通过细胞纳米孔化大规模生产功能性mRNA-encapsulated exosomes

细胞外囊泡mRNA负载。

为了更好地了解转录mRNA在不同EV亚群中的分布，我们通过标准的多步超速离心法从微泡（MV）中分离出外泌体(图s1j-k个).^9,19用Western blot分别检测外显子和MV中的外显子标记（CD9、CD63和Tsg101）和MV标记（Arf6）(图2a).^20–22我们发现，10⁸CNP转染的MEF位于外泌体内而非MV内(图2b)外显体大RNA/蛋白质的平均重量比为1μg/20μg。这与未经CNP处理的相同数量外显体MEF中无法检测到的大RNA形成对比。Optiprep™梯度超速离心法纯化外泌体证实，大多数RNA集中在与外泌物部分相对应的5-7组分中(图S1l). 然而，该方法的回收率远低于多级超速离心法(图S1m). CryoTEM显示，CNP处理的带有质粒DNA的MEF产生的外显子含有许多核酸，而未处理的MEF中的外显体看起来是空的(图2c). 在作为独立细胞来源的骨髓源性树突状细胞（BMDC）中也获得了类似的结果(图S1n). 最后，qRT-PCR显示，大多数转录的mRNA被包裹在外泌体中，而不是MV中(图2d)这些mRNA保持了编码蛋白质合成多肽的能力(图2e).

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图2|

CNP转染后，外泌体而不是微泡（MV）含有功能转录的mRNA。

一Western blot检测等量（20μg蛋白）的外显体和MV外显体标记物（CD9、CD63和Tsg101）和MV标记物（Arf6）。b条外泌体中包裹的RNA数量与10⁸通过Nanodrop测量，CNP转染MEF，表明大多数RNA包含在外泌体中，而不是MV中。c（c）PBS组（PBS）和CNP组（CNP）的外泌体的冷冻TEM图像显示，这两组外泌物的外观没有差异，但CNP组的外泌物含有较高的RNA含量。d日对外显体和MV中A、B和M mRNA的qPCR分析表明，大多数转录的mRNA都包含在外显体中。e（电子）.体外从CNP转染MEF分泌的外显体和MV中提取的mRNA的蛋白质翻译。（f）CNP组和S-CNP组TLN分析的典型TIRF图像显示，S-CNP可以优化不同mRNA加载到单个外显体中。绿点：Ascl1公司mRNA，红点：溴化氮mRNA，紫色圆点：我的1lmRNA，粉红色箭头：带1 mRNA的外泌体，绿松石色箭头：带2 mRNA的内泌体；黄色箭头：带3 mRNA的外泌体。克CNP和S-CNP组中具有不同RNA的外泌体的百分比。每组选择100张图像进行统计分析。所有其他数据均来自三个独立的实验，以平均值±标准误差表示，进行了双侧Student t检验进行比较(b、 d日).

为了进一步量化单个外泌体中mRNA负载的潜在变异性，我们使用了栓系脂蛋白纳米粒（TLN）分析(图S2a)其中，将含有特定分子信标（MB）的阳离子脂蛋白纳米粒子系在玻璃盖玻片上，利用静电相互作用，纳米粒子分别捕获带负电的外泌体。^23,24外显体内的mRNA与纳米粒子内的MB杂交产生荧光信号，通过全内折射荧光显微镜（TIRF）捕获荧光信号以量化mRNA含量。我们发现，用3种不同的DNA质粒（A、B和M）进行CNP转染后，约50%捕获的外显体仅包含一个转录物，25%包含两个mRNA，25%包含所有三个mRNA序列(图2f–克). 我们使用顺序CNP（S-CNP）技术增加了这种多路加载(图2f–克)，根据峰值时间分别输送不同的质粒(图1i). 我们发现S-CNP大大增加了单个外泌体的多重mRNA载量50%以上。

治疗性外泌体的CNP和BEP的比较。

CNP和现有BEP技术的主要区别在于，CNP将内源性转录的RNA封装到外显体中，而BEP将外源核苷酸传递到预先分离的外显体。为了比较这两种方法的效率，我们首先使用CNP将miR-128和CD63-GFP质粒传递到MEF中，以生成GFP标记的包含miR-128的外显体，然后将游离miR-128与预先分离的空外显体混合用于BEP插入。我们使用microRNA作为核酸载体，因为BEP可以有效地将小核酸序列插入外显体。为了比较CNP和BEP制备的外泌体中miR-128的数量，我们设计了一个包含Cy5-miR128分子信标的栓系脂蛋白纳米粒（TLN）生物芯片，以捕获带负电的外泌物体，从而使两个囊泡融合。随后miR-128分子和Cy5-miR128分子信标的杂交导致红色荧光的发射，可以通过TIRF显微镜捕获(图S2b). 虽然CNP和BEP都产生了约80%含有miR-128的外泌体，但CNP外泌体内miR-128浓度远高于BEP(图S2c-e（电子）). 此外，与BEP不同，CNP能够有效地产生含有大mRNA的外显子(图S3a–c（c）)，因为CNP分泌的外泌体所含Brn2 mRNA是BEP插入产生的外泌体的100倍以上(图S3d).

CNP诱导外体分泌的机制。

为了研究CNP触发外显子释放的细胞机制，我们首先检查了CNP暴露后细胞内的结构变化。我们发现，CNP显著增加MEF内多泡体（MVB）的形成(图3a). 当CD63-GFP质粒通过CNP传递到MEF时，在诱导后4小时内形成大量GFP阳性MVB(图3b和数据视频1a–c（c）). 透射电子显微镜（TEM）进一步显示，CNP治疗后MEF中MVB增加了约2倍，而ILV增加了约8倍(图3c–e（电子）). 我们还注意到参与外体生物发生的蛋白质表达相应增加(图3f). 由于CNP依赖于在源细胞的质膜上传递焦点电场，因此接触点可能会发生损坏。我们发现，面对基底表面的质膜中最初形成了大量孔隙，随后细胞顶部表面的荧光逐渐增加（慢于接受BEP处理的细胞），这表明CNP导致小孔的形成超出了纳米通道的接触点(图4a,数据视频2a–c（c）). 有趣的是，细胞膜纳米孔在电穿孔后2分钟内闭合，可能表明修复膜损伤的过程(图4b–c（c）). 因为据报道，较高的细胞内钙离子水平可以促进胞外体的释放^25,26接下来，我们研究了CNP后钙离子通过这些纳米孔的内流是否导致了较高水平的外泌体分泌。事实上，当我们增加Ca时，我们发现CNP后外显子释放增加²⁺细胞外间隙中，细胞内Ca相应增加²⁺(图4d–（f）). 添加钙螯合剂EGTA，在很大程度上阻止了细胞内钙离子的增加，并抑制了CNP引起的胞外体释放(图4g–小时)表明细胞内钙的增加²⁺可能是CNP诱导外体分泌的起始因子(图4i).

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图3|

CNP诱导多泡体（MVB）形成。

一外荧光图像显示，在CNP/PBS刺激下，MEF中细胞内小泡形成增加，如PKH26染料的红色荧光点所测。b条与BEP相比，CNP/PBS-porated MEF（CNP）增加了含有CD63-GFP的多泡体（MVB）的数量。插图：3D强度剖面图，其中峰值代表图像中的亮点，指示活动MVB形成。c（c）有或无CNP/PBS刺激的MEF的透射电子显微镜（TEM）图像包含不同数量的MVB和间质小泡（ILV）。MVB的量化(d日)和ILV(e（电子）)在有或无CNP/PBS刺激的MEF中。每组20张TEM图像，进行双侧Student t检验进行比较。（f）蛋白质印迹显示，在CNP之后，与外来体生物发生有关的蛋白质增加。

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图4|

CNP诱导的胞外体分泌与钙²⁺CNP后的离子流入

一用PBS缓冲液测量BEP-和CNP-孔MEF中碘化丙啶（PI）在膜孔中扩散的纵向荧光强度。细胞附着表面（顶部插入物）PI强度的快速增加表明形成了一系列大孔，而对侧细胞表面（底部插入物）的PI增加较慢，表明形成了较小的孔。BEP-porated MEF显示PI强度中度增加。b条CNP后细胞的荧光图像表明，在转染后1至2分钟，在CNP期间形成的膜孔闭合。PI在CNP后的指定时间点应用于单元格。c（c）.细胞荧光强度测量进一步证实CNP后2分钟内膜孔闭合。n=每组20个细胞。d日CNP后不同钙离子浓度下MEF产生的每个细胞外显子数。e（电子）.缓冲液中不同钙离子浓度下CNP后的细胞内钙离子浓度。（f）CNP后胞外体释放与细胞内钙离子浓度的相关性。克在存在钙螯合剂EGTA的情况下，在CNP之后，在不同钙离子浓度下由MEF产生的每个细胞的外泌体数。小时在含有EGTA的缓冲液中，在不同钙离子浓度下，CNP后细胞内的钙离子浓度。我在有EGTA存在的情况下，CNP后胞外体释放与细胞内钙离子浓度的相关性。所有其他数据均来自三个独立的实验，以平均值±标准误差表示，进行了双侧Student t检验进行比较(d、 e、g、h).

接下来，我们评估了源细胞内的应激反应是否有助于CNP处理后外体形成的增加。热休克通过增加热休克蛋白（HSPs）的产生，已被证明可以刺激胞外体的生物发生。数值模拟表明，在CNP转染过程中，纳米通道出口附近的温度在接近60°C时会发生瞬态（<1s）升高(图5a,图S4a–b条). 这种温升集中在纳米通道出口周围的电池表面(图5b–d日,数据视频3). 正如预期的那样，CNP显著增加了细胞中HSPs的表达，并且添加HSP抑制剂显著抑制了胞外体的分泌(图5e–（f）)这表明热休克反应对CNP介导的胞外体生成至关重要。由于热休克蛋白可以调节P53活性，²⁷它反过来通过TSAP6调节外显子的产生，^27–30接下来，我们评估了通过CNP升高HSPs是否通过P53-TSAP6信号通路促进胞外体的产生。因此，我们发现在CNP后P53和TSAP6表达水平上调(图5g)，并且TSAP6表达式在第53页稳定敲除MEF细胞系（MEF第53页^−/−) (图5g). 此外，我们没有注意到在第53页^−/−CNP后MEF细胞(图5h). 值得注意的是，尽管P53上调，但CNP并没有导致显著的细胞死亡(图S4c)并且没有诱导源细胞凋亡(图S4d-e（电子）). 这些结果表明，在CNP诱导的局灶性热应激环境中，热休克反应促进P53-TSAP6信号传导的激活，导致外泌体产生增加，这是细胞恢复过程的一部分(图5i).

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图5|

CNP通过HSP-P53-TASP6信号通路增加外体释放。

一.模拟5个选定位置的温度变化。200 V和10 ms脉冲在功率密度为~1×10的纳米通道出口中产生了局部“热点”¹⁴宽/米^三峰值温度比环境温度高达60°C。脉冲结束后，由于纳米通道内的加热流体体积极小（V），“热点”迅速消失_纳米通道≈ 1 × 10⁻¹²厘米^三)与纳米通道外的本体溶液相比（V_大量的≈0.1厘米^三).b条.连接到CNP设备表面的MEF（绿色）的自顶向下图像。在CNP转染之前（0s），红点显示纳米通道位置和室温。CNP电脉冲（CNP）使纳米通道/细胞表面界面的温度急剧升高。c（c）纳米通道的横截面图显示了CNP脉冲之前（0s）、期间和之后（1s）纳米通道内的温度变化。d日.电池-阳极通道界面的温度瞬时（<1s）增加至~60°C。e（电子）未处理（PBS）和CNP/PBS刺激（CNP）MEF中HSP90和HSP70的Western blot。（f）.外体浓度为10的动态光散射（DLS）测量⁸含或不含HSP抑制剂的CNP刺激MEF表明HSP70和HSP90对外泌体的产生至关重要。NVPHSP990:HSP90抑制剂；VER155008:HSP70抑制剂。克Western blot结果显示，CNP增加了P53 WT MEF中P53和TSAP6蛋白的表达，但不影响P53−/−MEFs中P53或TSAP6蛋白质的表达。小时外显子浓度的动态光散射（DLS）测量表明，敲除P53可以部分阻断CNP后外显子的释放。我CNP如何在CNP转染细胞中触发外显子释放的拟议机制示意图。数据来自三个独立实验，以平均值±标准误差表示。为了进行比较，进行了双侧学生t检验。

CNP生成外体的功能和药代动力学评估。

为了评估信使核糖核酸外泌体的临床实用性，我们靶向了常见突变的肿瘤抑制基因PTEN公司在一个PTEN公司-人类U87缺陷和小鼠GL261胶质瘤模型。为了实现胶质瘤靶向功能，我们首先将胶质瘤靶点肽克隆到CD47的N末端，CD47是一种外泌体表面丰富的跨膜蛋白(图6a). 两种不同的肽，一种用于U87靶向的CDX肽（FKESWREARGTRIERG）、一种用于GL261靶向的CREKA和一个FLAG表位，分别插入CD47的N末端。由于外显体上CD47的拓扑结构尚不清楚，我们使用抗FLAG珠进行了下拉分析，以确认CD47的N末端定位于外显体表面(图6b). 添加靶向肽显著增加了U87和GL261细胞中CD47-exosome（Exo-T）的摄取以及PTEN蛋白的翻译(图6c–（f）,图S4f,S5a系列–d日). 内吞标记物染色显示Exo-T与转铁蛋白强烈共定位(图6g,图S5e). 抑制氯氰菊酯介导的内吞作用显著降低外泌体的细胞摄取(图6h,图S5f)这表明Exo-T进入靶细胞可能是由氯氰菊酯介导的内吞作用介导的。Exo-T抑制肿瘤细胞增殖并表现出最小的细胞毒性(图6i–j,图S5g–小时).

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图6|

体外用于小鼠基因治疗和免疫原性评估的CNP生成外泌体的研究。

一克隆到CD47跨膜蛋白N末端的GBM靶向肽的示意图。b条外泌体下拉实验的Western blots显示，FLAG珠可以下拉克隆的N端FLAG-CD47，表明CD47的N端位于外泌体内。c（c）胶质瘤（GL261）细胞对CNP生成的外泌体的摄取增加，外泌体包被与CD47相连的脑肿瘤靶向肽。外泌体：未涂层外泌物。Exo-T：由转染CREKA-CD47质粒的CNP刺激BMDCs产生的外显体。d日流式细胞术检测GL261摄取PKH26标记的Exo-T的荧光强度，进一步证实Exo-T在GL261细胞中的摄取最佳。e（电子）PBS、exosome或Exo-T处理24小时后GL261细胞PTEN染色的典型共焦显微镜图像。（f）流式细胞术检测GL261与外泌体孵育24小时后PTEN染色的荧光强度，表明外泌T组PTEN蛋白表达较强。克PKH26标记的Exo-T囊泡（红色）与不同内吞标记物（绿色）共定位的代表性免疫染色图像。结果表明，大多数Exo-T与A488-Tf共定位，表明Exo-T主要通过依赖于网格蛋白的内吞作用被摄取。A488-Tf：氯菊酯依赖性内吞标记物；A488-CT-B：小泡依赖性内吞标记物；FITC-右旋糖酐：大胞饮标记物。小时流式细胞术检测GL261在不同抑制条件下摄取PKH26标记的Exo-T的荧光强度，进一步证实Exo-T主要通过氯氰菊酯依赖的内吞作用摄取。蔗糖：氯菊酯依赖性内吞抑制剂；菲利平：腔泡依赖性内吞抑制剂；和Wortinin：大胞饮抑制剂。我用空的脂质体（E-Lipo）、外泌体和外泌T处理的GL261细胞活力表明外泌T具有良好的生物相容性。j.GL261细胞活力通过脂质体、exosome和包含Exo-T的PTEN公司信使核糖核酸。k个.小鼠全身注射PKH26标记的外泌体的循环半衰期。CD47蛋白的过度表达大大延长了外泌体的循环半衰期，这不受CREKA肽插入的影响。外显子C：来自CNP/CD47质粒转染BMDCs的外显子体。Exo-T：来自CNP/CREKA-CD47质粒转染BMDCs的外显子。插图：证实转染CREKA-CD47质粒的BMDCs外显子中CD47蛋白的表达。我.AST、ALT、肌酐、BUN、IL6和TNFα水平通过ELISA测定，并给药不同剂量的CREKA-CD47靶向外泌体（Exo-T）。所有数据均来自三个独立实验，以平均值±s.e.m表示，进行双侧Student t检验进行比较(d、 f、h、i、j、k、l).

调查Exo-T在以下方面的潜力体内应用，我们首先评估了其药代动力学特性。CD47质粒转染细胞后，CD47在胞外体表面强烈表达(图6k，上部面板）。外泌体表面CD47的过度表达增加了体内Exo-T的循环半衰期为3倍，而靶向肽的添加对CD47功能没有任何明显影响(图6k). 免疫原性结果表明，Exo-T没有明显的免疫原性体内测试不同剂量和时间点（2h、8h和24h）对小鼠的毒性或免疫原性(图6l,图S5i).

质粒制备。

如前所述合成Achaete-Scute Complex Like-1（Ascl1）、Pou Domain Class 3转录因子2（Pou3f2或Brn2）和Myelin转录因子1 Like（Myt1l）⁴⁰PTEN、CD47、CD63-GFP和miR-128质粒购自Origene。设计用于编码CDX的引物（FKESWREARGTRIERG）⁴¹、CREKA⁴²、和FLAG标签用于将配体引入CD47的N末端。

从小鼠骨髓中分离单核细胞。

将4至12周龄C57BL/6小鼠通过颈椎脱位处死，并在70%乙醇中消毒5分钟。在无菌条件下取出并纯化股骨和胫骨。然后用PBS清洗完好的骨头，并用剪刀剪断骨头两端。使用直径为0.45 mm的针，用RPMI-1640培养基冲洗骨髓。通过1000 rpm离心5分钟收集细胞。Tris NH公司₄向细胞颗粒中添加Cl红细胞裂解缓冲液以去除红细胞。将细胞悬液以1000 rpm进一步离心5分钟，以收集单核细胞。

骨髓来源DC（BMDCs）的诱导培养。

分离的单核细胞在37°C的RPMI-1640培养基中培养，添加10%FBS，培养箱中含有5%CO₂培养基中添加20 ng/ml GM-CSF和10 ng/ml IL-4。培养12小时后去除非粘附细胞，并用含有GM-CSF和IL-4的新鲜完整培养基替换。第7天，通过用吸液管将培养基轻轻移到烧瓶上，收集松散粘附的细胞。将细胞接种到CNP芯片中，与脂多糖一起额外孵育24小时。^43,44

脂质体制剂。

这个PTEN公司含PEG脂质体的mRNA在体内转染试剂（Altogen Biosystem）按照制造商的说明制备。简单地说，合成100μgPTEN公司mRNA在100μl无核糖核酸酶水中稀释。将稀释的mRNA溶液与50μl转染试剂混合在无菌试管中，并在室温下培养15分钟。加入10微升的转染增强剂试剂，并将混合物在室温下孵育5分钟。使用5%葡萄糖（w/v）无菌溶液将最终注射量调整为每只小鼠0.4 ml。脂质体组和外体组的mRNA剂量为40μg/kg。

细胞转染。

对于CNP，将单层MEF、MSCs、DC或HEK-293T细胞（约200000个细胞）铺在1 cm x 1 cm 3D CNP硅片表面上，用于过夜细胞培养。预加载在PBS缓冲液中的质粒通过纳米通道（直径约500 nm，间距5μm）注入单个细胞，使用200 V电场，以10 ms/脉冲的速度，5个脉冲，间隔0.1秒。测试了各种电穿孔条件以获得最佳选择。BEP（Neon Transfection System，Thermo Fisher Scientific）、Gene Gun（PDS-1000/He™System，Bio-Rad）和Lipofectamine 2000转染均按照制造商的说明进行。根据文献中的方案，Ascl1/Brn2/Myt1l质粒的重量比为2/1/1，PBS缓冲液中的浓度为100 ng/mL，⁴⁰预先混合进行转染。细胞转染PTEN、miR-128、CD47、CDX-CD47、CREKA-CD47和CD63-GFP型质粒遵循相同的程序。

收集和纯化供体细胞分泌的EV。

细胞在含有血清的培养基中培养。转染前，去除含有血清的细胞培养基。CNP后，用PBS冲洗细胞三次，并在无血清细胞培养基中培养48小时。对于qRT-PCR，按照制造商的说明，使用ExoQuick™（SBI）沉淀法，通过1500g简单离心10分钟，从细胞培养上清液中收集EV。对于通过动态光散射测角仪（DLS）和NanoSight™进行EV粒子测量，在体外细胞转染和体内动物实验中，按照文献所述，通过连续离心和超速离心从细胞培养上清液中收集EV。^45,46简单地说，将细胞培养上清液在2000g下离心10分钟以去除细胞碎片。然后再在10000g下离心30分钟以去除微泡。在100000g超速离心2小时后，将最终的外泌体部分制成丸状。

OptiPrep公司™密度梯度净化。

使用OptiPrep™密度梯度超速离心法纯化外显子。³⁶简单地说，通过用0.25M蔗糖/10 mM Tris缓冲液稀释OptiPrep储备溶液，制备不同浓度的碘克山醇溶液（40%、20%、10%和5%，w/v）。将40%、20%和10%的碘克山诺溶液各分层3 ml，然后再分层2.5 ml 5%的碘克山诺溶液，形成不连续的碘克沙诺梯度。将粗外泌体样品放置在溶液顶部，并在4°C的SW Ti40转子中以100000g离心16小时。收集表面部分（1 ml），并在冰冷PBS中稀释至最终体积12 ml，然后在4°C下以100000g进一步离心2小时，以造粒外泌体。

三维CNP生物芯片制造。

纳米通道阵列器件是基于<100>双抛光10cm晶片（UniversityWafer，Inc.项目号2345）制造的。简单地说，经过HMDS预处理后，以3000 RPM的速度在硅片上首次旋涂了一层薄薄的Shipley 1813光刻胶。使用投影光刻技术（GCA 6100C步进器（l线））对光刻胶上的纳米孔开口进行图形化。利用深度反应离子刻蚀（DRIE）技术“博世工艺”刻蚀高纵横比（>20:1）纳米通道阵列（10μm深）。腐蚀气体SF的交替序列₆和侧壁钝化气体C₄F类₈是使用优化的参数设置的。使用结合光刻和DRIE的类似工艺，在晶圆另一侧生成微通道贮存器。加工后的晶圆在食人鱼清洗（120°C，10分钟）中清洗，然后切成1 cm x 1 cm的块。PDMS垫片由预聚物/固化剂混合物（Sylgard 184，Dow Corning）（10:1重量比）在室温下固化3天制成。用氧等离子体（PTS氧等离子体系统）对PDMS和硅表面进行预处理，以确保紧密结合。在玻璃载玻片（Denton DV-502A）上沉积一层金薄膜作为底部电极。一根金棒被用作顶部电极。

从总EV中分类外泌体和微泡。

通过10000 g离心30分钟，从总EV中分离出微泡。如文献报道的方案所述，将上清液在100000 g下进一步离心2小时，以收集较小的外泌体。^45,46

通过DLS和NanoSight™进行EV尺寸测量。

使用DLS测角仪（BI-200SM测角仪，Brookhaven Instruments）测定EV的大小分布。NanoSight™在转染后使用相同数量的活供体细胞对每个细胞分泌的外泌体和微泡的绝对数量进行量化，以进行比较。

琼脂糖凝胶试验。

将样品装入含有0.5%μg/ml溴化乙锭的1%（w/v）琼脂糖凝胶中。在100 V下电泳30分钟。凝胶在ImageMaster VDS（瑞典法玛西亚）上的紫外光下成像。

含EV RNA表达水平的qRT-PCR。

Ascl1、Brn2、Myt1l和PTEN公司按照制造商推荐的方案，使用qRT-PCR测量EV中的mRNA和miR-128。简而言之，根据制造商的说明（Invitrogen），使用TRIzol试剂获得总RNA。使用带有随机六聚体的第一链cDNA合成试剂盒（Invitrogen）进行等量RNA的反转录。使用CYBR绿色PCR Master Mix（ABI）测量基因表达。所有实验均一式三份。为了测量全长PTEN mRNA，退火温度设置为60°C，延伸时间设置为72秒。用合成的PTEN mRNA构建标准曲线。使用的浓度为0.0001、0.001、0.01、0.1、1和10 ng/μl。使用的引物序列如下：Ascl1（小鼠），正向：5’-TGGTGTCTGAACCTAAGCCC-3’，反向：5’-GTCCGGAACTGCTT-3’；Myt1l（鼠标），正向：5'-CCTATGAGGACCAGTCTCC-3'，反向：5'-GACATGGCTGGTCACTGGAT-3'；Brn2（鼠标），正向：5'-GACACGCCGACCTCACAC-3'，反向：5'-GATCGCCTCTGCTTGAAT-3'；GAPDH（鼠标），正向：5'-GGGAAATTCAACGGCACAGT-3'，反向：5'-AGATGGTGATGGCTTCCC-3'；PTEN公司，正面：5'-CAGATGATGTTGAAACTATTCAAATG-3'，反面：5'-cCTTAGCTGGCAGACAACAA-3'；PTEN公司（全长），正向：5'-ATGACAGCCATCAAAGAGATC-3'，反向：5'-TCAGACTTTTTGTGATTGTATGCTG'；和GAPDH，正向：5'-GACAGTCGCGCATCTTCT-3'，反向：5'-TTAAAAAGCAGCCTGGTGAC-3'。

体外蛋白质翻译。

每种转染方法的总RNA（1μg）用于在体外根据制造商的说明，使用兔网织红细胞裂解物系统（Promega）进行蛋白质翻译。翻译程序完成后，用SDS-PAGE分离样品，并用各种抗体检测蛋白质，如Western blotting图所示。

透射电子显微镜（TEM）。

在CNP转染后4小时收集用于TEM分析的细胞，将其重新悬浮在PBS中的20%BSA中，然后将其置于200μM深的帽子中，并使用Leica EM PACT2在高压下冷冻。然后使用肯特·麦克唐纳（Kent McDonald）的快速方法在冷块中将冷冻样品冷冻替换为丙酮中的1%四氧化锇和0.1%乙酸铀酰。⁴⁷然后将样品保存在聚苯乙烯泡沫塑料块中3小时。样品达到0°C后，将其移到遮光罩中并在那里停留12h。然后以~5°C/h的速度将样品加热到25°C，并在25°C下停留12h，样品在丙酮中洗涤两次，在环氧丙烷（PO）中洗涤一次，每次洗涤15分钟。用EMbed-812树脂（EMS Cat#14120）将样品与PO按1:2、1:1和2:1的比例混合渗透2小时，并将其留在2:1树脂与PO的混合物中过夜，在罩内室温下旋转。然后将样品放置在EMbed-812中2~4小时，并放置在带有标签和新鲜树脂的TAAB胶囊中，样品载体/细胞（如果仍在帽子中）朝上，放置在65°C的烘箱中过夜。在75-90 nm范围内取切片，在formvar/Carbon涂层100目Cu网格上取下，然后在3.5%尿酸盐和50%丙酮中对比染色30秒，然后在0.2%柠檬酸铅中染色3~4分钟。在JEOL JEM-1400 120kV中观察到样品，并使用Gatan Orius 2k x 4k数码相机拍摄照片。

低温透射电镜。

对于低温电子显微镜，将3μl EV样品置于辉光放电的300-mesh R2.0/2.0 Quantifoil网格上。网格被Whatman#1滤纸吸干，并使用Vitrobot IV柱塞（FEI）在液态乙烷中快速冷冻。在4k×4k CCD相机（Gatan）上以59000倍的放大倍数（20电子/奥的剂量）记录显微照片²以及在300kV下运行的FEI Tecnai F30电子显微镜中的5μm离焦。

通过细胞摄取碘化丙啶（PI）染料评估细胞膜损伤。

通过基于扩散的细胞摄取PI染料（Invitrogen，Cat#P3566）和随后的荧光信号来量化CNP诱导的瞬时细胞膜损伤。用200 V，20 ms的电脉冲通过CNP转染MEF。立即在顶部（细胞侧）或底部贮存器中添加PI染料。使用配备EMCCD相机（Evolve，Photometrics）的倒置显微镜系统（Eclipse Ti-E，Nikon）进行了芯片上延时荧光活细胞成像。根据供应商手册（Neon Transfection System，Thermo Fisher Scientific）中建议的电场条件，对MEF进行BEP控制。

细胞内钙浓度的测量。

细胞在37°C下与10μM Fura2-Am孵育1小时。用PBS洗去细胞外染料，将细胞重新悬浮在完全RPMI培养基中，密度为1×10⁶细胞/ml。在日立F-2000荧光分光光度计中记录CNP后的荧光变化。所有实验均避光，并在2小时内完成。

CNP期间的温度测量。

如前所述，使用感温荧光染料罗丹明B（Thermo Fisher Scientific，Cat#AC419000010）测量CNP期间焦耳加热引起的温升。⁴⁸为了防止荧光染料扩散，将海藻酸钠溶液添加到氯化钙粉末中，形成海藻酸钙凝胶，以抑制CNP过程中的染料扩散。

CNP过程中的有限元传热模拟。

使用COMSOL®Multiphysics 5.0模拟纳米通道附近的温度场。（COMSOL Inc.）“流体传热”模块，通过求解控制方程<trans data-src="ρ">ρ</trans><trans data-src="c">c（c）</trans><trans data-src="p">第页</trans><trans data-src="∂">∂</trans><trans data-src="T">T型</trans><trans data-src="∂">∂</trans><trans data-src="t">t吨</trans><trans data-src="+">+</trans><trans data-src="ρ">ρ</trans><trans data-src="c">c（c）</trans><trans data-src="p">第页</trans><trans data-src="u">u个</trans><trans data-src="⋅">⋅</trans><trans data-src="∇">∇</trans><trans data-src="T">T型</trans><trans data-src="=">=</trans><trans data-src="k">k个</trans><trans data-src="∇">∇</trans><trans data-src="2">2</trans><trans data-src="T">T型</trans><trans data-src="+">+</trans><trans data-src="Q">问</trans>哪里ρ： 密度c_第页：热容u：流速k：导热系数；初始温度=22°C。纳米通道被视为功率密度为Q的脉冲热源_数控=P/V≈10¹⁴宽/米^三.将模拟数据导出到MATLAB（MathWorks）进行分析。

EV下拉分析。

蛋白质-A琼脂糖珠（Sigma）与2 mg/ml BSA/PBS溶液在4°C下孵育过夜。随后将珠粒用冷PBS洗涤三次。兔抗FLAG抗体与珠在4°C下孵育4小时，然后用冷PBS洗涤三次。纯化的EV与珠孵育过夜。洗涤后，在0.1%SDS中洗脱珠子，并将20μl上清液用于聚丙烯酰胺凝胶。

EV细胞摄取分析。

EV用PKH67标记，并在治疗前在37°C的24孔板中与60000个U87-MG细胞孵育4小时。培养后，用冷PBS冲洗细胞三次，并将其固定在4%多聚甲醛溶液中。使用Beckman Coulter EPICS XL流式细胞仪分析细胞荧光强度。在LIST模式下，每个细胞样本至少收集了10000个事件。

共焦显微镜。

转铁蛋白AlexaFluor 488（TF-A488）、霍乱毒素亚基B AlexaFlu 488结合物（CT-B-A488，美国英维特罗根）和FITC-右旋糖酐（Sigma-Aldrich）用于标记不同的内吞途径。将TF-A488、CT-B-AF488和FITC-右旋糖酐分别稀释至0.1 mg/ml、5 mg/ml和0.005 mg/ml，并与U87-mg细胞孵育1小时。然后用PKH26（2μM）（Sigma-Aldrich）染色的EV培养细胞4小时，用冰冷的PBS洗涤两次，并用甲醛（4%）/PBS固定30分钟。细胞核用金涂层溶液DAPI染色，荧光在激光扫描共焦显微镜（LSM710，卡尔蔡司，德国）上显示和记录。所有图像均采用离线背景减法进行分析。

系带脂蛋白纳米粒子（TLN）生物芯片分析和全内反射荧光（TIRF）成像。

在全内反射荧光（TIRF）显微镜（尼康Eclipse Ti倒置显微镜系统）上，使用系链脂蛋白纳米粒子（TLN）生物芯片对EV进行测试，遵循其他地方描述的相同程序²⁴简而言之，RNA靶点的分子信标（MB）被包裹在阳离子脂质体纳米粒子中。这些阳离子脂蛋白纳米粒子系在玻璃载玻片上，通过静电相互作用捕获带负电的电动汽车，形成更大的纳米复合物。这种脂溶酶-EV融合导致RNAs和MBs在生物芯片界面附近的纳米尺度限制内混合。TIRF显微镜用于测量焦平面界面300 nm范围内的荧光信号，这是栓系脂质体纳米粒子的位置。

MTS分析。

转染前24小时，将U87-MG细胞以5000个细胞/孔的密度接种在96周的平板中。用无血清培养基清洗细胞三次，并用EV培养。在转染后48小时，用新鲜的细胞培养基代替培养基。然后根据制造商的说明，通过MTS分析分析细胞活力。简单地说，向每个孔中添加20μl MTS试剂（Promega）。在增湿大气（5%CO）中培养微孔板后₂，37°C）持续2h，使用微孔板阅读器测量分光光度吸光度。测量波长设置为490 nm。细胞存活率以未处理对照的百分比表示。

动物。

6～8周龄BALB/C-nu和C57BL/6小鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司和北京威通利华实验动物科技有限公司。动物被关在无病原体设施的隔离笼中。所有动物实验均经吉林省科学技术科学考察委员会和吉林大学生命科学学院动物伦理委员会批准（编号：2016SY1002）。所有实验程序均按照《实验动物人道待遇指南》和实验动物护理和使用程序进行。

细胞凋亡检测。

1×10⁴MEF细胞接受CNP转染，24小时后收获。使用0.5 mM过氧化氢处理非CNP MEF细胞作为阳性对照。所有细胞用预冷的PBS洗涤两次，并根据制造商的方案使用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒（Invitrogen）测量细胞凋亡。简单地说，将清洗后的细胞重新悬浮在195μl结合缓冲液中，并在室温下与5μl Annexin V-FITC混合10分钟。然后将细胞在1000g下离心5分钟，并用结合缓冲液清洗。然后将悬浮细胞溶液与10μl碘化丙啶（20μg/ml）在黑暗中混合10 min。用流式细胞仪（EPICS XL，Beckman Coulter）分别使用FL1（FITC）和FL3（ECD）通道分析染色细胞。每个样本共收集了10000个细胞计数。

蛋白质印迹。

蛋白质样品在转移到PVDF膜上的10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳。在Tris缓冲盐水溶液（TBS，150 mM NaCl，20 mM Tris-HCl，pH=7.4）中用5%脱脂牛奶封闭膜，并在4°C下用TBS，0.05%吐温20中的一级抗体孵育过夜。清洗后，将印迹与次级抗体反应45分钟，并使用增强化学发光（ECL）检测系统进行显影。抗Calnexin兔多克隆抗体（Cat.#.AF5362）、抗GAPDH兔多克隆抗原抗体（Cat.#.AF7021）购自Affinity Biosciences。抗细胞色素C小鼠单克隆抗体（Cat.#.ab110325）、抗Ascl1兔多克隆抗体，抗TSG101兔多克隆抗体（Cat.#.ab30871）、抗P53小鼠单克隆抗体（Cat.#.ab26）、抗TSAP6兔多克隆抗（Cat.#.ab151566）购自Abcam。抗-PTEN兔多克隆抗体（Cat.#.95525）是从Cell Signaling获得的。抗Rab27a绵羊多克隆抗体（Cat.#.PA5-47907）购自Thermo Fisher。

体内毒性和免疫原性分析。

体内按照制造商的说明，使用检测试剂盒（Roche）对野生型C57BL/6小鼠全身输送EVs后血清中的ALT、AST、BUN和肌酐进行毒性分析。分别用IL-6和TNFαELISA试剂盒（Thermo Fisher Scientific）测定小鼠注射EV后的血清IL-6和肿瘤坏死因子α水平。

动物手术和肿瘤植入。

小鼠（BALB/c-nu或C57BL/6，6-8周龄，雄性）通过腹腔注射10%水合氯醛进行麻醉，并固定在立体定向装置中。麻醉后，皮下注射地塞米松（2 mg/kg）和丁丙诺啡（0.2 mg/kg）以减轻炎症和疼痛。剃光了头，露出了头骨。在体感皮层上方用手术钻进行直径为3～4mm的环形开颅手术。肿瘤细胞（1×10⁸BALB/c-nu小鼠的U87-Luc肿瘤细胞，C57BL/6小鼠的GL261-Luc肿瘤肿瘤细胞）使用32号针使用微型操作器以0.1μl/min的速度，使用以下坐标（注射位置为尾状核），将其压入表面以下约800μm的皮层：在距脑表面3.0毫米的深度处，距脑前0.5毫米，侧1.5毫米。植入后，将圆形玻璃盖玻片（直径：5 mm）粘在周围的颅骨切除部位，然后用牙科水泥进一步固定。体温由直肠探头监测，并由加热毯（哈佛仪器的恒温毯系统）保持在37°C。地塞米松（皮下注射，2 mg/kg）和丁丙诺啡（皮下注射0.2 mg/kg）每天一次，持续一周，以减轻术后炎症和疼痛。在肿瘤植入14天后对动物进行首次成像，只有在生理变量保持在正常范围内时才进行实验。

IVIS成像。

使用BALB/C-nu或C57BL/6小鼠研究体内外源体的靶向性和生物分布。肿瘤植入后14天（1×10⁸，BALB/c-nu小鼠的U87-Luc肿瘤细胞，C57BL/6小鼠的GL261-Luc瘤细胞），在荧光显微镜下确认肿瘤。PKH26标记的Exos、Exo-T和TurboFect体内通过尾静脉静脉注射转染（Turbo）或聚乙二醇脂质体。注射后1小时和4小时，用10%水合氯醛麻醉小鼠，并通过IVIS Spectrum（PerkinElmer，Waltham，America）进行记录。4小时后，处死小鼠，收集主要器官，包括大脑、肝脏、肺、脾脏、心脏和肾脏。采集并分析了PKH26的荧光信号。

双光子成像。

小鼠（BALB/c-nu或C57BL/6，6-8周龄，雄性）通过腹腔注射3%水合氯醛麻醉，并固定在定制立体定向装置中。盐、纳米粒子（NPs）和EVs以1:1的比例与PKH26连接试剂盒（Sigma-Aldrich）混合，并立即将混合物静脉注射到四个不同的组：PBS、NPs（BALB/c-nu小鼠的Turbo和C57BL/6小鼠的脂质体）、外泌体和外泌T；（每组3人）。将垂直激光扫描显微镜（BX61WI，奥林巴斯）连接到钛宝石脉冲激光系统（重复频率80 MHz，脉冲宽度<100 fs，Spectra Physics）和软件（Prairie view 5.4，Bruker）上，用于跟踪和测量注射后不同时间肿瘤区域内盐水、NP和EV的分布：1小时、4小时、8小时、，和24小时。选择20倍浸水（NA，1.00；WD，2 mm，奥林巴斯）和40倍浸水物镜（NA 0.80，WD；3.3 mm，奥林巴斯）进行荧光成像体内试验。用890nm的辐照波长激发U87-Luc（或Gl261-Luc）和PKH26红色荧光，分别用525/50和595/500滤光片区分和收集发射光。成像的平均激光功率小于50 mW。

体内肿瘤治疗分析。

植入10天后，通过生物发光成像确认颅内肿瘤的形成。将小鼠随机分为五组，分别给予生理盐水、Exo、Exo-T、E-Exo-T或Turbo（或脂质体）治疗。通过尾静脉注射进行治疗，每三天注射一次，剂量为10¹²外泌体。MEF的外显子用于U87动物模型，BMDC的外显体用于GL261动物模型。在第3、6、9和12天捕获并分析荧光素酶的荧光信号。记录各组小鼠的存活时间，并用Kaplan-Meier法绘制存活曲线。

组织学和免疫组织化学（IHC）分析。

将所有载玻片在二甲苯中脱蜡10分钟，共三次，然后通过分级乙醇进行再水化。如前所述进行抗原提取和免疫染色²²使用Vector M.O.M.Basic工具包。简单地说，使用10 mM柠檬酸盐缓冲液（pH=6.0）进行抗原回收。将载玻片在0.3%过氧化氢中孵育30分钟以抑制内源性辣根过氧化物酶的活性，然后用TBST/5%正常山羊血清封闭。抗PTEN或Ki-67的一级抗体以1:1000的稀释度使用。我们使用H&E染色对其他正常器官进行组织学分析，包括肝脏、肺、心脏、脾脏和肾脏。如前所述，使用Image J软件分析各组PTEN和Ki67的强度。⁴⁹

统计分析。

除非另有说明，否则数据显示为三份的平均值±标准偏差。根据情况，使用双尾Student t检验或单因素方差分析结合事后检验进行统计分析。P值小于0.05表示具有统计学意义。使用GraphPad Prism 7软件进行统计分析。没有动物被排除在分析之外。

这项工作得到了美国国家科学基金（EEC-0914790）（L.J.L）、中国国家自然科学基金（No.81502999）（L.T.）、（No.81773758）（T.L.）、国家心脏、肺和血液研究所（R01HL132355）（J.O.）、国家神经疾病和中风研究所拨款（R01 NS104315）的部分支持（B.Y.S.K.）、德克萨斯州CPRIT RR180017癌症预防研究所（W.J.）、美国脑瘤协会（DG190021）和美国国家癌症研究所（K08 CA241070）（W.J）。我们感谢John Perrino先生（斯坦福大学）的TEM成像，该成像部分得到了国家研究资源中心（1S10RR026780-01）的支持。本书内容仅由作者负责，不一定代表NCRR或国家卫生研究院的官方观点。作者感谢俄亥俄州立大学纳米技术西部实验室的Dave Hollingshead先生协助CNP器件制造，北京大学生物物理系的Xinrui Huang博士为低温TEM成像提供了关键帮助，以及吉林大学生命科学学院的Fanchao Meng博士用于胞外体制备和共焦显微镜。我们还要感谢Science Storylab的Ai Lin Chun博士和UT Southwestern Medical Center的Jonathan Feinberg博士提供的编辑服务。