辐照肿瘤细胞衍生微粒通过细胞杀伤和免疫重编程介导肿瘤根除

RT-MP通过引起铁下垂杀死肿瘤细胞

为了探讨RT-MP诱导细胞死亡的机制，我们使用了caspase抑制剂（Z-VAD-FMK）、RIPK1抑制剂（坏死抑制素-1）或自噬抑制剂（3-甲基腺嘌呤）；已知这些化合物分别抑制凋亡、坏死和自噬细胞死亡(22). 我们观察到RT-MP诱导的死亡不受这些抑制剂的调节。然后我们测试了铁抑素-1和我-谷胱甘肽（GSH），铁下垂抑制剂，并发现RT-MP诱导的A549细胞死亡被GSH和铁抑制素-1有效挽救(图2A以及图S3、A和B），这在B16-F10细胞中也得到了验证（图S3C）。为了进一步阐明RT-MP导致细胞死亡的潜在机制，对RT-MP处理和未处理的细胞进行了无标签定量蛋白质组学分析。《京都基因与基因组百科全书》（KEGG）分析表明，铁凋亡途径丰富；此外，前列腺素G/H合酶2（ptgs2）和铁蛋白（ftl1）参与了铁下垂(23)，在RT-MP治疗组中表现出明显更高的表达(图2、B和C). 在RT-MP处理的A549和LLC中，TEM图像显示线粒体萎缩(图2D和图S3D），类似于用橡皮素（一种典型的铁凋亡诱导化合物）治疗后观察到的结果(24). 为了进一步证实RT-MP引起的铁下垂，分别用荧光探针2′，7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯（H2DCFDA）和4,4-二氟-5-（4-苯基-1,3-丁二烯基）-4-硼酸-3a，4a-二氮杂-s-吲哚-3-十一酸（BODIPY®581/591 C11）检测细胞溶质和脂质活性氧物种（ROS）。我们观察到从4小时开始呈时间依赖性增加，二者都可以被铁抑素-1部分解救（图S3，E至G）。这种机制也适用于B16-F10细胞（图S3、H和I）。为了进一步探讨RT-MP与正常癌细胞MP相比能够杀伤肿瘤细胞的原因，我们使用流式细胞术发现RT-MP含有ROS，这可能是杀伤增强的原因之一（图S3J）。我们进一步追踪了RT-MP的亚细胞分布，发现RT-MP膜与溶酶体、线粒体之间存在共定位（图S3K）。

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图2

RT-MP通过引起铁下垂诱导肿瘤细胞死亡。

(一)用RT-MPs（100μg/ml，48小时）处理的A549细胞中已知小分子细胞死亡抑制剂的调节谱。(B类)差异富集蛋白质的KEGG气泡图。这个x个axis表示相应通路中差异蛋白的数量与已识别的总蛋白数量的比率。点的颜色表示对超几何检验的值。点的大小表示相应途径中差异蛋白的数量。(C类)RT-MP处理和未处理细胞的铁凋亡途径中差异表达蛋白的热图。(D类)用磷酸盐缓冲盐水（PBS）（24小时）、橡皮素（2μM，24小时）和RT-MP（100μg/ml，24小时。单个橙色箭头表示线粒体萎缩。在每个处理条件下，至少检查了10个细胞。(电子)不同处理后A549细胞表面钙网蛋白（CRT）表达的免疫荧光染色（绿色）。磷灰石-罗丹明（红色）代表细胞骨架。比例尺，100μm。(F类)流式细胞术分析CRT表达。(G公司)用所示化合物处理的LLC细胞中的ATP水平。(H（H）)来自C57BL/6小鼠的BMDM对RT-MP处理的LLC细胞显示出较高的吞噬率。BMDM用F4/80抗体染色，LLC细胞用红色荧光染料PKH26染色。进行流式细胞术分析以评估吞噬作用的速率。(我)RT-MP处理细胞吞噬作用的体内可视化。皮下注射LLC-RFP细胞（2×10⁴)进入窗户。在CX中招募巨噬细胞并吞噬更多RT-MP处理的LLC-RFP细胞_三CR1号机组^+/GFP公司窗室。比例尺，50μm*对<0.05和***对< 0.001.

众所周知，铁下垂具有免疫原性(22,25)其特征是从死亡的肿瘤细胞中释放肿瘤相关抗原和免疫危险信号；因此，我们检测了RT-MP治疗后肿瘤细胞的危险相关分子模式。结果表明，培养基中细胞外钙网蛋白（CRT）表达水平和三磷酸腺苷（ATP）释放水平分别是对照组的1.8倍和2.2倍。共聚焦显微镜也显示，RT-MP治疗后CRT表达增加(图2，E到G，以及图S4、A至D）。流式细胞仪分析显示，巨噬细胞吞噬RT-MP治疗的LLC多于未治疗的LLC-(图2H). 在CX中_三CR1号机组^+/GFP公司小鼠窗室模型，RT-MP处理的LLC-RFP细胞可以招募更多巨噬细胞（绿色）；这些巨噬细胞具有更大的捕获肿瘤细胞的能力(图2I以及电影S3和S4）。总之，这些结果表明RT-MP通过在肿瘤细胞中引起铁下垂来介导RIBE，从而进一步促进巨噬细胞的吞噬作用。

RT-MP促进巨噬细胞极化并激活Jak-STAT和MAPK通路

为了阐明RT-MPs对TME的体内影响，我们首先检测了胸膜内给药后MPE小鼠中PKH26（用于通用细胞膜标记的PKH26红色荧光细胞连接器迷你试剂盒）标记的RT-MPs的细胞内化。收集胸腔积液细胞并用流式细胞仪进行分析；PKH26标记的RT-MP主要被CD11b摄取⁺80层/四层⁺单元格（代表TAM），后跟Gr-1⁺细胞（代表髓源性抑制细胞）和CD45⁻细胞（代表肿瘤细胞），而很少RT-MP被CD3吸收⁺T细胞(图3A和图S5A）。在CX中_三CR1型^+/GFP公司注射RT-MPs后，我们观察到大量巨噬细胞以时间依赖的方式迁移到注射部位，并强烈吞噬红色PKH26标记的RT-MPs(图3B以及电影S5和S6）。基于这些发现，我们进一步探讨了RT-MP对巨噬细胞表型变化的影响，因为它们强烈吞噬RT-MP（电影S7）。对与PKH26标记的RT-MP孵育2、6、12和24小时的巨噬细胞进行流式细胞术分析。结果显示巨噬细胞对RT-MP的摄取具有时间依赖性(图3C和图S5B），这与体外共焦图像（图S5C）一致。为了确定RT-MP处理的巨噬细胞的mRNA变化，使用骨髓源性巨噬细胞（BMDM-M2细胞）进行后续RNA测序（RNA-seq）。RNA-seq结果显示M1相关的mRNAs高度表达(图3D)实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）显示诱导型一氧化氮合酶的mRNA表达水平持续显著增加(iNOS系统)，白介素-1(白介素-1)、IL-6、IL-12、肿瘤坏死因子-α和干扰素-γ(干扰素-γ） RT-MP处理的BMDM-M2细胞(图3E). KEGG分析表明，Janus激酶/信号转导子和转录激活子（Jak-STAT）信号通路和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路（M1相关通路）被富集(图3F). Western blotting分析RT-MP处理BMDM-M2细胞在指定时间点的p-STAT1、p-p38、p-ERK（细胞外信号调节激酶）、p-JNK和β-actin蛋白表达水平。如所示图3G磷酸化MAPK、ERK1/2、c-Jun N末端激酶（JNK）、p38和STAT1通路的成员(26). RT-MP吞噬后，巨噬细胞表现出M1极化，CD86表达增加三倍，主要组织相容性复合体II表达增加5.2倍，CD206表达减少46.5%。此外，iNOS蛋白表达水平的显著增加也支持了这一点（图S5D）。GSH孵化无法挽救这种变化(图3H)，表明ROS对巨噬细胞极化没有贡献。在MPE小鼠中，注射RT-MPs可将巨噬细胞中CD206的表达降低86.8%(图3、I和J). 正如预期的那样，RT-MP处理的巨噬细胞显示出更强的吞噬肿瘤细胞的能力，比未处理的巨噬细胞大1.5倍(图3K). 此外，在CX中可以看到这种效果_三CR1号机组^+/GFP公司背皮褶窗室模型(图3L以及电影S3和S8）。总之，这些结果表明，RT-MP可以通过激活Jak-STAT和MAPK通路，将巨噬细胞从促瘤表型修改为抑瘤表型。

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图3

RT-MP通过Jak-STAT和MAPK途径对巨噬细胞进行重新编程。

(一)量化MPE小鼠不同细胞类型中PKH26标记RT-MP的积累（平均值±SEM，n个＝5只小鼠）。(B类)CX中随时间征募和吞噬红色RT-MP的巨噬细胞（绿色）的代表性图像_三CR1号机组^+/GFP公司窗室。RT-MP用红色荧光染料PKH26染色并皮下注射到窗口。比例尺，50μm。(C类)巨噬细胞在多个时间点内化RT-MP的流式细胞术分析(n个= 3). (D类)RT-MP处理和未处理BMDM-M2细胞的RNA-seq热图。(电子)RT-qPCR分析RT-MP处理的BMDM-M2细胞中M1和M2相关mRNA的表达水平。结果表明M1相关mRNA上调，M2相关mRNAs下调。(F类)KEGG分析确定RT-MP治疗组和未治疗组的前20条上调功能途径。(G公司)通过Western blotting分析在指定时间点用RT-MP处理的BMDM-M2细胞中p-STAT1、p-p38、p-ERK、p-JNK和β-actin的蛋白表达水平。(H（H）)流式细胞术分析经RT-MP和GSH孵育RT-MP处理的BMDM-M2细胞中CD86、主要组织相容性复合体II（MHC II）和CD206的表达。MFI，平均荧光强度。(我)MPE小鼠巨噬细胞测量的流式细胞术门控策略。(J型)定量RT-MPs治疗后MPE小鼠CD206的表达。(K（K）)与对照BMDM-M2细胞相比，RT-MP处理的BMDM-M1细胞显示LLC细胞的吞噬作用增强。流式细胞仪分析评估吞噬率。异硫氰酸荧光素；PE，藻红蛋白(L（左）)在CX中_三CR1号机组^{+/绿色荧光粉}小鼠窗口室，RT-MP处理的巨噬细胞被招募并吞噬大量LLC-RFP细胞。此处显示了具有代表性的图像。比例尺，50μm**对<0.01和***对< 0.001.

RT-MPs与抗PD-1联合治疗可产生抗肿瘤作用并产生记忆免疫反应

如上所述，RT-MP在肿瘤细胞中诱导铁下垂，导致免疫原性细胞死亡和巨噬细胞活化；RT-MP还导致巨噬细胞表面PD-L1表达增加3.2倍(图4A)这促使我们进行了一项后续实验，以研究抗PD-1单克隆抗体（mAb）的联合治疗。MPE治疗的联合治疗显著延长了生存时间，治愈了15只小鼠中的1只，没有复发（图S6、a和B）；这些效果优于单独使用抗PD-1或RT-MP治疗的效果(图4、B和C). 通过将RT-MP注射次数增加到6次，治愈率达到38.5%(图4D和图S6C）。我们还利用稳定转染荧光素酶的B16-F10细胞建立了皮下移植模型。RT-MPs和抗PD-1联合治疗可明显延缓肿瘤生长并延长生存期(图4、E和F，以及图S6D）。

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图4

用RT-MPs和抗PD-1联合治疗MPE小鼠，并产生强烈的记忆反应。

(一)流式细胞术分析RT-MP处理的BMDM表面PD-L1的表达。(B类)不同治疗条件下小鼠MPE生长的典型体内生物发光图像。(C类)（B）所述相应治疗组MPE小鼠的Kaplan-Meier生存图(n个=每组13至15人）。(D类)不同频率RT-MPs注射的疗效比较(n个=每组13至15人）。(电子)相应治疗组B16-F10-LUC皮下移植模型肿瘤生长曲线(n个=每组8至9人）。(F类)B16-F10-LUC黑色素瘤小鼠在（E）中描述的相应治疗组的Kaplan-Meier生存图(n个=每组8至9人）。(G公司到J型)流式细胞术分析不同处理MPE小鼠胸腔灌洗液中免疫细胞的变化(n个=每组8至11人）。(K（K）)LLC-LUC MPE荷C57BL/6小鼠的Kaplan-Meier生存图(n个=9至10个/组）。(L（左）)RT-MPs联合抗-PD-1治疗的LLC-LUC MPE-承载C57BL/6小鼠的Kaplan-Meier生存图，同时进行抗CD4或抗CD8中和抗体治疗(n个=每组12至13）。(M（M）)效应记忆T细胞（T_{相对长度单位}和CD44^高的CD62型^低的干扰素-γ⁺)通过流式细胞术分析淋巴结和脾脏（CD3门控⁺CD8（CD8）⁺T细胞）第60天(n个=每组5至6个）。(N个)体内生物发光图像监测再次注入胸腔的LLC-LUC肿瘤的生长(n个=每组5至6人）*对< 0.05, **对<0.01，以及***对< 0.001.

为了阐明体内注射RT-MP后免疫微环境的变化，从MPE小鼠胸膜灌洗液中检测免疫细胞。我们观察到CD3同时增加⁺CD4细胞⁺干扰素-γ⁺和CD3⁺CD8（CD8）⁺干扰素-γ⁺联合组中的T细胞(图4、G和H). CD4的变化⁺/CD8（CD8）⁺T细胞比率和Foxp3的频率⁺T调节细胞(图4I和图S6E）在治疗组之间没有统计学差异。髓源性抑制细胞（MDSCs）（CD45⁺CD11b型⁺等级-1⁺)RT-MP治疗组和联合治疗组显著下降(图4J). 联合治疗也导致CD3的比例增加⁺胸膜肿瘤结节中的T细胞（图S6F）。总的来说，这些发现增加了T细胞群（包括CD3⁺CD4细胞⁺干扰素-γ⁺和CD3⁺CD8（CD8）⁺干扰素-γ⁺T细胞）和MPE中MDSC的减少强烈提示了与RT-MP和抗PD-1联合治疗后TME的重塑。

我们进一步探讨了巨噬细胞、自然杀伤（NK）细胞、CD4的作用⁺T细胞和CD8⁺T细胞与RT-MPs和抗PD-1联合治疗的抗肿瘤活性；这是通过有效消耗巨噬细胞、NK细胞、CD4来实现的⁺T细胞和CD8⁺分别通过氯膦酸盐脂质体、NK1.1抗体、抗CD4抗体和抗CD8抗体获得T细胞（图S6、G至I）。我们观察到巨噬细胞耗竭显著减弱了RT-MPs和抗PD-1联合治疗对MPE的抑制作用(对= 0.0427;图4K). 在接受CD8治疗的小鼠中，抑制作用大部分消失⁺接受CD4治疗的小鼠的T细胞耗竭和部分丢失⁺T细胞耗竭(图4L)表明RT-MPs和抗PD-1联合治疗的抗癌效果在很大程度上依赖于CD8⁺T细胞和部分依赖CD4⁺T细胞。然而，NK细胞耗竭对RT-MPs和抗PD-1联合治疗的治疗效果没有显著影响（图S6J）。总之，这些发现表明，RT-MP和抗PD-1联合治疗可启动巨噬细胞CD4⁺T细胞–和CD8⁺增强抗肿瘤免疫的T细胞依赖性途径。

由于RT-MP和抗PD-1联合治疗可触发先天性和适应性免疫反应，因此我们评估治愈小鼠是否形成记忆反应。在本实验中，对六只治愈的小鼠（完全治愈至少30天，由体内生物发光图像证实）进行了记忆T细胞存在的评估。CD3（CD3）⁺CD8（CD8）⁺CD44细胞^高的CD62L型^低的干扰素-γ⁺细胞被视为T效应记忆（T_{相对长度单位})单元格(27,28); T的数量_{相对长度单位}在治愈的小鼠中，脾脏和淋巴结分别增加了1.5倍和4.6倍(图4M). 另外五只治愈的小鼠被重新注入LLC-LUC细胞，同样年龄的幼稚小鼠被并行激发。在联合治疗治愈组中没有肿瘤生长，表明对肿瘤抗原识别有记忆反应。相反，体内成像显示，所有幼年小鼠都出现了MPE(图4N). 总之，这些结果表明，RT-MPs和抗PD-1联合治疗有利于消除原发性MPE后产生记忆免疫反应。

细胞系和细胞培养

所有细胞系均购自美国组织培养库，包括人类肺癌细胞系（A549、Calu-1和H1975）、人类结肠腺癌细胞系（HCT116）、人类原代胶质母细胞瘤细胞系（U87）、小鼠B16F10黑色素瘤细胞和小鼠LLC。对于体内研究，建立了荧光素酶稳定转染细胞系（LLC-LUC和B16F10-LUC）和RFP稳定转染的细胞系（LL C-RFP和A549-RFP）。通过与顺铂（2μg/ml）长期（至少2个月）培养产生顺铂耐药细胞（LLC-DDR、LLC-LUC-DDR和A549-DDR）。所有细胞在37°C和5%CO的培养箱中培养₂使用完全培养基[补充10%胎牛血清（FBS）、青霉素（100 U/ml）和链霉素（100 U/ml）]。LLC、LLC-LUC、HCT116和U87细胞保存在Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）中；其他细胞保存在RPMI 1640培养基中。所有细胞系都进行了支原体感染的常规检测，结果均为阴性。

RT-MP和RT外泌体的分离

总计5×10⁶将细胞置于10-cm细胞培养皿中，用6-MV x射线（600MU/min，Trilogy System Linear Accelerator，Varian Medical Systems）单次照射20Gy。然后用20 ml完整培养基（DMEM或RPMI 1640，根据每个细胞系的需要）替换培养基。72小时后，收集培养基并在1000克10分钟，然后14000克2分钟，去除肿瘤细胞和碎片。然后，将上清液在14000下离心克在4°C下隔离RT-MP 1小时，并在120000下进一步离心70分钟克在4°C下分离RT外泌体。用无菌1×PBS洗涤沉淀（含有外泌体或MPs）两次，然后再悬浮在无菌1×PBS中进行动物实验，或再悬浮在完整的培养基中进行细胞实验。

RT-MP的量化

我们通过测量蛋白质浓度来量化RT-MP。清洗后，用放射免疫沉淀分析（RIPA）缓冲液在4℃下对RT-MP进行30分钟的裂解，然后在12000℃下离心30分钟克4°C时；将含有总蛋白的上清液换到新的离心管中。根据制造商的方案，用BCA蛋白质测定试剂盒（赛默飞世尔科学公司）对蛋白质进行定量。

透射电子显微镜

透射电镜观察RT-MP和RT-MP（100μg/ml）或橡皮素（2μM）处理的细胞。悬浮液中的RT-MP用2%磷钨酸溶液染色5分钟，然后沉积在铜网上；通过TEM观察其大小和形态。细胞在0.1 M PBS中清洗，然后用2.5%戊二醛在0.1 M Sorenson的缓冲液中在4°C下过夜；然后用1%四氧化锇在PBS中固定细胞1.5小时。通过分级乙醇系列脱水后，将细胞嵌入Lx-112（Ladd Research Industries）和Embed-812（EMS）中，然后在MT-7000超微切片机上切割。用1%醋酸铀酰和0.4%柠檬酸铅对超薄切片进行染色，然后用TEM（HT7700-SS/FEI-Tecnai G20 TWIN）观察其形态。

细胞活力研究

为了测量细胞活力，细胞被镀在96个板中（每个孔5000个细胞），并在治疗前生长24小时。然后用不同浓度的RT-MP或其他化学试剂处理细胞。培养48小时后，使用CCK-8检测试剂盒（BS350B，Biosharp）评估细胞活力。

集落形成分析

将细胞接种到48孔板（每孔10000个细胞）或6孔板（每个孔500个细胞）中。为了测试RT-MP抑制肿瘤细胞的能力，用不同剂量的RT-MP处理48周板中的细胞，然后用完全培养基培养3天。为了直接观察RIBE，将细胞接种到具有不同孔径（0.4和1μm）的Transwell室（每个室200000个细胞）和六孔板（每个孔500个细胞）中。24小时后，用6 MV x射线单剂量20 Gy照射Transwell室中的细胞，然后与6孔板中的细胞共培养5天。随后，移动培养箱，用3 ml完整培养基替换培养板10天。当菌落有50多个细胞时，用4%甲醛固定细胞30分钟，用2%结晶紫（编号HT90132，Sigma-Aldrich）染色过夜，然后用水冲洗。对染色的细胞拍照，并计算克隆的数量。

活性氧生成分析

将细胞置于12孔培养皿中（每孔50000个细胞），然后用RT-MP和其他化学试剂处理4、12和24小时。随后，在37°C的细胞培养箱中，用H2DCFDA（10μM）或C11-BODIPY（581/591）（2μM）在1ml不含FBS的培养基中染色30分钟。在PBS中清洗三次后，收集细胞并将其重新悬浮在150μl新鲜PBS中，然后使用流式细胞仪（Beckman CytoFLEX S）进行分析。每个治疗条件包括至少10000个用于分析的细胞。

BMDM的生成

从6至12周龄C57BL/6雄性小鼠的股骨中收集BMDM。使用RBC裂解缓冲液耗尽RBC，然后在补充有10%FBS和巨噬细胞集落刺激因子（20ng/ml；PeproTech）的RPMI 1640培养基中分化。每2天更换一次培养基。第六天，用IL-4（20 ng/ml；PeproTech）刺激原始巨噬细胞（BMDM）24小时，以生成BMDM-M2巨噬细胞。第7天采集BMDM-M2细胞进行刺激试验。

蛋白质印迹

RT-MP和细胞用添加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂鸡尾酒II和III的RIPA缓冲液在4°C下溶解30分钟，然后在12000下离心30分钟克4°C时；将含有总蛋白的上清液换到新的离心管中。使用BCA蛋白质分析试剂盒（Thermo Scientific）对蛋白质进行定量。样品混合在1×SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳样品加载缓冲液（P0015，Beyotime Biotechnology）中，并通过加热至100°C变性10分钟；然后在SDS-聚丙烯酰胺凝胶中分离它们，并转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。用5%脱脂奶粉在室温下用0.05%吐温20（TBST）的三缓冲盐水溶解1小时，轻轻摇晃，封闭PVDF膜，然后用一抗在4°C孵育过夜。接下来，在室温下用TBST洗涤膜三次，每次15分钟，然后在室温下用稀释的TBST中的第二抗体孵育1小时({“类型”：“entrez-protein”，“属性”：{“文本”：“P10100”，“term_id”：“133097”，“term_text”：“P10100”}}第10100页，NCM Biotech）用于印迹的化学发光暴露。使用的抗体列于表S2中。

实时定量聚合酶链反应

使用Total RNA Kit I R6834（Omega）从细胞中分离出总RNA，并使用NanoDrop ND-1000（Thermo Fisher Scientific）测量RNA。按照制造商的说明，通过HiScript III RT SuperMix（+gDNA擦拭器）（Vazyme，#R323）将纯化的RNA反向转录成互补DNA。RT-qPCR反应在第一步系统中使用AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix（Vazyme）进行。使用比较阈值循环法计算基因表达，然后将其归一化为参考基因3-磷酸甘油醛脱氢酶。所用引物由Sangon Biotech（上海）有限公司合成。；这些在表S1中列出。

体外细胞摄取试验

为了检测细胞和RT-MP的共定位，将M2-BMDM接种在玻璃底细胞培养皿（NEST，目录号801001；1×10⁵并与PKH-26标记的RT-MP孵育2、6、12和24小时。最后，用PBS冲洗细胞三次，然后用羧基荧光素二乙酸丁二酰酯（10μM）染色10分钟。然后，用PBS冲洗细胞，用4%多聚甲醛固定30分钟，然后再次用PBS清洗。使用共聚焦激光扫描显微镜（Leica TSC SP8）对细胞进行成像。为了定量评估细胞摄取，将细胞接种在六孔细胞培养皿中并如上处理，然后用PBS洗涤三次，收集、固定并再次悬浮在PBS（150μl）中进行流式细胞术检测。

体外ATP释放试验

为了测量细胞外ATP水平，收集细胞培养上清液，并根据制造商的方案，使用基于荧光素的ENLITEN ATP检测（Promega）试剂盒测量ATP浓度。

CRT分析

细胞接种在24孔细胞培养皿中，培养皿中装有13mm圆形玻璃盖玻片，并与RT-MP孵育24小时。将细胞固定在甲醛（4%在PBS中）中，并用0.1%Triton X-100在PBS中透化。随后，将细胞与抗CRT抗体孵育30分钟，然后与Alexa Fluor 488山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）孵育30分钟。然后，用DY-554鬼笔肽标记盖玻片上的细胞，用PBS洗涤，DAPI（4′，6-二氨基-2-苯基吲哚）染色。用激光共聚焦显微镜（Leica TCS SP8）观察染色细胞。为了进行流式细胞仪分析，将细胞固定在甲醛中（PBS中为4%），并与抗CRT抗体孵育30分钟，然后与荧光素结合的AffiniPure山羊抗兔IgG孵育30min。

无标签定量蛋白质组学

无标记定量蛋白质组学分析由新基因生物信息技术有限公司（中国北京）进行。采用无标签定量蛋白质组学分析鉴定RT-MP处理的LLC和对照细胞之间差异表达的蛋白质。分析主要包括原始数据过滤和质量控制；蛋白质功能注释，包括基因本体（GO）、同源群聚类（Clusters of Orthologous Group）、KEGG和InterPro（IPR）；蛋白质表达定量；差异表达分析；GO富集；KEGG富集；知识产权富集；以及蛋白质相互作用。

RNA测序

从经或不经RT-MP处理的BMDM中提取总RNA。RNA-seq由CapitalBio Technology Inc.（中国北京）进行。基础分析主要包括原始数据过滤和质量控制、参考基因组比较、比对同质性分析、饱和度分析、样本相关性分析、表达分析和差异基因分析。高级分析主要包括新转录物预测、剪接连接分析、cSNP/InDel（单核苷酸多态性/插入/删除）分析、差异表达基因功能注释、GO和通路/疾病富集、差异基因共表达网络分析和差异基因-蛋白质相互作用分析。

动物研究

雄性C57BL/6 J野生型（WT）小鼠购自辽宁长生生物科技有限公司。所有动物均保存在华中科技大学（华中科技学院；中国武汉）动物中心的特定无病原体屏障设施中。所有动物研究均按照湖北省动物保护和使用委员会根据华中科技大学动物实验伦理委员会（中国武汉）的实验指南批准的方案进行。

模型动物实验及疗效评价

用于实验的小鼠年龄（6周）、体重（18至20克）和性别匹配。为了建立MPE模型，在所有手术之前，用1%戊巴比妥钠麻醉小鼠。LLC-LUC细胞（20万细胞悬浮在50μl PBS中）通过腋中线的第10或第11肋间间隙注入右侧胸膜腔。接种LLC-LUC细胞四天后，通过生物发光成像观察每只小鼠，以确保成功且均匀地建立MPE模型；然后将小鼠随机分为四组，包括对照组、RT-MPs、PD-1单克隆抗体、RT-MP和抗PD-1，并给予治疗。在异氟烷麻醉下，用50μl液体（PBS或RT-MPs混悬液）对小鼠进行胸腔内注射，每隔2天注射4次，或用PD-1单克隆抗体（10 mg/kg）腹腔内注射，每2天注射3次。为了评估MPE的生长，在完成所有治疗的当天，每组五只小鼠进行成像，然后每隔三天在1%戊巴比妥钠麻醉下使用Bruker in-Vivo MS FX PRO成像仪进行五次成像。观察其余小鼠直至死亡。建立皮下移植B16-F10-LUC肿瘤模型，5×10⁵在每只小鼠的右侧皮下注射100μl PBS中的B16-F10-LUC细胞。然后观察这些动物直到它们恢复知觉。接种B16-F10-LUC七天后，将小鼠随机分为上述四组。当肿瘤体积达到约50mm时^三，只小鼠接受治疗。对小鼠进行肿瘤内注射50μl液体（PBS或RT-MPs混悬液），每隔2天注射四次，或腹腔注射PD-1单克隆抗体（10 mg/kg），每隔两天注射三次。为了评估治疗的疗效，记录皮下肿瘤生长的长度(L（左）)和宽度(W公司)游标卡尺测量肿瘤大小(V（V）)每隔2天用以下公式进行评估V（V）= (L（左）×W公司²) / 2. 当肿瘤体积达到1000mm时处死小鼠^三.

生物发光成像

用1%戊巴比妥钠麻醉MPE小鼠后，腹腔注射萤火虫荧光素（150 mg/kg；Sigma-Aldrich；CAS:103404-75-7）。15分钟后，用Bruker体内MS FX PRO成像仪对小鼠进行成像。用3分钟曝光时间拍摄发光图像，用30秒曝光时间拍摄x射线照片。

正电子发射断层摄影术-计算机断层摄影术

在正电子发射断层成像（PET）成像之前，小鼠禁食12小时，然后通过静脉注射大约200±10μCi的18-氟-6-脱氧葡萄糖（FDG）。摄取FDG 60分钟后，用2%异氟醚麻醉小鼠，并将其置于扫描床上。使用TransPET Discoverist 180系统（Raycan Technology Co Ltd.，中国苏州）在静态模式下获得10分钟的PET/计算机断层扫描（CT）图像，然后进行正常模式的CT扫描。PET图像采用三维有序子集期望最大化方法重建，体素大小为0.5 mm×0.5 mm×0.5mm。CT图像采用Feldkamp算法重建，矩阵为256×256×256。图像通过Carimas软件显示（Turku PET Center，Turku，Finland）。

体内细胞内化

为了验证RT-MPs的体内摄取，MPE小鼠接受了50μl PKH26标记的RT-MPs的胸膜内注射。四小时后，小鼠被过量麻醉剂处死。收集MPE小鼠胸膜灌洗液，用裂解缓冲液去除红细胞，制备单细胞悬液。根据制造商的说明，用僵尸紫活性试剂盒（BioLegend）对细胞进行染色。使用抗体，包括抗CD45（克隆30-F11）、抗CD11b（克隆M1/70）、抗F4/80（克隆BM8）和抗LY6G（克隆1A8），以及PKH26标签[PE（藻红蛋白）通道，Sigma-Aldrich]，对单细胞悬液进行流式细胞术免疫分型。细胞采集在流式细胞仪（Beckman CytolFLEX S）上进行。只有活细胞被选通进行分析。

背皮褶窗室模型

钛腔经手术植入WT C56BL/6小鼠或CX小鼠背部皮肤下_三CR1号机组^+/GFP公司老鼠。一天后，用红色荧光PKH26对照射过的LLC-RFP细胞、对照LLC-RFP-细胞或RT-MP进行染色，然后皮下注射到窗口。在指定的时间点，视频由双飞秒激光多光子显微镜（LSM780，蔡司）采集。CX公司_三CR1号机组^+/GFP公司小鼠由华中科技大学光学生物成像中心提供。所有上述实验也在实验室进行。

MPE小鼠的免疫监测

为了分析TME中免疫细胞的变化，在抗凝条件下收集MPE小鼠的胸腔灌洗液。样品在500℃下离心克5分钟后，红细胞溶解，用PBS洗涤两次，然后在PBS中再悬浮。对于流式细胞术，根据制造商的说明，用僵尸紫活性试剂盒（BioLegend）对单细胞悬浮液进行染色，以排除死细胞。表面抗原在4°C下用抗体染色30分钟；所有抗体（如下所列）都是针对小鼠抗原的，并且购自BioLegend。为了分析TAM，用以下表面抗体对肿瘤组织的细胞悬液进行染色：抗CD45（克隆30-F11）、抗CD11b（克隆M1/70）、抗F4/80（克隆BM8）和抗CD86（克隆GL-1）。在固定和渗透后，用抗CD206（克隆C068C2）抗体对细胞进行染色。为了分析T细胞，用离子霉素（1 mg/ml；Abcam）和佛波醇12-肉豆蔻酸13-醋酸盐（50 ng/ml；Abcam₂随后，用抗CD3ε（克隆145-2C11）、抗CD4（克隆GK1.5）和抗CD8a（克隆53-6.7）抗体对单细胞悬液进行染色。然后固定细胞并用抗IFN-γ（克隆XMG1.2）和抗Foxp3（克隆MF-14）抗体染色。为了分析MDSC，用以下表面抗体对肿瘤组织制成的细胞悬液进行染色：抗CD45（克隆30-F11）、抗CD11b（克隆M1/70）和抗Gr-1（克隆RB6-8C5）。为了分析记忆效应T细胞，用以下表面抗体对脾和淋巴结制成的细胞悬液进行染色：抗CD3ε（克隆145-2C11）、抗CD8a（克隆53-6.7）、抗CD44（克隆IM7）和抗CD62L（克隆MEL-14）。然后固定细胞并用抗IFN-γ（克隆XMG1.2）抗体染色。

T细胞耗竭

对于T细胞耗竭研究，从治疗前一天开始，每只小鼠200μg的小鼠抗CD4（克隆GK1.5）和小鼠抗CD8（克隆2.43）抗体在PBS中稀释并每4天腹腔注射一次。

巨噬细胞耗竭

对于巨噬细胞耗竭研究，从FormuMax购买氯膦酸盐脂质体（F70101C-AC）。从治疗前一天开始，每4天腹腔注射一次氯膦酸盐脂质体（每个200μl）。

NK细胞耗竭

在NK细胞耗竭研究中，从治疗前一天开始，每只小鼠200μg小鼠抗NK1.1（克隆108760）在PBS中稀释并每4天腹腔注射一次。

我们感谢Y.Wang（中国武汉协和医院肿瘤中心）为我们提供专业的放射技术，感谢J.Zhu和D.Li（中国武汉联合医院）提供体内生物发光成像，感谢Q.Yuan（中国广州南方医科大学南方医院）提供生化分析，感谢F。来自中国科学院水生生物研究所分析测试中心的周教授为共焦成像提供技术支持。基金：本研究得到了国家自然科学基金（批准号：81874233、81874222、81672978和31770983）和国家重点研发计划（项目号：2016YFC0105300）的支持。作者贡献：K.Y.和H.J.设计了这项研究。C.W.、Y.S.和Y.T.进行了实验并分析了数据。L.L.协助进行了背窗室模型的实验。X.D.、J.M.、J.H.和Q.H.协助小鼠实验和流式细胞术。B.W.、Z.Z.、K.J.、D.H.、G.W.和J.F.L.提供资源或进行实验。Y.S.、C.W.、H.J.和Y.T.撰写了手稿。所有作者都批准了手稿的最终版本。竞争利益：K.Y.、H.J.、Y.S.、C.W.和Y.T.是华中科技大学同济医学院联合医院提交的与本作品相关的专利（编号20191003113422019年1月14日）的发明人。其他作者声明他们没有相互竞争的利益。数据和材料可用性：评估论文结论所需的所有数据均在论文和/或补充材料中提供。可能需要作者提供与本文相关的其他数据。