这项研究中没有注意到疾病迹象。小鼠、雪貂和猫被证明支持高水平的SARS冠状病毒肺部复制，一些受感染的雪貂变得昏睡。25,20我们没有在小鼠中评估BHPIV3/SARS-S，因为HPIV3疫苗载体在该动物中的复制受到严重限制，猫和雪貂模型是最近才报道的。因此，尽管我们的研究显示了对挑战性病毒脱落的完全保护，但我们无法评估是否能够对临床疾病症状提供保护。这种研究局限性并不罕见。关于人类病毒，实验动物很少能提供在人类身上观察到的感染和疾病的可靠模型，而且疾病征兆通常很少、改变或缺失。测量实验动物分泌物或其他样本中的感染性挑战病毒是测量病毒疫苗效力的通用标准。鉴于与人类的系统发育和解剖相似性，在非人灵长类动物中评估实验疫苗尤为重要，这是临床试验前的适当最后一步。
减毒型HPIV3正在积极开发，作为婴幼儿鼻内免疫的疫苗，基于HPIV3的载体疫苗也在积极开发中，这些疫苗还表达呼吸道病原体的保护性抗原，如麻疹病毒、呼吸道合胞病毒和偏肺病毒。12,13,15HPIV3可有效感染呼吸道，但不会扩散到呼吸道以外，这是一个重要的安全因素。以HPIV3为基础的载体已被证明能有效诱导对许多外来抗原的局部和全身免疫。12,13,15此外，经鼻安全注射减毒HPIV3和相关病毒已被证明是可能的。16,26,27另一个安全特征是，对于以HPIV3为代表的病毒家族，在自然界中几乎不存在RNA重组，而在冠状病毒中重组极为频繁，与循环中的人类冠状病毒重组的可能性是对活性减弱SARS冠状病毒疫苗病毒的担忧。
正如目前构建的那样，BHPIV3/SARS-S载体是一种很好的临床试验候选疫苗，该疫苗可能对婴儿和幼儿的HPIV3和SARS具有高度减毒、安全和有效的效果，并且该载体可以在婴儿和幼儿中高效复制。如果出现传染性更强的SARS冠状病毒，需要对婴儿和儿童进行免疫接种，这种疫苗将特别有用。然而，任何携带普通人类病原体保护性抗原的复制病毒载体，如腺病毒或HPIV3，都不太可能在成年人中复制得足够好而具有免疫原性，因为这些病原体的中和抗体普遍存在。26,27幸运的是，副流感病毒能够在体外或体内交换表面蛋白而不丧失感染性。28,29因此，有可能将HPIV3 HN和F表面蛋白替换为普通人群缺乏免疫力的抗原特异性副流感病毒的表面蛋白，尤其是许多禽副流感病毒中的一种，如新城疫弱毒株。由此产生的载体将成为一种有用的SARS疫苗，用于整个人类的粘膜免疫。
致谢
我们感谢Kim-Chi Tran提供的技术援助，感谢Kathryn Hanley在统计分析方面提供的帮助。该项目是NIAID校内项目的一部分。
贡献者
Bukreyev参与了构建物的设计、重组病毒的构建和体外表征、猴子实验的设计、SARS冠状病毒滴定以及结果的解释。E Lamirande参与了重组病毒的构建和体外表征、SARS冠状病毒滴定和血清中和分析。U Buchholz对BHPIV3的恢复提出了有用的建议，进行了northern blot分析，并参与了SARS冠状病毒滴定。L Vogel准备挑战病毒并参与血清中和试验。W R Elkins和M St Claire监督了动物实验。B墨菲参与了实验计划和结果解释。K Subbarao制备了SARS-冠状病毒RNA和小鼠SARS-冠状病毒免疫血清，建立了非洲绿猴SARS冠状病毒模型，并参与了实验规划和结果解释。P Collins参与了结构设计、实验规划和结果解释，并为项目提供了一般指导。
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