SARS冠状病毒的核衣壳蛋白能够通过C末端209氨基酸相互作用域进行自结合^☆

摘要

严重急性呼吸综合征（SARS）是一种新出现的传染病。SARS的病原体已被确定为一种新型冠状病毒，即SARS-相关冠状病毒（SARS-CoV）[1],[2],[3]截至2003年6月30日，全球32个国家或地区向世界卫生组织（世卫组织）报告了8447例可能的SARS病例，包括811例死亡。

SARS病毒基因组由大约30000个核苷酸组成，这些核苷酸被组织成大约13-15个开放阅读框（ORF），只考虑那些翻译能力超过50个氨基酸的核苷酸[4],[5]与其他已知冠状病毒相应ORF的序列比较揭示了冠状病毒典型的类似基因组织模式[6].

SARS病毒的1259核苷酸N基因位于3^′基因组的末端。这种46 kDa的结构蛋白已被预测与病毒RNA相互作用，两者都构成了病毒核衣壳。冠状病毒的N蛋白存在于二十面体核心和内部螺旋核衣壳中[7]由于迄今为止还没有关于SARS冠状病毒N蛋白的结构和功能的研究报道，我们PCR扩增和克隆了SARS-CoV的N蛋白，并利用酵母双杂交系统研究了其通过自结合形成二聚体的能力。在这里，我们报道了SARS冠状病毒的N蛋白能够自我结合，并且需要C末端富含螺旋的209氨基酸区域来促进这种蛋白质相互作用。

材料和方法

生长培养基、酵母菌株和质粒构建。本研究中使用的所有菌株、质粒和质粒结构在表1从克隆的基因组构建物中PCR扩增出SARS冠状病毒（新加坡分离物）的全长N基因{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“NC_004718”，“term_id”：“30271926”，“term_text”：“NC_00471八”}}NC_004718号，并克隆到pCR-XL-TOPO载体（Invitrogen）中。对全长N基因进行DNA测序，并根据SARS冠状病毒全基因组的相应区域验证插入物{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“NC_004718”，“term_id”：“30271926”，“term_text”：“NC_00471八”}}NC_004718号.使用限制性内切酶从pCR-XL-TOPO-N构建物中切除全长N基因生态RI和克拉一、 并连接到pGADT7向量以生成与GAL4激活域（AD）的N端帧内融合。为了与GAL4的DNA结合域融合克隆N，用Nco公司我和Pst（磅/平方英尺）I、 并将切除的片段连接到pAS2载体中，该载体用同一对限制性内切酶线性化。通过消化pGADT7-N，将HA标记的N克隆到pSGI中Bgl公司II和结扎成pSGI，用相同的酶消化。Myc公司-标记的N通过连接巴姆HI和阿帕将pCR-XL-TOPO-N中的I片段插入用相同酶消化的pcDNA 3.1载体中。所有DNA操作均按照Sambrook等人的描述进行。[8]所有缺失结构都是通过亚克隆全长N基因生成的，如表1所有结构均通过限制性消化和测序进行验证。

酵母双杂交技术.基于GAL4的双混合系统，由Stephen Elledge博士善意提供[6]，包含pAS2（DNA结合域载体）和pACT2（激活域载体），以及酵母报告菌株酿酒酵母AH109型(表1)被雇佣。使用含有pAS2-SNF1和pACT2-SNF4的宿主菌株作为阳性对照[9]。AH109主机包含这两者的集成副本HIS3型和lacZ公司报告基因受GAL4结合位点控制。使用醋酸锂程序用合适的质粒转化AH109酵母菌株，并在没有Trp和Leu（SDTrp⁻和SDLeu⁻分别）。在不含Leu、Trp和His（SDLeu）的SD板上测试蛋白质相互作用⁻Trp公司⁻伊斯⁻). 在30°C孵育3天后，分离单个菌落，并通过50 mM oft 3-氨基-1,2,3-三唑（3AT）分析和二倍体His分析测试液体和过滤液β-半乳糖苷酶活性。过滤β-半乳糖苷酶检测是一个直接反映蛋白质-蛋白质相互作用强度的参数，通过将双重转化的酵母菌落划线到滤纸上并使其在选择培养基上生长2天来进行。通过在液氮中冷冻浸有酵母的过滤器并在室温下解冻，使酵母细胞渗透。将过滤器放置在第二个过滤器上，该过滤器预先浸泡在含有300 mg/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚-β的0.1 M磷酸盐缓冲液（pH 7.0）中-d日-吡喃半乳糖苷（CPRG）和0.27%β-巯基乙醇。滤镜放置48小时，形成蓝色，表明蛋白质相互作用呈阳性。如前所述，使用底物CPRG测定液体β-半乳糖苷酶活性[10],[11]测定了五个独立转化子的相对酶活性。收集酵母细胞数量的定量分析数据，是三次分析的平均值±SEM。使用适当的阳性和阴性对照，以及缓冲空白。使用含有pAS2-SNF1和pACT2-SNF4的AH109宿主菌株作为阳性对照[9].

免疫共沉淀法和免疫印迹法使用脂质体试剂将pSGI-N或pCDNA3.1-N质粒或两者转染COS-1细胞。转染后48小时，在PBS中洗涤细胞一次，然后在裂解缓冲液（20mM Tris（pH 7.5）、150mM NaCl、1mM EDTA、1mM EGTA、1%Triton X-100、2.5mM焦磷酸钠、1mMβ-甘油PO）中裂解₄，1 mM钠_三SO公司₄)，含蛋白酶抑制剂鸡尾酒。将等量的蛋白质与相应抗体在4°C下孵育过夜。向样品中添加100μl 10%的蛋白A–Sepharose悬浮液。将混合物在4°C下摇晃1 h，然后在裂解缓冲液中洗涤四次珠子，并通过煮沸样品5 min，在2×SDS染料中洗脱蛋白质。样品通过10%SDS-PAGE溶解并转移到硝化纤维素膜上。用0.5%的无脂奶粉在PBST中封闭膜1小时，并与一级抗体孵育过夜。然后在PBST中清洗印迹三次，与抗鼠IgG HRPO孵育1 h，清洗三次，并使用制造商推荐的ECL检测方法（细胞信号技术）检测条带。

结果和讨论

全长N蛋白可以形成二聚体

将SARS冠状病毒（新加坡分离物）的核衣壳（N）蛋白克隆到酵母双杂交载体中(表1)导致GAL4-DNA结合结构域和GAL4激活结构域与N蛋白的N-末端框内融合。为了确认N蛋白的阅读框架和表达，使用基于兔网织红细胞的偶联转录-翻译系统（Promega）在体外表达N蛋白，并使用抗HA抗体进行免疫沉淀（数据未显示）。酿酒酵母AH109（MATatrp1-901型他的3 leu2-3、112 ura3-52 ade2 gal4 gal80URA3:：GAL-lacZ LYS2:：GAL-his3）细胞被单质粒转化，或与含有SARS-CoV N的gal4 BD-和AD载体共转化。含有pAS2-SNF1和pACT2-SNF4的AH109宿主菌株被用作阳性对照[9].AH109包含HIS3和紫胶Z报告基因受GAL4结合位点控制。双杂交分析结果如所示图1本试验中使用的单个转化子为含有BD-N的AH109酵母细胞和含有AD-N的细胞。仅含有BD-和AD-v载体的酵母宿主细胞也用作阴性对照(图1). 所有这些转化子都生长在YPD非选择性培养基上。未转化的宿主细胞也作为阴性对照。单独含有BD-vector或与N融合的单个转化子在合成葡萄糖Trp上生长⁻板（SDTrp⁻). 相应地，单独含有AD-vector或与N融合的单个转化子在合成葡萄糖亮氨酸上生长⁻板（SDLeu⁻). 将共转化子同样接种在缺乏Trp或Leu或两者都缺乏的YPD和合成葡萄糖培养基上，随后将所得菌落接种在His上⁻培养基（SDTrp⁻卢⁻伊斯⁻)测试他的原生质体。两种SDTrp中包含BD-N和AD-N结构的共转换子的生长⁻和SDLeu⁻平板显示转化细胞中存在这两种质粒。这些克隆在SDTrp上的生长⁻卢⁻伊斯⁻培养基显示，由于特定的N–N相互作用，通过GAL4反式激活子的重组启动HIS3基因的转录。将菌落转移到硝化纤维素过滤器上，并进行β-半乳糖苷酶过滤试验[12],[13],[14]通过本试验对含有BD-N和AD-N结构的共转化子以及所有阳性和阴性对照进行测试。β-半乳糖苷酶过滤测定的结果与SDHis的结果一致⁻生长实验。

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图1

酵母双杂交结果显示SARS-CoV N蛋白的全长同型相互作用。YPD酵母蛋白胨葡萄糖培养基（无选择），SDTrp⁻，SDLeu⁻、SDTrp⁻卢⁻和SDH⁻分别是缺乏Trp、Leu、Trp-Leu和Trp-Leu-His的限制性生长介质。β-半乳糖苷酶过滤分析结果也显示出来。

进行液体β-半乳糖苷酶测定，并用底物氯酚红-β测定活性-d日-如上所述的吡喃半乳糖苷（CPRG）[15],[16]单独的宿主菌株AH109，连同含有AD-N和BD-N的单个转化体和含有不含融合蛋白的AD-/BD-的共转化体，BD-/AD-和含有BD-N或AD-N的单个转化体一起进行测试。阴性对照（宿主未转化细胞）几乎没有显示液体β-半乳糖苷酶活性。BD-1111/AD-1112是阳性对照，而含有BD-N/AD-N的克隆是本实验的测试样本(图2). 在每组的五个独立转化子中测定相对酶活性。我们的实验结果表明，AD-N和BD-N蛋白之间存在较强的蛋白-蛋白质相互作用。

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图2

液体β-半乳糖苷酶检测结果。对单个和共转化产物进行液体β-半乳糖苷酶分析，并与其他产物进行比较。值以任意单位给出。每个条形图上方的数字表示五个独立转化体的平均值。

为了进一步确认哺乳动物细胞环境中的这些相互作用，我们使用融合了两个不同标签的N蛋白进行了共免疫沉淀分析。用氨基末端HA-标记的N或羧基末端myc-标记的N或者两者转染COS-1细胞。随后使用各自的抗体对裂解液进行免疫沉淀，并使用HA抗体进行免疫印迹。车道2英寸图3显示了使用抗myc抗体免疫沉淀的共转染样品。第1栏显示了使用抗HA抗体免疫沉淀的HA标记的N转染样品，作为阳性对照。通道3显示myc标记的N转染样本与抗HA抗体免疫沉淀，作为阴性对照。通道4显示使用myc抗体的myc标记的N免疫沉淀。这些结果清楚地表明，N蛋白能够在哺乳动物细胞环境中发生同二聚体。为了形成SARS-CoV的衣壳，核衣壳蛋白必须寡聚。因此，我们的数据为早期关于SARS病毒N蛋白的预测提供了功能验证。对N的分子解剖进行了进一步的研究，以绘制负责这种相互作用的N区域。

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图3

用HA-N、MYC-Nor二者转染COS1细胞，用各自的抗体进行免疫沉淀，用10%SDS-PAGE溶解，并用材料和方法中所述的抗-HA抗体进行蛋白质印迹。通道1显示用相同抗体进行HA-N免疫沉淀，通道2和通道3分别显示用抗myc或抗-HA抗体进行免疫沉淀的共转染细胞，通道4显示用抗-myc抗体进行myc-N免疫沉淀。

210氨基酸羧基末端区域负责N二聚反应

设计各种缺失来表征N蛋白的同二聚体结构域。因此，质粒pGADT7 N 1-310、pGADT7 N 1-630、pGADT7 N 1-830、pGADT7 N 310-1260和pGADT7 N 630-1260如表1我们通过在0、5、10、20、25和50 mM 3-氨基三唑（AT）存在下测量HIS3报告基因来研究全长和截短N蛋白的所有这些相互作用的强度。这些结果表明，蛋白质-蛋白质相互作用的强度与His原营养状态有关。含有全长N蛋白融合的细胞在SD-His上生长⁻50 mM AT板，从而证实强同二聚体。

我们的两个杂交实验都包括一个pGADT7N缺失与全长融合蛋白pGADT7 N的共转化。这些实验的结果如所示图4AD 1-830、AD 1-630和AD 1-310构建物与全长N构建物（BD-N）共转化，缺乏报告基因激活。相反，当用全长BD-N进行测试时，AD-N 310-1260和AD-N 630-1260构建物显示出报告基因活性。用BD-N（全长）检测AD-N 310-1260和AD-N 630-1260时显示报告基因活性。然而，当AD 1-830、AD 1-630和AD 1-310与其相应的全长N结构（BD-N）共同转化时，没有显示报告基因激活。然而，630-1260和BD-N之间的相互作用强度低于全长N–N或ADN310-1260和全长N相互作用强度。因此，我们绘制了N蛋白二聚化的相互作用结构域，使其位于C末端的三分之一氨基酸中。在对N的预测二级结构模型进行研究后，我们发现该区域富含螺旋，并包含假定的核定位信号。

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图4

SARS-CoV N蛋白相互作用域分离的缺失分析。使用酵母双杂交方法，对每个显示的缺失与全长N蛋白一起进行测试，并对标记基因活性进行评分。在SDHis上研究了5、10、20、25和50 mM at浓度下的组氨酸原营养⁻媒体。对共转化物进行液体β-半乳糖苷酶分析，并显示N蛋白每次缺失的五个样本的平均值。这些缺失将N蛋白分为四个区域A、B、C和D。每个缺失条上的数字表示氨基酸。

在许多病毒中观察到核衣壳蛋白的自结合。这一过程导致病毒衣壳的形成，从而保护基因组免受细胞外因子的影响。在本报告中，我们使用了两种独立的分析来确定核衣壳分子之间的直接相互作用。这种二聚化过程可能导致N蛋白的多重聚合和随后的衣壳组装。虽然这种相互作用在体内的功能相关性尚不清楚，但我们的报告清楚地证明了SARS N蛋白分子之间的直接物理相互作用。此外，在酵母双杂交试验中，N–N共转化酵母细胞显示出在50 mM 3AT浓度下生长的能力，证明了其强大的自结合能力。然而，相互作用的确切机制尚不清楚。在广泛的病毒中，已观察到二硫键介导的核衣壳自结合[17],[18],[19],[20]但SARS的N蛋白无法做到这一点，因为从其氨基酸组成来看，它没有半胱氨酸。已从其他RNA病毒基因组（例如，马关节炎病毒和猿猴出血热病毒）的N蛋白中收集到观察结果。核衣壳蛋白中的二硫键被认为可以增强病毒的稳定性，例如乙型肝炎病毒[18]和人乳头瘤病毒[19]有趣的是，其他冠状病毒的N蛋白含有半胱氨酸残基，例如，MHV N含有2个半胱氨酸残留。虽然半胱氨酸是否在其他冠状病毒的核衣壳自结合中起作用尚不清楚，但SARS N蛋白中半胱氨酸残基的完全缺失意味着它在其他冠状病毒中是独特的。SARS病毒很可能采用了另一种构象策略来规避半胱氨酸缺失的问题。在用于二次预测的电子模型中，MHV和SARS的N蛋白都显示出一个亲水的富含螺旋的C末端。这种独特的二级结构可能是分子内紧密自结合的原因；然而，核衣壳蛋白自结合的确切机制和驱动力需要进一步研究。此外，由于SARS的N蛋白已被预测发挥其他调节功能[21]除了衣壳组装外，二聚体可能是调节蛋白质功能的激活开关。此外，在MHV中，发现RNA结合域位于163-229氨基酸之间的类似位置[20]包括C端富含螺旋的区域。我们已经确定SARS N蛋白的二聚体结构域定位于C末端螺旋丰富区域，因此建议SARS病毒对核衣壳形成采取类似的策略。

致谢

脚注

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