分子医学代表。 2020年4月； 21(4): 1819–1832.
黄芪属 多糖通过Wnt/β-catenin信号通路调节上皮-间质转化抑制乳腺癌细胞迁移和侵袭 , 1 , 2 , 2 , 1 , 2 和 三
朔阳 1 青岛大学附属医院危重病医学科，中国山东青岛266003
孙淑琴 2 青岛大学附属医院老年医学科，中国山东青岛，266003
徐万群 2 青岛大学附属医院老年医学科，中国山东青岛，266003
余邦旭 1 青岛大学附属医院危重病医学科，中国山东青岛266003
王桂梅 2 青岛大学附属医院老年医学科，中国山东青岛，266003
王海波 三 青岛大学附属医院乳腺疾病中心科室，中国山东青岛266003
1 青岛大学附属医院危重病医学科，中国山东青岛266003
2 青岛大学附属医院老年医学科，中国山东青岛，266003
三 青岛大学附属医院乳腺疾病中心科室，中国山东青岛266003
2019年6月9日收到； 2020年1月17日验收。
数据可用性声明 本研究中使用和/或分析的数据集可根据合理要求从相应作者处获得。
摘要 上皮-间充质转化（EMT）在肿瘤的迁移和侵袭中起着重要作用。 黄芪属 多糖（APS），是中药的主要成分 膜荚黄芪 ，已被证实具有抗肿瘤作用。 然而，APS在乳腺癌转移和侵袭过程中的作用和机制尚不完全清楚。 本研究探讨APS是否通过调节EMT通路抑制乳腺癌的迁移和侵袭。 MTT试验和Ki67免疫荧光染色试验表明，APS抑制乳腺癌细胞的增殖。 伤口愈合和Transwell Matrigel侵袭试验的结果表明，APS减少了乳腺癌细胞的迁移和侵袭。 蛋白质印迹和免疫荧光分析进一步证明APS对EMT相关分子具有调节作用。 APS降低了蜗牛和波形蛋白的表达水平，但增加了E-cadherin的表达。 APS还下调Wnt1、β-catenin和下游靶点表达。 此外，本研究结果表明，APS通过抑制Wnt/β-catenin信号通路，降低了细胞的增殖，以及EMT介导的细胞迁移和侵袭。 本研究表明APS可能是一种有前途的乳腺癌治疗剂。
关键词： 乳腺癌、转移、上皮间质转化、Wnt/β-catenin途径、， 黄芪属 多糖
介绍 乳腺癌在全世界妇女中流行( 1 )随着每年诊断出大量新病例，尤其是在以前不流行的地区，包括中国、巴西和墨西哥等一些发展中国家，发病率迅速上升( 2 —— 4 ). 乳腺癌的发生是一个复杂的过程，涉及多种因素和多种细胞因子，如IL-6和TGF-β( 5 ). 肿瘤转移和侵袭会导致乳腺癌患者的癌症发展、复发和死亡率，90%的癌症患者因转移而死亡( 6 ). 目前，除化疗外，尚未发现能直接抑制肿瘤在患者体内迁移和侵袭的有效药物治疗。
转移是一个程序化的过程，包括以下步骤：恶性肿瘤细胞从原始位置分离； 通过周围的细胞外基质和基质细胞层侵入邻近组织； 在循环系统中生存； 转移到远处组织； 重新启动增殖能力； 然后发展成新的肿瘤( 7 ). 肿瘤转移表现出一些独特的特征，包括迁移和侵袭； 然而，肿瘤迁移和侵袭的机制尚未完全确定。 最近，人们发现上皮-间充质转化（EMT），即上皮细胞向间充质细胞的转化，可以显著增强癌细胞的运动能力( 8 ).
EMT在组织修复、胚胎发育过程（包括原肠胚形成、体节分离和神经嵴发育）以及一些疾病（例如乳腺癌）中发挥着重要作用( 9 ). EMT被认为发生在肿瘤转移和侵袭之前( 10 ). 在EMT期间，上皮细胞失去细胞粘附并发生细胞骨架改变( 11 ). 在乳腺癌中，EMT与局部浸润和迁移有关，其特征是上皮特性的丧失和间充质特性的获得( 12 ). 以往的研究表明，多种因素可以诱导EMT，包括转化生长因子β（TGF-β）、Wnt、Notch和成纤维细胞生长因子( 13 —— 16 ). 在这些诱导物中，Wnt/β-catenin信号通路（可分为经典和非经典信号通路）越来越受到关注( 17 ). Wnt已被确定为该途径的启动子( 18 )β-catenin作为上游因子影响信号通路下游因子的表达，包括c-Myc和Cyclin D1( 19 ). 先前的研究表明Wnt/β-catenin信号通路可以影响胚胎发育过程，确定细胞极性并调节细胞增殖( 20 —— 23 ). 因此，作为EMT过程中的重要信号通路，Wnt/β-catenin信号通路的功能障碍与许多恶性肿瘤相关，包括结直肠癌和卵巢癌( 24 ). 卡拉姆佐夫 等 ( 25 )证明Wnt信号通路增强了乳腺癌的迁移和侵袭。 林 等 ( 26 )观察到抑制Wnt/β-catenin信号通路的活性通过逆转EMT降低骨肉瘤细胞的侵袭性。 因此，在EMT期间干扰Wnt信号通路的药物可能对乳腺癌有潜在的治疗作用。
黄芪属 多糖（APS）是从人参根中提取的主要生物活性成分之一 膜荚黄芪 ，一种使用了数千年的中药( 27 ). 先前的研究表明，APS具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化和抗炎作用( 28 , 29 ). 李 等 ( 30 )观察到APS刺激免疫反应并抑制乳腺癌细胞生长。 赖 等 ( 31 )此外，APS通过抑制细胞生长、提高脾脏和胸腺指数，在肝癌细胞中显示出抗癌活性。 此外，Li 等 ( 32 )结果表明，APS通过激活JNK信号通路，提高了卵巢癌细胞对顺铂的敏感性。 周 等 ( 33 )同时也证明APS和多糖肽的组合对肺癌具有有效的抑制作用。 然而，很少有研究确定APS对乳腺癌的抗迁移和抗侵袭作用。 本研究的目的是研究APS对乳腺癌细胞迁移和侵袭的影响，并确定其潜在的分子机制。
材料和方法
细胞系和试剂 MCF-7和MDA-MB-231细胞（上海细胞研究所）维持在补充有10%FBS（HyClone；GE Healthcare Life Sciences）和1%青霉素/链霉素的DMEM（HyClone；GE Healthcare Life Sciences）中。 细胞在37°C下与5%CO孵育 2 两种细胞系均用于随后的所有实验。 将MCF-7和MDA-MB-231细胞与APS（800µg/ml）和LiCl（10 mM，Sigma-Aldrich；Merck KGaA）培养24 h，以进一步研究APS的抑制作用。
细胞增殖试验 细胞被电镀（5×10 三 细胞/孔）放入96周板中培养过夜。 根据以前的文献( 32 , 34 , 35 )在37°C下用0、25、50、100、200、400、800或1600µg/ml APS（纯度>98%；天津Cinorc Pharmaceutical Co.，Ltd.）处理细胞24小时。随后，向每个孔中添加10µl MTT（Sigma-Aldrich；Merck KGaA）4小时。MTT孵育后，移除培养基，并将formazan晶体溶解在150µl DMSO中。 使用平板阅读器在568 nm波长下分析增殖。
伤口愈合分析 电池（5×10 5 细胞/孔）置于6孔板中，并在37°C下在含有10%FBS的DMEM中培养。 当细胞达到100%汇合时，使用10-µl移液管尖端在微孔中心划一道划痕，并使用PBS去除移位的细胞。 在用APS（0、200、400或800µg/ml）处理后，将细胞在无血清DMEM中培养24 h。在APS处理后0和24 h，使用倒置光学显微镜（放大倍数×100）观察伤口。 测量与对照组比较的相对面积。
Transwell Matrigel侵袭试验 使用Transwell板（24孔插入物；直径6 mm；孔径8µm；康宁生命科学公司）评估APS对乳腺癌细胞侵袭的影响。 将细胞重新悬浮并稀释至2×10的浓度 5 无血清DMEM中的细胞/ml。 在37°C下用Matrigel预涂Transwell膜4小时。 将细胞和不同浓度的APS（0、200、400或800µg/ml）添加到Transwell板的上室。 将完整培养基（补充有10%FPS和1%青霉素/链霉素的DMEM）置于Transwell板的下室中。 培养24小时后，取下Transwell膜并使用PBS仔细清洁。随后，在室温下用结晶紫对入侵细胞染色20分钟。用倒置光显微镜（放大倍数×200）对染色细胞进行计数。
RNA提取和逆转录定量PCR（RT-qPCR） 用不同浓度的APS（0、200、400或800µg/ml）处理细胞24小时。使用TRIzol提取总RNA ® 试剂（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc.），并使用分光光度计在260/280nm的波长下测量RNA的浓度。 根据制造商的方案和ABI 7500实时PCR系统（Applied Biosystems；Thermo Fisher Scientific，Inc.），使用逆转录试剂盒和SYBR Green Master mix（Vazyme，中国）进行RT-qPCR。 热循环条件为：95℃下初始变性10 min，然后在95℃下40次变性30 s，在60℃下退火和伸长率30 s -ΔΔCq 方法用于数据分析( 36 ). qPCR采用以下引物对：GAPDH正向、5′-TCAAGAGGTGGTAAGCAGG-3′和反向、5′-TCAAAGGTGGAGGGT-3′； Wnt1正向，5′-CGCCCTGTAACAGCTCG-3′和反向，5′-CGTGGCAGCACGGAAG-3′； β-catenin正向，5′-CCAAGTGGGTGTATAGAGG-3′，反向，5′-AGTCCATAGTGAAGGCGAAC-3′； E-cadherin正向，5′-CGTAGTGACGAATGTGG-3′，反向，5′-CTGGGCAGTGGAGTGTGA-3′； 蜗牛正向，5′-ATGCACATCCGAGCCACA-3′和反向，5′-TGACATCTGAGTGGGTCG-3′； 波形蛋白正向，5′-TGAGTACGGACAGGTGCAG-3′，反向，5′-TAGCAGCTCAACGGCAAAGTTC-3′； c-Myc正向，5′-AACACAACGTCTGGAGC-3′和反向，5′-GCACAGAGAGTTCCGTAGCTG-3′； 和细胞周期蛋白D1正向，5′-CGACTACAGGGGAGTTTTG-3′和反向，5′-AGGAGTTGGCATCGGGGT-3′。 mRNA水平标准化为内部参考基因GAPDH。
蛋白质印迹分析 用0、200、400或800µg/ml APS处理细胞24小时。根据制造商的协议，使用核蛋白和细胞质蛋白提取试剂盒（Beyotime生物技术研究所）从细胞中提取核蛋白和胞质蛋白。 BCA法用于蛋白质测定。 用SDS-PAGE在10%凝胶上分离蛋白质（每道40µg），并转移到PVDF膜上。 随后，在室温下用脱脂牛奶封闭膜2小时。然后在4°C下用针对以下主要抗体培养膜过夜：Vimentin（Cell Signaling Technology，Inc.，cat.no.5741，稀释度1:1000）、Snail（Cell信号技术，Inc.，cat.no.3879，稀释度1:000）、， E-cadherin（BD Biosciences，分类号610812，稀释度1:1000）、β-catenin（Cell Signaling Technology，Inc.，分类号8480，稀释度1:1000）、Wnt1（Santa Cruz Biotechnology，Inc.；分类号SC-514531，稀释度:1000）、c-Myc（Santa Cruz Bietchnologies，Inc.，类别号SC-40，稀释度：1:1000），Cyclin D1。 SC-8396，稀释度1:1000），组蛋白H3（Bioworld Technology，Inc.，分类号BS1405，稀释度1-1000）和GAPDH（Santa Cruz Biotechnology，Inc.），分类号SC-47724，稀释度1:1000）。 初步培养后，在室温下用辣根过氧化物酶结合二级抗体（OriGene Technologies，Inc.，目录号TA130024和TA130005，稀释1:5000）培养膜2小时。 使用增强化学发光（ECL）试剂盒（Applygen Technologies Inc.）观察免疫反应带。 组蛋白H3和GAPDH用作负荷对照。 使用Glyko BandScan 5.0软件（Glyko.）对摄影密度进行量化和分析。
免疫荧光染色 将60-80%汇合处的细胞接种到4室培养皿中，并与不同浓度的APS（0、200、400或800µg/ml）孵育24小时。随后，在室温下用4%多聚甲醛固定细胞15分钟。然后用5%正常山羊血清（Boster Biological Technology）封闭细胞 随后，将细胞与抗Ki67（Abcam，ab15580，稀释度1:200）和抗E-钙粘蛋白（BD Biosciences，目录号610812，稀释度1:1000）一级抗体在4℃孵育过夜。 在初步培养后，用荧光标记的二级抗体（Boster Biological Technology，分类号BA1032，稀释度1:100）在37°C下培养细胞30分钟。然后用DAPI在37°C下对细胞进行5分钟的复染。使用生物荧光显微镜（放大倍数×400）观察免疫荧光染色 图像通过Image-Pro Plus 6.0（媒体控制论）进行分析。
统计分析 数据表示为≥3次重复实验的平均值±标准偏差。 使用SPSS软件（版本22.0；IBM Corp.）进行统计分析。 采用单因素方差分析（ANOVA）和Dunnett或Tukey的事后检验对数据进行分析。 P<0.05被认为表明存在统计学上的显著差异。
结果
APS抑制乳腺癌细胞增殖 MTT分析表明，0、25、50和100µg/ml APS处理的细胞之间，MCF-7和MDA-MB-231细胞的增殖没有显著差异； 然而，与未治疗组相比，APS浓度≥400µg/ml显著抑制MCF-7和MDA-MB-231细胞的增殖( ). 与未处理组相比，400、800和1600µg/ml APS处理的MCF-7细胞的增殖率分别显著降低33.6%、44.7%和66.0%( ). 同样，400、800和1600µg/ml APS处理的MDA-MB-231细胞的增殖率与未处理组相比分别显著降低34.0%、40.9%和76.9%( ). IC 50 24小时时，MCF-7细胞的APS值为945µg/ml，MDA-MB-231细胞为817µg/ml。
APS对乳腺癌细胞增殖的影响。 使用MTT法测定（A）MCF-7和（B）MDA-MB-231细胞的增殖** 与对照组相比，P<0.01。 APS、， 黄芪属 多糖。
APS对细胞增殖的影响也使用Ki67免疫荧光分析进行评估。 随着APS浓度的增加，Ki67阳性细胞百分比下降( ). 与未治疗组相比，最高APS浓度（1600µg/ml）对MCF-7和MDA-MB-231细胞的抗增殖作用最显著。 因此，与未经处理的组相比，APS浓度较低（0、200、400和800µg/ml）会降低MCF-7和MDA-MB-231细胞的增殖，因此，我们选择这些浓度进行后续实验( ).
Ki67的免疫荧光染色。 （A） 使用抗Ki67抗体对MCF-7和MDA-MB-231细胞进行免疫荧光染色，并（B）定量。 放大倍数，×400** 与对照组相比，P<0.01。 APS、， 黄芪属 多糖。
APS抑制乳腺癌细胞迁移 由于EMT与癌细胞迁移密切相关，因此进行了伤口愈合试验以评估APS对细胞迁移的影响( ). 与对照组相比，200、400和800µg/ml APS处理24 h后，MCF-7细胞的迁移潜能分别降低了32.2%、44.6%和63.7%( ). 在MDA-MB-231细胞中，与对照组相比，200、400和800µg/ml APS处理24 h后，迁移电位分别降低19.9%、43.1和63.8%( ).
APS抑制乳腺癌细胞的迁移。 （A） 刮除MCF-7和MDA-MB-231细胞，然后用不同浓度的APS孵育。 在添加APS后的0和24小时采集图像。 放大倍数，×100。 （B） 细胞迁移的定量分析，表示为对照组的百分比（0µg/ml）** 与对照组相比，P<0.01。 APS、， 黄芪属 多糖。
APS抑制乳腺癌细胞侵袭 侵袭性是与EMT密切相关的一个重要特征； 因此，进行Transwell Matrigel分析以评估APS是否抑制乳腺癌细胞的侵袭( ). 结果表明，与对照组相比，用200、400和800µg/ml APS处理后，侵袭性MCF-7细胞的数量分别减少了13.1%、26.4%和52.9%( ). 与对照组相比，200、400和800µg/ml APS治疗后，侵袭性MDA-MB-231细胞的数量也分别减少了18.0、52.0和72.7%( ). 结果表明，APS以剂量依赖的方式抑制细胞的侵袭。
APS抑制乳腺癌细胞的侵袭。 （A） 用不同浓度的APS处理MCF-7和MDA-MB-231细胞24小时。使用Transwell Matrigel侵袭试验测定侵袭能力。 放大倍数，×200。 （B） 细胞侵袭的定量分析，以对照组的百分比表示（0µg/ml）** 与对照组相比，P<0.01。 APS、， 黄芪属 多糖。
APS降低EMT相关分子的表达 EMT与肿瘤转移密切相关。 为了进一步研究EMT是否参与APS对乳腺癌细胞迁移和侵袭的抑制作用，分别采用RT-qPCR和western blot分析检测蜗牛、波形蛋白和E-cadherin的mRNA和蛋白表达水平( ). 与对照组相比，APS（400和800µg/ml）显著降低MCF-7和MDA-MB-231细胞中蜗牛的mRNA表达水平( ). 此外，与对照组相比，经200、400和800µg/ml APS处理的MCF-7细胞显示蜗牛蛋白表达显著降低( ). 同样，与对照组相比，200、400和800µg/ml APS处理的MDA-MB-231细胞中蜗牛蛋白表达分别减少19.5%、36.6%和54.2%( ). 与对照组相比，APS（400和800µg/ml）也显著降低了MCF-7和MDA-MB-231细胞中波形蛋白的mRNA表达( ). 在200、400和800µg/ml APS处理的MCF-7细胞中，与对照组相比，波形蛋白蛋白表达分别显著降低15.0%、36.0%和51.8%( ). 与对照组相比，400和800µg/ml APS治疗后MDA-MB-231细胞的波形蛋白蛋白表达水平也显著降低( ).
APS改变Wnt1、β-catenin和EMT相关分子的表达。 采用逆转录定量PCR评估（A）蜗牛、波形蛋白、E-cadherin、（B）Wnt1和β-catenin的mRNA表达水平。 （C） Western blotting检测Wnt、β-catenin和EMT相关分子的蛋白表达水平。 定量（D）蜗牛、波形蛋白、E-cadherin、（E）Wnt1和β-catenin的蛋白表达水平* 与相应对照组相比，P<0.05和**P<0.01。 APS、， 黄芪属 多糖； EMT，上皮-间充质转化。
随着APS浓度的增加，MCF-7和MDA-MB-231细胞中E-cadherin的蛋白水平增加。 与对照组相比，400和800µg/ml APS处理的MCF-7和MDA-MB-231细胞中E-cadherin的mRNA表达显著增加( ). 与对照组相比，200、400和800µg/ml APS处理的MCF-7细胞中E-钙粘蛋白的蛋白水平显著增加( ). 同样，400和800µg/ml APS处理的MDA-MB-231细胞中E-cadherin蛋白水平分别显著增加2.33倍和3.40倍( ). 免疫荧光染色也用于评估E-cadherin的表达( ). 与对照组相比，400和800µg/ml APS处理的MCF-7和MDA-MB-231细胞中E-cadherin染色的相对荧光显著增强( ).
E-cadherin免疫荧光染色。（A）使用抗E-cadherin抗体对MCF-7和MDA-MB-231细胞进行免疫荧光染色，（B）定量。 放大倍数，×400.*与对照组相比，P<0.05和**P<0.01。 APS、， 黄芪属 多糖。
APS通过抑制Wnt/β-catenin信号通路的活性来抑制EMT Wnt信号通路是EMT中一个重要的经典通路( 17 ). 本研究探讨了APS是否通过抑制Wnt/β-catenin信号通路的活性来发挥其抗肿瘤作用。 Wnt1是信号通路的激活剂之一； 因此，分别用RT-qPCR和western blotting检测Wnt1的mRNA和蛋白表达水平。 与对照组相比，400和800µg/ml APS处理的MCF-7和MDA-MB-231细胞中Wnt1的mRNA表达水平显著降低( ). 与对照组相比，400和800µg/ml APS处理的MCF-7和MDA-MB-231细胞中Wnt1蛋白表达也显著降低( ). β-catenin是激活Wnt/β-catening信号通路上游和下游因子的关键因子( 19 ). 与对照组相比，400和800µg/ml APS处理的MCF-7和MDA-MB-231细胞中β-catenin的mRNA和蛋白表达水平也显著降低( ).
β-连环蛋白在细胞质中的积累及其向细胞核的移位对β-连环素靶基因转录的激活至关重要( 18 ). 与对照组相比，APS（400和800µg/ml）治疗显著降低了细胞质和核β-连环蛋白的蛋白表达水平( ). 在200、400和800µg/ml APS处理的MCF-7细胞中，与对照组相比，细胞质β-catenin的表达分别减少13.8%、33.4%和57.1%( ). 在200、400和800µg/ml APS处理的MDA-MB-231细胞中，与对照组相比，细胞质β-catenin的表达分别减少21.6%、42.5%和56.1%( ). 在用400和800µg/ml APS处理的MCF-7和MDA-MD-231细胞中，与对照组相比，细胞核β-连环蛋白的表达显著降低( ).
APS降低细胞质和细胞核中β-catenin的表达。 细胞质和核β-连环蛋白的蛋白表达水平（A）通过western blotting测定，（B）定量* 与对照组相比，P<0.05和**P<0.01。 APS、， 黄芪属 多糖。
细胞周期蛋白D1和c-Myc是Wnt/β-catenin信号通路的下游因子( 18 ). 与对照组相比，400和800µg/ml APS细胞处理的MCF-7和MDA-MB-231细胞中c-Myc的mRNA表达显著降低( ). 结果还表明，与对照组相比，200、400和800µg/ml APS处理的MCF-7细胞中c-Myc的蛋白表达分别显著降低12.1%、31.4%和44.3%( ). 与对照组相比，400和800µg/ml APS处理MDA-MB-231细胞后，c-Myc的蛋白表达水平分别显著降低30.2%和52.3%( ). 此外，与对照组相比，400和800µg/ml APS处理的MCF-7和MDA-MB-231细胞中Cyclin D1的mRNA和蛋白表达水平显著降低( ).
APS降低c-Myc和Cyclin D1的表达。 （A） 使用逆转录定量PCR评估c-Myc和Cyclin D1的mRNA水平。 细胞周期蛋白D1和c-Myc的蛋白表达水平通过western blotting（B）测定，（c）定量* 与对照组相比，P<0.05和**P<0.01。 APS、， 黄芪属 多糖。
氯化锂（LiCl）逆转APS对Wnt/β-catenin信号通路的抑制作用 本研究使用Wnt/β-catenin信号通路激动剂LiCl进一步研究APS的抑制作用。 将MCF-7和MDA-MB-231细胞与APS（800µg/ml）和LiCl（10 mM）培养24 h。与对照组相比，APS处理组的β-catenin、Snail、vimentin、c-Myc和Cyclin D1的蛋白表达水平显著降低，E-cadherin的蛋白水平显著升高( ). 然而，LiCl处理逆转了APS诱导的对蛋白质表达的影响( ). 结果进一步表明，APS抑制作用的机制涉及Wnt/β-catenin信号通路。
氯化锂逆转APS对Wnt/β-catenin信号通路的抑制作用。 用LiCl（10 mM）和800µg/ml APS培养MCF-7和MDA-MB-231细胞。 β-catenin、蜗牛、波形蛋白、E-cadherin、c-Myc和Cyclin D1的蛋白表达水平（A）通过western blotting测定，（B）定量* 与相应对照组相比，P<0.05和**P<0.01； # P<0.05和 ## 与APS组相比，P<0.01。 氯化锂、氯化锂； APS、， 黄芪属 多糖； CON，控制。
讨论 肿瘤转移和侵袭是乳腺癌患者死亡率增加的重要原因( 6 ). EMT可以显著增强包括乳腺癌细胞在内的癌细胞的迁移能力，从而导致肿瘤的迁移和侵袭( 9 ); 因此，靶向EMT通路的药物可能会降低乳腺癌患者的死亡率( 37 ). 近年来，许多研究报告称，中药具有显著的抗癌作用( 38 —— 40 ). AM是补气配方的重要组成部分，在中国广泛使用( 41 )AM的主要提取物是APS。 APS主要由α-1,4组成-( 1 , 6 )-葡聚糖、鼠李糖-半乳糖醛酸多糖I、阿拉伯半乳糖多糖和阿拉伯半乳蛋白多糖( 42 ). APS已被证明对多种疾病具有治疗作用，包括多种肿瘤疾病，如肝细胞癌和肺癌( 28 —— 33 , 43 ). 然而，只有少数研究报告了APS对乳腺癌的影响，这些研究主要集中于APS对乳癌细胞增殖和免疫调节的影响( 30 , 44 ). APS对乳腺癌细胞的抗迁移和抗侵袭作用以及具体机制尚不清楚。 本研究结果表明，APS显著降低乳腺癌细胞的迁移和侵袭 在体外 此外，结果表明APS作用的机制与EMT密切相关，其机制是通过下调Wnt/β-catenin信号通路的活性。 因此，本研究可能为进一步研究APS活性成分对乳腺癌的影响提供理论基础。
MCF-7和MDA-MB-231细胞在细胞形态、雌激素受体表达、迁移和侵袭潜能方面差异很大( 45 ). MDA-MB-231细胞增殖迅速，容易发生肿瘤( 45 )而MCF-7细胞是雌激素受体阳性细胞系。 与MDA-MB-231细胞相比，MCF-7细胞的迁移和侵袭较弱； 然而，以往的研究表明，在雌激素和Wnt/β-catenin信号通路相关细胞因子等多种分子的作用下，MCF-7细胞的迁移和侵袭能力显著增强( 46 , 47 ). 许多研究使用上述两种细胞系来研究乳腺癌细胞的迁移和侵袭； 因此，本研究选择了这两种细胞系( 48 —— 50 ). 杨 等 ( 51 )表明APS通过免疫调节部分抑制肝癌细胞的增殖。 在本研究中，MTT试验和Ki67免疫染色试验表明，APS以剂量依赖性方式降低乳腺癌细胞的增殖。 肿瘤的迁移和侵袭包括以下步骤：肿瘤细胞的均匀粘附减少； 从肿瘤的原始部位脱离； 粘附细胞外基质（ECM）； 降低ECM； 穿透ECM周围的血管； 并进入流通( 52 ). 在本研究中，通过伤口愈合试验测定，APS治疗组的迁移细胞数量与未治疗组相比显著减少。 目前的结果表明，APS抑制乳腺癌细胞的迁移。 此外，Transwell Matrigel分析的结果进一步表明，与未经APS处理的组相比，APS处理组的侵袭细胞数量减少。 目前的结果表明，APS可能抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭。
EMT是细胞生长、组织修复和器官纤维化的重要机制( 9 ); 然而，它也与肿瘤的侵袭和迁移密切相关( 53 ). 先前的研究表明，通过EMT过程，细胞获得侵袭和抗凋亡能力( 10 —— 12 , 54 ). EMT的特征性变化包括细胞间粘附减少和细胞极性丧失( 55 ). 众所周知，Wnt信号通路可以诱导EMT，从而导致细胞侵袭和迁移( 56 , 57 )之前的一些研究表明Wnt/β-catenin信号通路促进乳腺癌进展( 58 —— 60 ). Wnt信号通路由两种不同的细胞内信号通路组成，即典型和非典型通路( 61 —— 63 ). 经典途径涉及由Wnt1、Wnt3a和Wnt8触发的β-catenin的激活。 然而，在非规范途径中，Wnt蛋白可以触发其他效应器，包括JNK( 64 —— 66 ). Wnt1是Wnt/β-catenin途径的激活剂之一( 18 ). 在Wnt1激活后，β-catenin转位到细胞核以调节下游基因的转录，包括蜗牛、波形蛋白和E-cadherin( 57 ). 蜗牛可以诱导EMT并增加细胞运动以促进细胞分化，有报道称蜗牛在肿瘤增殖和转移过程中表达异常( 67 ). 波形蛋白是肿瘤相关信号通路的下游分子，在恶性转化过程中对EMT很重要( 68 ). 以前的研究表明波形蛋白可以调节细胞间粘附，促进肿瘤的迁移和侵袭( 69 , 70 ). 此外，E-cadherin参与上皮形成的调节，维持体内平衡并形成粘附连接。 E-cadherin也参与上皮细胞极化片状物的形成，E-cadherin的下调可导致细胞粘附和聚集减少( 71 ). 研究发现，由于乳腺癌期间启动子甲基化增加，E-钙粘蛋白在EMT期间呈下降趋势( 72 , 73 ). 本研究评估了EMT相关分子的表达，包括Wnt1、β-catenin、Snail、vimentin和E-cadherin( 72 , 73 )结果表明，MCF-7和MDA-MB-231细胞中Wnt1、β-catenin、Snail和vimentin表达增加，而E-cadherin表达降低。 然而，APS治疗显著下调Wnt1、vimentin、Snail和β-catenin的表达，并以剂量依赖的方式上调E-cadherin的表达。 β-catenin的细胞内定位对下游靶基因的激活至关重要( 57 ); 因此，测定了APS处理后细胞质和细胞核β-catenin的表达水平。 目前的结果表明，APS以剂量依赖的方式降低了细胞质和核β-连环蛋白的表达水平。 此外，β-catenin激活后会产生Cyclin D1和c-Myc( 19 ). c-Myc是一种核蛋白转录因子，与与增殖、分化和凋亡等多种细胞过程相关的基因激活有关。 c-Myc对细胞周期调节和细胞恶性转化也很重要( 74 ). 细胞周期蛋白D1是一种癌基因，可调节细胞周期功能，其异常表达可破坏细胞周期，促进肿瘤发生( 75 , 76 ). 本研究结果表明，APS以剂量依赖性方式降低c-Myc和Cyclin D1的转录。 然而，需要进一步研究APS在蛋白质降解受到抑制时的作用。
研究结果还表明，Wnt信号通路的激动剂LiCl部分逆转了APS对乳腺癌细胞的抑制作用。 因此，本研究结果提示APS可能通过Wnt/β-catenin信号通路调节乳腺癌的EMT。 总之，本研究结果表明Wnt/β-catenin信号通路可能是抑制乳腺癌细胞迁移和侵袭的有效靶点。
总之，本研究表明APS显著降低乳腺癌细胞的迁移和侵袭 在体外 通过抑制EMT和调节Wnt/β-catenin信号通路成分的表达。 本研究确定了APS的一种新机制，并证明APS可能是一种潜在的乳腺癌治疗剂。 APS在其他EMT相关通路中的作用，包括TGF-β信号通路，以及APS的哪个成分显示抗肿瘤作用，需要进一步研究。
致谢 作者感谢王启燕女士（北京中医药大学生命科学学院）编辑了这份手稿。
资金 本研究得到了青岛市博士后研究项目和山东省自然科学基金（批准号：ZR2017BH067）的资助。
数据和材料的可用性 本研究中使用和/或分析的数据集可根据合理要求从相应作者处获得。
作者的贡献 SY和HW构思并设计了该研究。 SY起草了手稿。 SY和WX进行了实验。 SS、BY和GW进行了统计分析。 HW和BY修改了手稿。 所有作者阅读并批准了将要出版的最终手稿。 所有作者都同意对作品负责，确保与作品任何部分完整性相关的问题得到适当调查和解决。
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