少突胶质细胞祖细胞分化过程中的层粘连蛋白B1-基因动态关联

Dam-ID方法

在第1天接种初级小鼠OPC，然后在第2天用表达系留LMNB1-Dam或未系留Dam的慢病毒载体转导。表达LMNB1-Dam或Dam的OPC在有丝分裂原（PDGF-AA 20 ng/ml和FGF 10 ng/ml）存在下保持增殖。在化学定义的培养基中，通过去除丝裂原和补充甲状腺激素（T3 30 ng/ml）来区分OL。72小时后采集细胞分离基因组DNA。

DamID的执行如前所述[28]. 简单地说，基因组DNA是从收获的细胞中分离出来的。使用甲基化特异PCR扩增协议从基因组DNA中扩增腺嘌呤甲基化片段，并使用Qiaquick柱（Qiagen）纯化片段。然后将DamID PCR产物剪切到100–500 bp的范围，峰值约为300 bp。剪切后，用Agencourt磁珠进一步纯化和浓缩DNA。然后在安捷伦生物分析仪2100 DNA 7500芯片上分析DNA。根据制造商的说明，剪切后的材料用于使用TruSeq DNA HT样品制备试剂盒制备Illumina测序文库。文库在安捷伦生物分析仪2100 DNA 7500芯片上进行量化，并使用Illumina HiSeq2500进行测序。

DamID测序数据处理与分析

使用cutadapt（v1.9.1，https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/#)，'cutadapt--no-trim-g“GGTCGCGCGAGGAGGAGGAATC”--no-indels-O 4-O primer_reads.fastq.gz-untrimed-output=no_primer_reads.fastq.gz>find_gatc_metrics'。随后，将包含引物序列的读数完全修剪，以除去除DpnI相关的GATC识别位点“cutadapt-g GGTCGCGGCCGAG-a GATCCTCGCCGCGACC--no indels-o trimmed_GATC_reads.fastq.gz primer_reads.fastq”之外的所有引物序列。gz>trim_gatc_metrics’。使用BWA-MEM（v0.7.17-r1194-dirty，https://bio-bwa.sourceforge.net网站) [30]. 进一步从生成的BAM中删除读取，除非它们包含预期在路线两端的GATC序列签名。合并每个样本所有运行的BAM(合并Sam文件)和重复标记(标记重复项)使用Picard（v1.140，https://broadinstitute.github.io/picard/index.html).

使用FastQC（v0.11.3，https://www.bioinformatics.abraham.ac.uk/projects/fastqc网址/).

然后，根据比对相对于GA-TC识别位点的方向，将含有GATC-的比对分配给DpnI-消化的基因组片段。每个片段的读取计数通过总库大小，百万计数（CPM）进行标准化。日志₂计算了LMNB1-Dam与相关未捆绑水坝数量的比率。通过取对数平均值进行平滑处理₂比率超过400 bp非相邻窗口。定义层粘连相关域（LAD），平滑对数₂小波平滑后，使用HMMSeq实现的2状态隐马尔可夫模型（HMM）对每条染色体的CPM值进行分割(https://noble.gs.washington.edu/proj/hmmseg/) [31]'java-jar HMMSeg。jar--input-bed--smooth 20000--output_list output_files。txt——解析两者——num-states 2 input_files.txt’。为了便于样本之间的比较，平滑日志₂使用自定义R脚本对所有样本的值进行进一步的分位数规范化。为了在区分OL（T3）和增殖OPC（P+F）样本时对LMNB1相关信号进行差异分析，我们使用基因区域（上游10 kb，下游2 kb）上的平均平滑分位数标准化信号，该信号位于从UCSC表浏览器下载的mm10的已知典型基因坐标上(https://genome.ucsc.edu) [32]. 进行学生的T检验，比较增殖（PDGF+FGF）和分化（T3）条件下每个基因的平均信号，并对p值进行Benjamini–Hochberg校正。调整后的p值小于或等于0.05被认为是显著的。数据保存在基因表达总表（GEO；网址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)临时注册号为GSE135834。

DamID测序数据与之前发布的ESC数据集的比较分析

ESCs DamID数据来自Peric-Hupkes等人[6]. 由于ESC数据是使用带有探针和荧光信号的微阵列获得的，我们获得了原始数据，并将其归一化为R，方法是将所有数字转换为Z分数，以标准化两个数据集之间的值。Peric-Hupkes等人的标准化微阵列数据表[6]通过NCBI的GEO数据库获得。Nimblegen原始数据已经进行了log2变换，并使用局部估计的散点图平滑（LOESS）进行了归一化。将标准化分数和Nimblegen设计文件结合在一起，以确定设计探针的基因组范围。然后通过基本的R工具将数据排列成图表文件格式。按照染色体数目排序后，重叠部分被删除，新的分数通过Galaxy平台上使用床上工具v2.27.1进行求和合并。最后，在Galaxy平台上，使用UCSC的wig/bedgraph-to-bigwig工具v1.1.1将bedgraph文件转换为biggig格式。

基因归属是通过使用R中的IRanges软件包v2.18.1，首先根据基因组范围的重叠将基因ID分配给微阵列探针来确定的。最后，为了使ESC中的原始微阵列数据与我们的mm10数据库兼容，我们使用UCSC liftOver应用程序将基因组范围从9毫米转换为10毫米。导入病历格式的文件，并合并基因组范围，以从10mm UCSC已知基因数据库（TxDb.Mmusculus.UCSC.mm10）分配基因。knownGene）。这使得我们的实验中的标准化数据集可以与之前发布的数据集一起在R中编译[6]并使用基本R函数居中和缩放。使用t检验函数生成P值，并使用Benjamini–Hochberg方法对R进行校正。只有ESC和OPC之间存在显著差异关联或分离的基因(padj值<0.05)用于进一步分析。

LMNB1与成绩单水平的关联或不关联关系

使用Zhang等人获得了少突胶质细胞谱系的表达数据[33]数据库(https://web.stanford.edu/group/barres_lab/brain_rnaseq.html)以及对与OPC相关的成熟OL（mOL=包括新分化和髓鞘形成）特异性基因进行富集，以定义“mOL中的上调基因”和相对于mOL的OPC基因富集，从而定义“mOL中的下调基因”。与LMNB1（ΔLam）有显著差异关联或分离的基因列表_OPCmOL公司)然后与OPC分化为mOL表达期间上调或下调的两个基因列表中的每一个重叠（ΔExpr_OPCmOL公司). 有关基因表达特异性的其他信息是通过使用已发表的参考列表获得的，如Sharma等人和McKenzie等人[34,35].

基因本体分析

基因本体（GO）分析获得于https://amp.pharm.mss.edu/Encrichr（https://amp.pharm.mssm.edu/Enrichr）/使用Enrichr[36,37].

免疫细胞化学

在室温下用4%多聚甲醛（PFA）固定细胞15分钟，并通过在PGBA（0.1 M PB pH 7.4，0.1%明胶猪A型（Sigma G1890），1%BSA（SigmaA8806）和0.002%叠氮化钠），5%正常山羊血清和0.1%Triton X-100中培养1小时来阻断非特异性结合。然后在4°C下将细胞与抗LMNB1的一级抗体（兔多克隆；Abcam ab16048，1μg/mL）、抗OLIG2（小鼠单克隆，Millipore MABN50，2μg/mL。接下来，用PBS清洗细胞，并用Alexa Fluor-conjugated二级抗体（Invitrogen Alexa fluoro：山羊抗鼠546 2μg/mF、山羊抗兔488 2μg/mF和山羊抗鼠647 2μg/m F）孵育2 h。DAPI（4′，6-二氨基-2-苯基吲哚）用作核染色。使用蔡司LSM-800系统拍摄共焦图像。使用ImageJ对捕获的图像进行免疫荧光强度量化。在n=50个OLIG2+细胞中对每种情况和三个独立的生物复制品的FMNB1核像素强度进行量化。

蛋白质印迹分析

使用RIPA缓冲液（50 mM Tris、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1%Triton X-100、0.5%脱氧胆酸钠），辅以1 mM苯甲基磺酰氟（PMSF）、10μM曲古菌素A（TSA）、磷酸酶抑制剂鸡尾酒、新制备的蛋白酶抑制剂鸡尾液（4°C下15分钟），获得蛋白裂解物。将裂解液在4℃下培养1 h，然后在4℃以13000 rpm离心10 min，并丢弃颗粒。收集可溶性部分，并通过Lowry蛋白质测定法（Biorad，5000112）测定蛋白质浓度。将4X SDS-PAGE加载缓冲液（200 mM Tris–HCl pH 6.8、400 mM DTT、8%SDS、40%甘油、0.4%溴酚蓝和10%β-巯基乙醇）添加到在95°C下煮沸5 min的样品中，以使蛋白质变性。将10μg蛋白质加载到4-20%SDS-PAGE预制凝胶（Sigma，PCG2012）上进行蛋白质分离（80 V，120 min），并转移（100 V，60 min）到在甲醇中活化的PVDF膜（Millipore，IPVH00010）。将膜在含有5%牛奶的TBS-T（TBS，0.1%吐温20）中在室温下封闭1小时，并在4°C下与针对LMNB1（兔多克隆；Abcam，ab16048，0.05μg/mL）和GAPDH（小鼠单克隆，Abcam（ab8245；0.2μg/mL第二天，在TBS-T中洗涤膜3次，每次10分钟，并在室温下与辣根过氧化物酶（HRP）偶联的第二抗体（在封闭溶液中稀释）孵育1小时。二级抗体在封闭溶液中以1:10000的稀释度稀释，抗兔（Jackson immunoresearch，211-032-171）和抗鼠（JacksonImmunoresource，115-035-166）。蛋白质在ChemiDoc XRS成像系统（Bio-Rad）中使用ECL Prime western blotting检测试剂盒（GE healthcare，RPN2232）暴露。通过在ImageJ中选择LMNB1免疫反应条带，测量其强度并参考GAPDH免疫反应蛋白条带的强度，获得LMNB1信号的定量。

核膜成分LMNB1与少突胶质细胞系特异性基因关联模式的鉴定

为了开始定义与核膜相关的基因，我们使用了一种非常成熟且具有特征的技术，称为DamID，该技术依赖于相关细胞中LMNB1和细菌酶脱氧腺苷甲基化酶（Dam）之间融合蛋白的表达。这种方法的基本原理是真核细胞中的DNA甲基化发生在胞嘧啶残基上，而细菌，如大肠杆菌，也具有使腺嘌呤残基甲基化的能力。融合蛋白和基因组DNA之间的接近性允许细菌酶甲基化GATC序列中的腺苷，然后可以通过深度测序进行鉴定，并定义LMNB1相互作用的基因组区域。

对于小鼠初级OPC，我们使用慢病毒载体转导LMNB1-Dam系留酶，然后要么在有丝分裂原存在的情况下保持OPC增殖，要么通过去除有丝分裂素和添加甲状腺激素T3诱导其分化(图2a). 在相同条件下培养的OPC中未连接的Dam的表达用于控制酶的非特异性活性(图2a). 为了确定慢病毒转导对细胞中总LMNB1水平的影响，我们对用未栓系或LMNB1栓系Dam转导的细胞的蛋白质提取物进行了Western blot分析，并将其水平与未感染细胞中的水平进行了比较(图2b). 虽然在对照条件下OPC分化为OL的过程中发现LMNB1的内源性水平下降，但在转导LMNB1-Dam融合蛋白的细胞中仍然升高(图2b). 结果通过免疫细胞化学独立验证，使用抗LMNB1的抗体检测总水平，使用抗V5标记（存在于表达载体中，因此识别转导细胞）的抗体检测，这表明分化OL（OL_LMNB1-大坝)表达LMNB1-Dam(图2c). 分化OL中LMNB1蛋白持续高水平_LMNB1-大坝让人想起肾上腺脑白质营养不良患者的细胞，这些细胞是由LMNB1型因此，我们试图确定OPC中与LMNB1相关的基因_LMNB1-大坝如生理条件下检测到的，以及与OL中LMNB1相关的_LMNB1-大坝可能是在遗传导致的病理条件下检测到的LMNB1型导致OL中这种核纹层成分持续存在的突变。

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图2

一种使用细菌酶Dam与LMNB1融合的方法来鉴定少突胶质细胞谱系细胞中的基因组关联区域。一实验方法示意图。顶部面板：OPC转导含有未捆绑的慢病毒大坝表达载体被用作非醚化脱氧腺苷甲基化酶Dam随机甲基化的对照。底部面板：带系绳的OPCLMNB1-大坝表达载体，允许Dam甲基化靠近LMNB1的DNA区域上的腺嘌呤。转导后，OPC要么在有丝分裂原存在的情况下保持增殖，要么通过提取有丝分裂素和添加T3来分化。b通过Western Blot检测未感染OPC的蛋白质提取物的LMNB1蛋白水平，这些提取物来自于处于增殖状态（有丝分裂原）或分化为OL（T3）的OPC，来自于用未醚化Dam转导的OPC以及来自用系留LMNB1-Dam转染的培养物。免疫反应性LMNB1条带的强度是指每个样品中GAPDH的蛋白水平，以进行量化，并显示比率的数值。c LMNB1-Dam融合蛋白在OliNeu细胞核内瞬时表达的核定位，并通过V5表位标签（表达载体上存在）的免疫荧光标记检测，以识别转导细胞（红色）。显示了识别内源性和外源性表达蛋白的总LMNB1（绿色）免疫反应性。DNA被达皮（蓝色）复染。比例尺=10um（在线彩色图）

从OPC中提取基因组DNA后_LMNB1-大坝、OL_LMNB1-大坝从表达未醚化Dam的对照培养物中扩增DNA，用甲基化敏感酶消化，并进行深度测序[28]. 实验在每种条件下进行了三次生物重复，三次重复之间的皮尔逊相关系数很高，显示出高度的一致性(图3a). 使用log2转化的LMNB1-Dam在非醚化Dam甲基化比率上的值定义与LMNB1相关的基因组区域。通过取400 bp以上相邻窗口的平均值来计算平滑比率，使用集成基因组查看器（IGV）。表达LMNB1-Dam的细胞基因组特定区域中富集的甲基化腺嘌呤信号与表达非醚化Dam的细胞的信号相比，可表示为正对数比，并表明该特定区域与核LMNB1的关联(图2c). 相反，对数2比率为负值表示缺乏关联。由于DamID方法之前已被用于定义小鼠ESC核层结合区域，我们还将我们的数据与此公布的数据集进行了比较[6].

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图3

与胚胎干细胞相比，核膜相互作用的18号染色体图谱定义了少突胶质细胞系细胞中LMNB1动态关联区域。一来自OPC和mOL三个生物复制的DamID数据的热图表示。b在ESCs（棕色）、少突胶质前体细胞、OPC（紫色）和成熟少突胶质细胞mOL（灰色）中，18号染色体的基因组区域显示LMNB1关联。对于OPC和mOL，迹线表示LMNB1缔合区域的IGV曲线。y轴表示表达LMNB1-Dam融合蛋白的OPC或OL中甲基化信号与仅表达18号染色体18号染色体Dam的细胞中检测到的信号的对数转换比率。底部的蓝线代表18号染色体上的基因，相应的基因组坐标如下所示。红色方框突出显示重组的血统特异性染色体区域（在线彩色图）

由于在生理条件下，LMNB1在ESC和OPC中均高水平表达[9,19,39]我们推断，比较这两种细胞类型中的系留LMNB1-Dam信号将有助于阐明少突胶质细胞谱系承诺期间发生的任何基因组重组。基因，例如Caln1号机组，编码钙结合蛋白钙神经元-1神经元高度富集[40]或Gypc公司编码糖蛋白C，一种为红细胞提供机械稳定性的糖蛋白[41]和凸轮K4编码参与转录调控的神经元特异性钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶IV[42]显示LMNB1仅在谱系定向增殖的OPC中相关，而在ESC中不相关(图4a). 对可用转录数据集的询问证实了对这些结果的解释(补充图1). 参与细胞周期调节的基因，如E2f7型[43]或细胞周期检查点控制，如半径9b[44]相反，没有被征募到核LMNB1(图4b)这与这两种细胞的增殖能力一致。相反，在少突胶质细胞分化后期表达的基因，如Ptprd公司，编码D型蛋白磷酸酶受体的基因[45]，或由编码的信号素6a塞马6a，一种神经组织正常发育所需的基因[46]显示出与ESC中的核层粘连和OPC中的分离有明显关联(图4c). 少突胶质细胞谱系的其他特征基因，如奥利格1和奥利格2(补充图2)它们在调节少突胶质细胞发育中起关键作用，表现出类似的关联模式。从这一分析中，我们得出结论，基因组区域与核膜的关联是一个动态过程，取决于基因产物的功能作用和细胞的分化状态。

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图4

从ESC向OPC过渡期间，基因与核膜的动态关联。该图显示了ESC（棕色）和OPC（紫色）中18号染色体Dam甲基化比率的log2转化LMNB1-Dam/的IGV曲线剖面。提供了代表性示例。一编码神经元基因的基因组区域(Caln1号机组)在从ESC到OPC的过渡过程中，附着到核层。糖蛋白C的基因组区域也有类似的趋势(Gypc公司)以及神经元特异性钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶IV(凸轮4).b细胞周期调控基因的基因组编码区(E2f7型)以及细胞周期检查点控制基因(半径9b)保持与核膜分离，与这些细胞的增殖状态一致。c（c）少突胶质细胞特异基因的基因组编码区Ptprd公司和塞马6a从ESC过渡到OPC期间，失去与核LMNB1的连接（在线彩色图）

为了研究从ESC向OPC过渡期间发生的基因组重组全球变化的实体，我们对OPC中的数据进行了比较分析_LMNB1-大坝以及之前报告的ESC中LMNB1关联区域[6]. 由于LMNB1在OPC中高水平表达[19]，我们推断在从ESC到OPC的过渡过程中检测到的动态关联区域_LMNB1-大坝，将代表在生理条件下发生的情况(图5a). 在ESC细胞中检测到的21618个基因中，OPC的进展伴随着1251个基因被招募到LMNB1，1548个基因从LMNB1转移。重要的是，当ESC被指定为星形细胞谱系时，与LMNB1相关的基因[6]与OPC中检测到的不同_LMNB1-大坝并提出了每种胶质细胞类型的不同和谱系特异性联系。

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图5

寡突胶质细胞系细胞中与核膜成分LMNB1相关的基因及其表达谱的关系。一条形图表示从ESC到OPC过渡期间，基因未发生变化（黄色）或显示出统计显著性（p-val<0.05）的关联（红色）或从LMNB1分离（绿色）_LMNB1-大坝（左面板）或从OPC转换期间_LMNB1-大坝至OL_LMNB1-大坝（右侧面板）。b从OPC过渡期间具有LMNB1动态关联（红色）或不关联（绿色）的基因之间重叠的维恩图_LMNB1-大坝至OL_LMNB1-大坝和转录物在正常OL分化过程中上调（上面板中为灰色）或下调（下面板中为灰）（数据来自Zhang等人[33]).c（c）,d日从OPC过渡期间与核叶片（顶部）存在差异关联的基因条形图_LMNB1-大坝至OL_LMNB1-大坝以及根据Zhang等人[33]（底部）。正ΔLam_（OPCmOL）数值（红色条）表示基因附着于核纹层(c（c）). 负ΔLam_（OPCmOL）值（绿色条）表示基因从LMNB1型(d日). 灰色条的向上或向下方向（ΔExpr_{（OPCmOL公司})表示OPC向mOL分化过程中转录上调或下调（数据来自Zhang等人[33])（在线彩图）

作者感谢Bas van Steensel博士和Daan Peric-Hupkes博士慷慨分享试剂和方案，并提供宝贵建议。这项工作得到了Grant R35 NS111604对PC的支持。