脊髓内注射脂多糖引起的炎症和原发性脱髓鞘

摘要

介绍

中枢神经系统内的炎症是神经系统疾病和感染的常见特征，但它是否直接导致神经元或胶质细胞损伤体内可能很难确定。例如，在多发性硬化症及其动物模型实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）等疾病中，免疫介导的炎症可能很突出，但很难将炎症的间接后果与其他正在进行的免疫介导的疾病过程区分开来。实验上，局部注射脂多糖（LPS）可在大多数组织中诱导炎症，通常情况下，大量中性粒细胞和单核细胞在几分钟内从血流侵入组织，巨噬细胞在该部位停留数天(伊塞库茨等1981年;西布尔斯基等1988年). 然而，向成人脑实质注射LPS会导致细胞反应的改变和减弱。因此，当注射到海马体后1-10天进行检查时，在皮肤中引起典型炎症反应（20 ng）的LPS数量不会导致中性粒细胞或单核细胞的募集(安德森等., 1992一). 尽管20–50 ng LPS可快速上调内皮细胞间黏附分子-1（ICAM-1）和血管细胞黏附分子（VCAM）的表达，但细胞内流减弱(贝尔和佩里，1995年)以及促炎细胞因子，如白细胞介素1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）；斯特恩等., 2000). 将LPS注射量增加至200–1000 ng，导致皮肤中性粒细胞大量外渗，但仍不会导致脑实质中性粒细胞的大量募集，尽管它确实会导致小胶质细胞活化和单核细胞募集(安德森等., 1992一;蒙特罗·梅尼等., 1994).

到目前为止，对脂多糖诱导的大脑炎症后果的研究往往侧重于相对急性的影响，并且他们没有使用高分辨率组织学技术来评估组织结构的变化。此外，尽管观察到大脑和脊髓在创伤损伤后的炎症反应可能不同，但迄今为止的研究忽略了向脊髓注射LPS(Schnell公司等., 1999). 因此，我们详细研究了向脊髓白质注射脂多糖的短期和长期后果。我们的研究使用光镜、电镜和免疫组织化学检查注射后28天的组织，以确定细胞募集的时间进程和局部组织结构的变化。我们报告，在中性粒细胞和巨噬细胞募集后，注射后延迟1周，在背索形成一个大的原发性脱髓鞘损伤。本研究中观察到的炎症相关脱髓鞘可能阐明了多发性硬化症，尤其是III型病变中炎症相关脱髓的机制。

材料和方法

结果

注射LPS导致炎症细胞早期侵入脊髓实质。这种侵犯并不局限于背索，最初与注射的背索神经纤维的明显损伤无关。然而，LPS注射后7-14天，在背索内形成了一个大的局灶性脱髓鞘损伤。14天开始进行髓鞘修复，28天出现大量髓鞘轴突；大部分髓鞘由雪旺细胞形成。

光学和电子显微镜

盐水注射

脊髓注射生理盐水(图1)显示损伤仅限于极少数经历Wallerian变性或脱髓鞘的轴突。这种损伤出现在注射后3天以上的时间段，发生在注射吸管插入区域的软脑膜表面，或沿注射吸管的线在背索深处。在盐水注射动物中未观察到再髓鞘化轴突。

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图1

光显微照片显示了7天前注射盐水的大致位置的左背索部分（箭头所示边缘）和相邻灰质。存在极少数发生Wallerian变性的轴突（箭头；插图中以更高的放大率显示），可能是由于插入了注射移液管。其他组织明显正常。比例尺：主图像，50µm；插图，20µm。

LPS注射

LPS注射后8小时脊髓内存在大量炎性细胞（见下文，脊髓内的细胞群），但脊髓在其他方面表现得非常正常，背索中的髓鞘似乎完好无损。

注射LPS后一天LPS注射到左背柱后1天，有强烈的局部反应迹象，与左背柱深部相邻的灰质组织受损。在背柱注射部位周围的组织中，外观基本正常(图2A). 电子显微镜检查显示，白质内细胞外间隙轻度增加，但这种情况并不普遍。偶尔可见脱髓鞘轴突，但这可能与针外伤有关。很少出现含有残渣的单核细胞。相反，PMN数量众多，既靠近血管，也在背柱的薄壁组织内，尤其是在与左背柱深部相邻的灰质中。

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图2

左背柱深部的光显微照片（箭头所示边缘）1天(A类)，3天(B类)、和5天(D类)在向该区域注射LPS后。炎症细胞存在，尤其是紧邻背索的灰质血管周围。一条这样的血管，由B类，以更高的放大倍数显示C类。在血管壁中可以看到单核细胞和中性粒细胞。5天时出现少量或无脱髓鞘(D类)，在插图中可以更清楚地看到这一点，插图以更高的放大率显示了方框中的区域。比例尺（如所示D类)=100µm英寸A类,B类和D类（主图像），20µm英寸C类，嵌入50µm。

注射LPS后三天在光学显微镜下，脊髓的外观与注射后1天观察到的相似，包括明显的细胞浸润(图2B). 虽然白质损伤不明显，但偶有脱髓鞘轴突（每节<10）。左侧背柱深部附近的灰质中可见大量炎性细胞，袖口由多层单核细胞和多形核细胞组成，围绕着该区域的一些血管(图2C). 电子显微镜显示明显水肿(图3A)延伸至正常的邻近白质。扩张的细胞外空间包含许多小的突起轮廓以及似乎由受损轴突产生的充满液体的空间。电子显微镜证实存在罕见的脱髓鞘轴突(图3A)此外，还显示了许多有髓纤维，其中内部的mesaxon是明显的。小血管内皮细胞微绒毛密度低，但没有明显的活化迹象（即肥大）。在整个病变中发现了含有髓鞘和可能的轴突碎片的吞噬细胞。

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图3

注射LPS后第一周内背柱的电子显微照片。(A类)注射LPS后3天，背索的一个区域。尽管对于大多数轴突来说，此时髓鞘没有严重破坏，但有极少数脱髓鞘轴突（插图中的箭头）。这些脱髓鞘轴突周围的细胞外间隙中缺乏髓鞘碎片，表明脱髓鞘在注射后很快发生。注射LPS后5天，其形态相似(B类)，大多数纤维的髓鞘大体正常，但也有少量干净脱髓鞘的轴突（如插图中的箭头）。然而，注射后7天(C类,D类和E类)，鞘表现出扩大的adaxonal隔室，包含各种数量的片层碎片是常见的。比例尺（如所示E类)=5µm英寸A类（插入=10µm），25µm英寸B类（插入=10µm），2µm英寸C类和D类和3.6µm英寸E类。

注射LPS后五天光镜显示细胞浸润减少，而水肿更明显(图2D). 电子显微镜下证实了这种膨胀的细胞外空间，发现其中含有絮状物质，可能是沉淀的蛋白质。(图3B). 含碎片的巨噬细胞很突出，尤其是在血管周围间隙，随着星形胶质细胞突起的退出，血管周围间隙也扩大了。所有这些变化都表明血脑屏障已被破坏。可以看到小面积的无髓鞘轴突，通常直径小于2µm，但很难确定这些是否是脱髓鞘的结果。

注射LPS后7天.背索内有大的病变(图4A和B)由脱髓鞘轴突组成，通常占据左右背索的腹半或腹三分之二，包括但不限于皮质脊髓束。典型的是，髓鞘的破坏似乎是从adaxonal区域向外进行，或从Schmidt–Lanterman切口的细胞质区域或偏执区域进行。髓鞘破裂出现在横切面上，从一个小泡状外观发展到一个更大的无组织网状膜(图3C-E). 在更斜的切片中，小水泡被视为管状，这种外观让人想起溶血磷脂酰胆碱诱导脱髓鞘早期的表现(霍尔和格雷格森，1971年). 在大多数情况下，脱髓鞘似乎是在没有骨髓单核细胞紧密并置的情况下发生的，并且可以看到凋亡细胞；然而，由于核和细胞质成分的溶解，很难根据形态学标准识别这种细胞。可以看到许多含有髓磷脂碎片的吞噬细胞，但细胞外间隙也含有大量膜状髓磷脂碎片。尽管脱髓鞘突出，轴突丢失，正如Wallerian变性的纤维数量所表明的那样，位于损伤部位嘴侧4mm处的背柱上升部分的感觉纤维数量都很小(图5A)位于病变尾侧4mm的下行皮质脊髓束(图5B).

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图4

背索7天的显微照片(A类和B类)，14天(C类和D类)和28天(E类和F类)注射LPS后。对于每对显微照片，左边的图像在低放大率下显示背索和邻近灰质，右边的图像在高放大率下显示病变区域。在低倍显微镜下(A类,C类和E类)背索的边缘被勾勒出来（箭头）。注射后7天，包括所有皮质脊髓束在内的大部分深背索正在脱髓鞘。B类显示了一些髓磷脂分解的轴突（箭头所示），其片层在adaxonal表面或中鞘分离。几个残渣填充的巨噬细胞（例如B类)存在。注射后14天，出现类似的病变区域(C类); 然而，在D类很明显，病变现在主要由明显裸露的脱髓鞘轴突（如箭头）或与细胞相关的早期脱髓鞘的轴突（例如箭头）组成。可见大量残渣填充的吞噬细胞。注射后28天，出现一个很大的病灶，几乎占据了所有的背索。此时，具有施万细胞重髓鞘化特征的印戒外观的轴突占主导地位（如箭头所示F类). 比例尺（如所示F类)=300µm英寸A类,C类和E类和30µm英寸B类,D类和F类。

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图5

注射LPS后7天，背部索内发生Wallerian变性程度的显微照片。A类显示非皮质脊髓束纤维最大Wallerian变性区域（如箭头和箭头），距离病灶嘴侧约4mm。图中箭头所示的退化轴突A类插图中以更高的放大倍数显示。皮质脊髓束位于病变尾部约4mm处，如图所示B类这表明，该地区相对较少的纤维（箭头和箭头）正在退化。图中箭头所示的退化轴突B类插图中以更高的放大倍数显示。比例尺（如所示B类)=主图像中50µm，插图中25µmA类插图中的厚度为20µmB类。

注射LPS后14天光镜检查显示大的混合病变，包括脱髓鞘轴突、残渣填充的巨噬细胞和与细胞相关的轴突(图4C和D). 这些轴突与细胞的联系通常是一对一的，这表明这些细胞是雪旺细胞。保留了一个扩大的细胞外空间，在电子显微镜下发现其中含有膜碎片。电子显微镜检查还提供了令人信服的证据，证明存在裸露的轴突、其他细胞过程（通常无法识别）和许多碎片填充的吞噬细胞。脱髓鞘轴突被细胞突起包围是常见的，鞘细胞的胞体常出现在断面上。在许多情况下，这些细胞似乎正在启动重髓鞘形成。

LPS注射后28天.病变修复和再髓鞘化进展顺利(图4E和F)水肿减轻。含有残渣的吞噬细胞更少。再髓鞘化是由雪旺细胞和少突胶质细胞的混合物完成的，典型的雪旺细胞再髓鞘主要位于病变核心。细胞外室中有少量髓鞘膜碎片，并有散在的囊泡，这些囊泡似乎来自死亡的轴突。在较大的病变中，背索的面积似乎扩大了(图4E)有髓纤维密度低于正常值(图4F).

脊髓内的细胞群

盐水注射

生理盐水注射8小时后，脊髓内的任何一个不同区域都没有超过一个PMN，这是注射LPS的动物产生细胞最多的时间间隔(表1). 脊髓周围的脑膜有13个PMN。在LPS注射脊髓中产生最多OX-52阳性细胞的时间间隔为7天时，在盐水注射脊髓中只观察到一个标记细胞。脑膜中还有两个细胞。同时，少量ED1阳性细胞出现在盐水注射的脊髓中；然而，大多数位于背索或脑膜。发现背索中的ED1阳性细胞从软脑膜表面呈直线延伸至左背柱，推测是与注射轨迹相关的轻微损伤所致。脑膜中发现的大多数ED1阳性细胞与用于标记注射部位的少量木炭颗粒有关。

LPS注射

注射LPS后，炎症细胞侵入脊髓的时间最早为8小时。在接下来的几天里，出现的炎性细胞总数以及构成该群体的细胞类型经历了一个特征模式，如以下段落所述。

项目管理编号注射后8小时，PMN的数量远大于ED1阳性巨噬细胞或OX-52阳性T淋巴细胞(表1). 鉴于用于计算PMN的切片厚度与用于巨噬细胞和T淋巴细胞的切片厚度的差异，无法进行直接比较。然而，值得注意的是，平均8小时时，在0.7µm厚的树脂切片中观察到的PMN比在25µm厚度的冷冻切片中观察的ED1阳性巨噬细胞多。8小时时，背索和脑膜中PMN数量最多，尽管在大多数区域，尤其是灰质中发现了大量PMN。到24小时，中性粒细胞数量减少了约四分之三，大多数细胞集中在背索和灰质中。注射后7天或之后观察到极少数PMN。

巨噬细胞/小胶质细胞.ED1-阳性细胞(表1,图6A)LPS注射后8小时出现在脊髓中，在8至24小时之间，这些细胞增加了约5倍。8小时时，背索占ED1阳性细胞总数的60%以上。背索和灰质中ED1阳性细胞的数量在8至24小时内显著增加。到第3天，ED1阳性的细胞总数已经下降，并且这种下降在3至7天之间持续。在第7、14和28天，ED1阳性细胞的数量相对稳定，这些细胞集中在背索内。

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图6

脊髓中巨噬细胞、T淋巴细胞和ICAM-1的免疫组织化学标记示例。7天前注射LPS的部位存在大量ED1阳性巨噬细胞(A类). 此时OX 52阳性T淋巴细胞的数量较少(B类)，但表示在所检查的任何时间点在背索内观察到的T淋巴细胞的最大数量(表1). 注射后4小时，背索内LPS注射部位的血管ICAM-1明显上调(C类)与同一动物背索注射部位前2.5厘米处出现的非常轻的标记相比(D类). 幼年脊髓血管标记的强度与D类（未显示数据）。比例尺（如所示D类)=30µm。

T淋巴细胞.切片内OX-52阳性T淋巴细胞总数始终少于ED1阳性细胞，并出现两个峰值(表1). 第一个较小的峰值出现在注射后24小时；所有细胞均与脑膜相关，而非神经实质。

事实上，在第7天之前，在背索内没有观察到T淋巴细胞。细胞数第二个峰值出现在注射后7天(图6B)主要是背索内细胞的结果。到14天时，T淋巴细胞数量已降至接近零，28天时仍保持不变。

B淋巴细胞注射LPS后，脊髓内未观察到RLN.9D3阳性细胞。

少突胶质细胞注射LPS后7天，背索损伤区内AdPC阳性细胞明显减少（2.9±2.9细胞/mm²，平均值±SD），而同一动物的背索相邻的未分离区域（77.4±16.6个细胞/mm²; 学生-纽曼-凯尔斯后测的单向方差分析，P（P）=0.027）或盐水注射对照动物的背索（122.1±48.1细胞/mm²;P（P）= 0.005).

星形细胞注射LPS后8 h、1、3和7天，背索内可见GFAP阳性星状细胞、突起细胞和细胞突起。注射7天后，标记强度和突起厚度增加，与LPS注射的背索直接相邻的灰质内GFAP免疫反应性增加(图7). 相邻灰质的标记增加持续14天，此时几乎整个受损区域是一个由中度GFAP-免疫反应过程组成的精细网络，偶尔出现较厚、标记更强烈的过程。LPS注射后28天，整个受损区域保持中度GFAP阳性，此时呈现鹅卵石状外观。偶尔出现的强标记突起似乎局限于病变的外围。这种病变主要由雪旺细胞组成，在髓鞘形成之前，雪旺细胞可以表达GFAP(杰森等., 1990). 因此，在14天和28天时病变处出现的适度标记可能代表髓鞘形成之前或之后雪旺细胞内GFAP的标记。根据之前对中枢神经系统中施万细胞髓鞘化区域的研究，可以预测该施万细胞区域中星形胶质细胞的任何消失(布莱克莫尔，1975年;Felts and Smith，1996年).

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图7

在脊髓内注射LPS 7天后，光镜显示动物背索（DF）和灰质（GM）之间的界面存在GFAP免疫反应。注射部位嘴侧2 cm的横截面如图所示A类，LPS注射部位的类似区域如图所示B类注意，星形胶质细胞突起的精细标记出现在背索离病灶较远的部位（箭头所示A类)和灰质（箭头A类). 注射部位星形胶质细胞的标记增加，背索两侧星形胶质细胞突起增厚（箭头所示B类)和灰质（箭头在B类)以及灰质中标记密度的总体增加。比例尺=50µm。

iNOS、ICAM-1和IL-1β免疫组织化学

注射LPS后2小时，在背索和邻近灰质内观察到少量iNOS免疫标记细胞。然而，在LPS注射后8小时观察到最显著的iNOS免疫标记，随后下降，直到7天只观察到少量iNOS阳性细胞，注射后14天没有出现。

幼稚的脊髓和头部2.5厘米长的脊髓到LPS注射部位，在一些较大的血管中都显示出轻微的ICAM-1标记(图6D). 注射LPS显著增加了这种标记，并且在注射LPS后4小时，标记血管的数量和标记的表观强度都增加了(图6C). 注射LPS后1、3和7天也观察到标记增加。除了标记血管外，我们还观察到LPS注射的背索中有两组ICAM-1阳性细胞。一种是最常与血管紧密相连的一组圆形细胞，另一种是散布在背索薄壁组织中的许多具有分支突起的细胞。这两个种群的数量都相对较少；前者在注射后3天内观察到，后者在注射后7天内仅出现少量标记细胞。据报道，LPS病变中可能存在多种细胞，在炎症介质（包括小胶质细胞）的作用下上调ICAM-1的表达(齐拉塞克等., 1993)，巨噬细胞(戈贝尔等., 1993)星形胶质细胞和少突胶质细胞(佐藤等., 1991)，可能有几种细胞类型促成了观察到的ICAM-1标记。

注射LPS后8 h，整个脊髓横截面出现大量IL-1β阳性细胞(图8). 与注射后4 h的IL-1β表达（在平行研究中检测，数据未显示）相比，阳性细胞集中在背索内或其附近，8 h时标记细胞数量更多，分布更广。此外，IL-1β阳性细胞在4 h和8 h的形态有所不同，LPS注射后24 h，出现两组IL-1β阳性细胞，其中分支OX-42阳性细胞和圆形ED1阳性细胞在8 h时常见，但分支OX-42-阳性细胞在4 h时占优势。IL-1β阳性细胞呈圆形分布于背索和邻近灰质，而IL-1β阴性细胞在远离背索的地方有短而粗的突起。与24小时相比，48小时时出现的IL-1β阳性细胞较少，且大多数呈圆形。到1周时，只有极少数IL-1β阳性细胞出现，这些细胞为OX-42阴性，但ED1阳性。这些细胞通常与大血管相邻，它们只构成了大量ED1阳性细胞中的一小部分。在检测的任何时间点均未观察到IL-1β阳性细胞表达GFAP。注射生理盐水24小时后，在检查的脊髓中未观察到IL-1β标记，尽管OX-42阳性细胞很常见，但很少观察到ED1阳性细胞。

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图8

LPS注射后8小时脊髓的表观荧光显微照片。A类显示了用抗IL-1β抗体标记的背索区域的相对低倍图像。这种促炎细胞因子存在于大量细胞中，其中大多数具有多个细胞过程。中显示的双标签部分B类和C类说明此时许多分支细胞对IL-1β均呈阳性（如箭头所示B类，用异硫氰酸荧光素观察）和OX-42（图中箭头C类（用罗丹明可视化），与静止的小胶质细胞相关的标记。然而，请注意，具有圆形形态的IL-1β阳性细胞通常不会标记为OX-42（B类和C类)和可能是巨噬细胞。比例尺（如所示A类)=140µm英寸A类和50µm英寸B类和C类。

PLP和MAG表达

在3天、5天和7天之前诱导的LPS损伤的双标记切片中检测PLP和MAG免疫反应。注射后三天，与同一切片中的其他白质区域相比，注射的背索内这些髓鞘蛋白没有明显丢失。然而，注射后5天，深背索（LPS诱导脱髓鞘病变最典型的发展部位）中MAG的免疫反应降低，而PLP的免疫反应则没有降低(图9A和B). LPS注射部位MAG的差异性丢失在注射7天后更为明显(图9C和D); 此时，在深背索内只观察到非常微弱的MAG标记(图9H)与背部浅柱的免疫反应性相比(图9F). 病变中的PLP免疫反应没有降低（与之相比图9E和G)事实上，PLP标记在该区域的强度稍高，这可能是由于髓磷脂断裂产生的抗原可用性增加所致。

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图9

LPS注射部位脊髓横截面的表观荧光显微照片5(A类和B类)或7天(C类–H（H）)更早。对切片进行PLP（左柱；罗丹明结合二级抗体）和MAG（右柱；异硫氰酸荧光素结合二级抗）双重标记，并使用适当的滤光片拍摄成对照片。低倍放大时(A类–D类)可以看到背索的整个下部（箭头所示）。注射5天后，背索显示出相对均匀的PLP标记(A类); 然而，几乎整个背索下半部的MAG免疫反应降低(B类). 注射7天后，整个背索再次出现PLP免疫反应(C类); 然而，在脊髓背索深处有一个相当大的区域，只有很少的MAG标记(D类). 该切片中未损伤的浅表背柱的一部分在高倍镜下显示E类和F类髓鞘显示为带有两种抗体的标记环。在背索深处拍摄的类似图像中，PLP免疫反应仍然明显(G公司); 然而，MAG免疫反应性(H（H）)几乎没有。比例尺（如所示H（H）)=200µm英寸A类–D类和20µm英寸E类–H（H）。

地塞米松治疗

地塞米松治疗可有效降低炎症反应的程度(图10A和B)LPS注射后1天，地塞米松处理的动物背索横切面表达iNOS的平均细胞数显著减少[242±79（平均值±SD），而盐处理的动物的细胞数为724±125；P（P）=0.005，学生的吨-测试]。然而，地塞米松治疗并没有降低脂多糖诱导的脊髓脱髓鞘程度(图10C–F). 注射LPS后14天进行检查时，地塞米松处理的动物背索脱髓鞘的平均横截面积（0.64±0.20 mm）²)实际大于用生理盐水处理的动物（0.41±0.14 mm²)，尽管这一差异在统计上并不显著(P（P）>0.10，学生的吨-测试）。注射LPS后14天，地塞米松治疗的动物皮损中的轴突往往被螺旋状的髓鞘碎片包围，而裸脱髓鞘轴突或与细胞进程相关的脱髓鞘轴突在盐处理动物的LPS皮损中特别常见。在地塞米松治疗的动物中，皮损看似增大的大小可能是由于髓磷脂碎片的物理体积增加导致其面积扩大所致。

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图10

每日腹腔注射地塞米松（1.5 mg/kg；A类,C类和E类)或盐水(B类,D类和F类)注射LPS前2天开始。在A类和B类表观荧光显微照片显示了1天前注射LPS部位iNOS阳性细胞的数量。地塞米松治疗(A类)与盐水处理相比，iNOS阳性细胞数量显著减少(B类; 统计分析见正文）。C类–F类显示地塞米松治疗后病变的光学和电子显微照片(C类和E类分别）和盐处理(D类和F类分别）动物注射LPS后14天。经盐处理的动物表现出与未经处理的动物相似的损伤，其巢穴中充满了脱髓鞘轴突（如箭头D类和F类)和细胞相关的脱髓鞘轴突（例如D类). 此时出现相对少量的细胞外髓鞘碎片（例如F类). 地塞米松治疗不能防止脱髓鞘，但可以延长碎片的存在，轴突周围出现分解的髓鞘螺旋（例如C类和E类). 比较D类具有C类，很明显，碎片填充的巨噬细胞（例如D类)与地塞米松治疗的动物相比，盐水治疗的动物的皮损更显著。比例尺（如所示F类)=135µm英寸A类和B类，20µm英寸C类和D类，和5µm英寸E类和F类。

注射纯化LPS

将高纯度LPS制剂注射到背索后10天，对病变进行检查。在所检查的三只动物中，这种脂多糖制剂产生了损伤(图11)这与未经纯化的LPS制剂相似，导致背索横截面积分别占23%、42%和37%的病变。

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图11

10天前将高纯度LPS注射到背索产生的损伤。(A类)注射水平的脊髓横截面的低倍光显微照片。背索的边界用箭头标出，可以看到一个由背索深半部大部分组成的病变。在B类中框所包围的区域A类以更高的放大倍数显示。该区域包含脱髓鞘轴突（如箭头）和髓鞘包围的轴突，在致密髓鞘和轴突之间有一个扩大的区域，与最内层板层的泡状形成一致（如箭头所示），如图3D所示。比例尺（如所示B类)=200µm英寸A类和20µm英寸B类。

讨论

我们已经描述了在大鼠脊髓白质中注射LPS后出现的炎症和脱髓鞘病变。注射LPS后8小时内，白质和邻近脊髓区域出现大量PMN和ED1阳性细胞，第一天达到峰值，之后下降。在病变的早期阶段，以灰质-白质边界为中心，背索中的髓鞘完好无损。然而，在延迟5-7天后，出现了一个大的脱髓鞘损伤，持续时间为9-14天，通常影响注射部位背索横截面积的50%以上。脱髓鞘是原发性的，注射部位的头侧（背索感觉部分）或尾侧（皮质脊髓束）Wallerian变性相对较少。脱髓鞘区少突胶质细胞数量减少；然而，这些细胞存活但失去与AdPC抗体反应的抗原的可能性不能被忽视。

许多研究已经检测了向中枢神经系统注射致炎因子的影响，包括脂多糖(安德森等., 1992一;贝尔和佩里，1995年;斯特恩等., 2000)，IL-1β(安德森等., 1992b条;明赫蒂等., 1999;Schnell公司等., 1999;伯纳德斯·西尔瓦等., 2001)，肿瘤坏死因子-α(安德森等., 1992b条;明赫蒂等., 1999;Schnell公司等., 1999;霍尔等., 2000)和干扰素γ(明赫蒂等., 1999). 典型的炎症反应是在中枢神经系统中诱发的，但与其他组织中的类似注射相比，炎症反应基本上是温和的(安德森等1992年一)一般来说，很少或没有脱髓鞘的报告，尽管脱髓鞘在大多数研究中没有进行专门检查。在两项检测髓磷脂的研究中，报告了一些有限的髓磷脂丢失。Matyszak和Perry（1995）发现将灭活的卡介苗-盖林（BCG）直接注射到海马体内会产生急性炎症反应，但不会导致髓鞘丢失。然而，当动物随后从外周接受BCG治疗时，通过免疫组织化学评估，出现了与髓鞘丢失相关的延迟型超敏反应。在随后的研究中(马蒂萨克等., 1997)研究表明，至少在小口袋中，这种髓鞘丢失是由原发性脱髓鞘引起的。Lehnardt及其同事发现，新生大鼠球周白质注射大剂量LPS（5µg）后，少突胶质细胞标记物RIP的免疫标记减少(莱纳德等., 2002). 然而，这种剂量的脂多糖在许多动物中产生破坏性的囊性病变，因此尽管髓鞘丢失的性质没有详细检查，但它似乎是继发于轴突变性。总之，本研究是首次报道直接由中枢神经系统注射炎症原引起的实质性原发性脱髓鞘。

将LPS注射到背索后脱髓鞘的机制尚不清楚，但可以考虑几种可能性。LPS是一种两亲性化合物，具有类似洗涤剂的性质，因此可以直接溶解少突胶质细胞膜。然而，有两条证据反对这种机制。首先，通过红细胞溶解试验，我们没有发现膜损伤的证据。其次，也许最令人信服的是，预计洗涤剂效应会相对迅速发生[参见溶血磷脂酰胆碱诱导的脱髓鞘(霍尔和格雷格森，1971年)]; 然而，注射LPS和出现明显脱髓鞘之间延迟了近一周。

也有可能是脂多糖诱导的炎症激活了潜伏的病毒感染，导致少突胶质细胞的破坏和脱髓鞘。某些病毒，例如嗜神经性冠状病毒和泰勒病毒，可以引起中枢神经系统内的脱髓鞘（综述见Fazakerly和Walker，2003年). 然而，在动物饲养设施内对监测动物进行的血清学筛查并没有发现对包括冠状病毒和泰勒病毒在内的一系列病原体的抗体。我们认为去污剂作用或病毒激活不太可能导致脱髓鞘。

LPS可能对少突胶质细胞有直接毒性，可能通过质膜受体发挥作用。研究表明，脂多糖对少突胶质细胞祖细胞的存活有不利影响，表明这种直接细胞损伤体外(莫里纳·霍尔加多等., 2001). 然而，LPS受体的mRNA要么缺失[Toll样受体4（TLR4）]，要么仅在少突胶质细胞前体中发现极低水平（CD14）(莱纳德等., 2002). 另一方面，许多LPS的商业制剂已被证明含有具有高度生物活性的污染物，并且可以激活TLR4以外的受体，包括Toll样受体2（TLR2）(赫施菲尔德等., 2000)，一种被报道由少突胶质细胞表达的受体(Bsibsi公司等., 2002). 这些制剂激活C3H/HeJ小鼠白细胞的能力可能最能说明这种污染，而C3H/HeJ小鼠缺乏功能性TLR4(莫里森等1976年). 为了研究我们的典型LPS制剂确实通过其他受体发挥作用的可能性，我们还研究了不激活C3H/HeJ小鼠细胞的LPS制剂的作用。此类注射引起的病变(图11)与低纯度LPS制剂产生的损伤相似，这表明损伤是LPS的结果，正如预期的那样，可能由TLR4激活介导。因此，如果TLR4在成人少突胶质细胞中缺失，他们不太可能对LPS直接反应，因为该受体被认为在LPS结合后的信号转导中起关键作用(波尔托拉克等., 1998;星野等., 1999). 这些考虑表明LPS可能通过其他间接机制发挥作用。

调查结果之间的明显冲突莫里纳·霍尔加多等. (2001)，表明少突胶质细胞祖细胞对脂多糖敏感，似乎缺乏合适的受体，如下所示莱纳德等. (2002)可能是由于所检测培养物的细胞纯度。Lehnardt及其同事发现，脂多糖对少突胶质细胞祖细胞的有害作用依赖于小胶质细胞的存在(莱纳德等., 2002)LPS暴露的小胶质细胞（或星形胶质细胞）条件培养基损伤少突胶质细胞祖细胞的观察也支持了这些细胞的作用(庞等., 2000). 造成这种情况的因素尚不清楚，但TNF-α可能发挥作用，因为这种细胞因子已被证明会损害啮齿动物(Selmaj和Raine，1988年;Cammer，2002年)和人类(朱列维茨等., 2003)少突胶质细胞体外然而，向白质注射TNF-α体内不会导致脱髓鞘(霍尔等., 2000)因此，如果涉及该代理人，它可能会与其他因素协同行动；或者脱髓鞘可能是慢性而非急性接触TNF-α所致。最近的证据表明，过氧亚硝酸盐（由一氧化氮和超氧阴离子形成）在LPS诱导的小胶质细胞介导的少突胶质细胞损伤中起着关键作用体外(锂等., 2004). 因此，虽然LPS可能对少突胶质细胞没有直接毒性，但它可以通过活化的小胶质细胞、星形胶质细胞或巨噬细胞衍生的因子间接引起脱髓鞘。与这种可能性相反的是，地塞米松治疗减少了炎症反应，表达iNOS的细胞减少表明了这一点，但脱髓鞘至少与对照动物一样广泛。众所周知，地塞米松可以抑制LPS诱导的单核细胞转录因子核因子-κB和活化蛋白-1的激活，从而减少炎症介质（如IL-1β）的产生(Jeon（吉恩）等., 2000). 地塞米松不能降低脱髓鞘程度的原因有几种可能的解释。首先，地塞米松治疗可能没有充分抑制炎症。可能是这种情况，因为iNOS活性在病变中被抑制，但没有被消除。其次，LPS和地塞米松的细胞作用是复杂的，LPS通过未受地塞米森影响的途径激活细胞也可能发生，可能是通过TLR4激活后的MyD88依赖性级联反应（有关综述，请参阅Akira和Takeda，2004年). 当然，地塞米松最近实际上被证明可以增强组织因子的表达(雷迪等., 2004)，一种存在于单核细胞上的跨膜糖蛋白，可激活凝血级联。组织因子的局部激活可能导致缺血，从而加重病变。总之，虽然脂多糖诱导脱髓鞘的机制尚不清楚，但我们赞成少突胶质细胞被激活的炎症细胞产生的一种或多种因子杀死的观点，特别是鉴于LPS激活的小胶质细胞能够在培养中诱导少突胶质损伤(莱纳德等., 2002).

目前对脂多糖诱导脱髓鞘的观察能否阐明炎症性脱髓鞘疾病中所观察到的脱髓鞘机制？在包括多发性硬化症在内的许多疾病中，中枢神经系统脱髓鞘与炎症相关(拉斯曼，1999)、Devic视神经脊髓炎(包德温等., 1998)，复发性横贯性脊髓炎(潘迪特和饶，1996)，HTLV-1相关性热带痉挛性截瘫(Ijichi公司等., 1996)和急性播散性脑脊髓炎(Stuve和Zamvil，1999年)包括与革兰氏阴性菌感染有关的后一种疾病肺炎衣原体(海克和斯克里弗，2000年). 然而，我们对此类疾病脱髓鞘机制的理解往往是不完整的。一种或多种疾病的发病机制可能与目前实验性病变的发病机制相同；如果是这样的话，目前的病变可以作为一个有用的模型来探索潜在治疗靶点的机制。我们特别注意到，在当前病变中，MAG在其他髓鞘蛋白之前丢失，并且这种丢失似乎发生在脱髓鞘开始之前。这种MAG的优先丢失也发生在多发性硬化症的一些炎性脱髓鞘病变中，Lucchinetti及其同事将其命名为“III型”(卢奇内蒂等., 2000;阿布·埃宁等2003年). 轴突周围髓鞘脱髓鞘的异常起始可能是这种早期MAG丢失的另一种表现，因为MAG通常在中枢神经系统的轴突周围脊髓鞘中发现(陷阱等., 1989). 多发性硬化症的通常实验模型，即EAE，不能复制这种脱髓鞘模式(卢奇内蒂等2000年). 值得注意的是，在多发性硬化（H.Lassmann，个人交流）和当前的LPS模型中，这种不寻常的脱髓鞘模式与小胶质细胞激活和iNOS的显著表达同时发生。目前的研究结果表明，脂多糖诱导的脱髓鞘可能是一种有用的实验模型，用于显示III型表型的脱髓磷脂损伤。

确定我们所观察到的脱髓鞘是否是通过一种机制发生的，这种机制与最近在早期多发性硬化病变中描述的引起病变的机制相似，这也将是一件有趣的事情巴内特和普林内斯（2004）当然，这两个病变都表现出明显的少突胶质细胞丢失和囊泡性脱髓鞘，这是在没有局部明显淋巴细胞浸润的情况下发生的。此外，在这两种病变中，脱髓鞘似乎都不依赖于吞噬细胞对髓鞘的剥离。

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