黄芩素铜对脱氧雪腐镰刀菌素激发仔猪抗氧化和肠道保护作用的评价

摘要

1.简介

脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）是一种主要由禾谷镰刀菌和秆镰孢因其能引起动物恶心和呕吐而得名[1,2]. DON污染在世界范围内普遍存在，在所有真菌毒素中，DON的检出率和超标率最高[三——6]. DON促进氧化应激，改变肠道形态，影响营养吸收。此外，喂食DON污染食物的猪会出现生长迟缓、体重减轻、厌食和其他毒性症状[7——9]. 一些研究还指出，DON可以影响机体的免疫调节机制，并且可以诱导NF的激活-κB通路并促进一系列细胞因子在蛋白质和mRNA水平的上调。此外，DON具有生殖遗传毒性，可降低胎儿质量，增加胎儿死亡率。以前的一项研究表明，DON会对猪的肠绒毛上皮细胞造成形态学损伤，导致摄入量减少甚至拒食，并破坏抗氧化能力[10,11].

黄芩苷铜（BCU）是黄芩素和铜离子的复合物。黄芩苷是从黄芩它是一种黄酮类化合物。黄芩苷能清除自由基，避免氧化损伤，具有抗炎和抗癌作用，并促进细胞和体液免疫[12——14]. 先前的研究表明，黄芩苷很容易与锌螯合²⁺或铜²⁺形成金属螯合物，其清除氧自由基的作用比黄芩苷单体更强[15]. Li等人表明，黄芩素铜通过下调PI3K/Akt/mTOR信号通路诱导HepG2细胞凋亡，黄芩素铜降低肝脏相对指数，增加肝脏中SOD含量[16]. 在急性毒性试验中，Liu等人表明BCU不仅对小鼠无毒，而且具有良好的抗菌和抗肿瘤活性[17].

基于BCU的功能，我们假设在饮食中添加BCU可以减轻肠道损伤，提高抗氧化能力，并改善生长性能。本实验的目的是利用DON诱导的氧化应激仔猪模型，研究BCU对肠道抗氧化损伤的影响。

2.材料和方法

3.结果

3.2. 血清抗氧化能力

作为图1结果表明，尽管四组之间的T-SOD活性没有差异，但DON组的Mn-SOD活性显著低于Con组(第页 < 0.05），且DBCU组的Mn-SOD活性与Con组没有差异。与Con组仔猪相比，喂食BCU仔猪的GSH活性增加(第页< 0.05). DON组和Con组的GSH活性无差异，但DBCU组的谷胱甘肽活性显著高于Con组(第页< 0.05). DON组和BCU组NO含量与Con组无显著差异，但DBCU组NO含量显著低于Con组(第页< 0.05).

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图1

BCU对DON攻击仔猪血清抗氧化能力的影响(n个= 7). 数据表示为平均值±SEM；^{A、 B类}用于表示统计上的显著差异(第页< 0.05). Con：基础饮食；DON:4 mg/kg脱氧雪腐镰刀菌烯醇基础日粮；BCU:5 g/kg基础日粮黄芩素铜；DBCU:4 mg/kg脱氧雪腐镰刀菌烯醇+5 g/kg黄芩苷铜基础日粮。

3.3. 肠道形态学

如所示图2，与Con组相比，DON和BCU组的空肠绒毛高度没有降低，但DBCU组的空肠绒毛高度与Con组相比显著降低(第页< 0.05). Con、DON和DBCU组之间的窝深没有显著差异，而喂食补充BCU的仔猪的空肠窝深显著增加(第页< 0.05).

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图2

BCU对DON攻击仔猪空肠形态的影响(n个= 7). 数据表示为平均值±SEM；^{A、 B类}用于表示统计上的显著差异(第页< 0.05). Con：基础饮食；DON:4 mg/kg脱氧雪腐镰刀菌烯醇基础日粮；BCU:5 g/kg基础日粮黄芩素铜；DBCU:4 mg/kg脱氧雪腐镰刀菌烯醇+5 g/kg黄芩苷铜基础日粮。

3.4. 氧化应激相关基因在肝脏中的表达

DON可引起体内氧化应激，而肝脏是一个具有抗氧化和解毒功能的器官，因此我们检测了肝脏中抗氧化基因的mRNA表达。如所示图3与Con组仔猪相比，喂食添加DON的日粮的仔猪的P70S6K、4E-BP1和HSP70 mRNA表达水平显著增加(第页< 0.05); 然而，DBCU组的P70S6K mRNA表达显著低于Con组(第页< 0.05). DBCU组的4E-BP1和HSP70 mRNA表达水平与Con组无差异。此外，DBCU组HO-1 mRNA的表达显著高于Con组(第页< 0.05). BCU组的P70S6K mRNA表达低于Con组，AMPKα2 mRNA表达高于Con组(第页< 0.05). 与DBCU组相比，DON组的P70S6K、4E-BP1和HSP70 mRNA表达水平增加(第页<0.05），以及HO-1和AMPKαDON组2mRNA表达水平下降(第页< 0.05).

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图3

BCU对DON攻击仔猪肝脏氧化应激相关基因的影响(n个= 7). 数据表示为平均值±SEM；^A–C用于表示统计上的显著差异(第页< 0.05). Con：基础饮食；DON:4 mg/kg脱氧雪腐镰刀菌烯醇基础日粮；BCU:5 g/kg基础日粮黄芩素铜；DBCU:4 mg/kg脱氧雪腐镰刀菌烯醇+5 g/kg黄芩苷铜基础日粮。

3.5. 肠道样品的西方印迹法

DON主要被肠道吸收，因此我们研究了DON是否影响抗氧化蛋白的表达。如所示图4在空肠中，与Con、BCU和DBCU组仔猪相比，DON组仔猪HO-1表达显著增加。如所示图5在回肠中，与Con组仔猪相比，DON组仔猪的p-Nrf2、p-NF蛋白表达水平显著增加-κB、 和HO-1(第页<0.05），而饲喂DON和BCU补充日粮的仔猪表现出p-Nrf2和p-NF降低-κ与DON组相比，B表达水平(第页< 0.05). p-Nrf2、p-NF无差异-κB、 Con组和BZN组之间HO-1的表达。

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图4

BCU对DON攻击仔猪空肠相对蛋白质水平的影响。数据表示为平均值±SEM；^A–C用于表示统计上的显著差异(第页< 0.05). Con：基础饮食；DON:4 mg/kg脱氧雪腐镰刀菌烯醇基础日粮；BCU:5 g/kg基础日粮黄芩素铜；DBCU:4 mg/kg脱氧雪腐镰刀菌烯醇+5 g/kg黄芩苷铜基础日粮。

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图5

BCU对DON攻击仔猪回肠相对蛋白质水平的影响。数据表示为平均值±SEM；^A–C用于表示统计上的显著差异(第页< 0.01). Con：基础饮食；DON:4 mg/kg脱氧雪腐镰刀菌烯醇基础日粮；BCU:5 g/kg基础日粮黄芩素铜；DBCU:4 mg/kg脱氧雪腐镰刀菌烯醇+5 g/kg黄芩苷铜基础日粮。

3.6. 血清游离氨基酸

图6显示了结果。饲喂DON补充日粮的仔猪血清中Ser、Asx、Glu、Met、Ile和Leu含量显著降低(第页<0.05），而喂食添加BCU的饲料的仔猪的Asx、Glu、Met和Pro含量显著降低(第页< 0.05). 与DON组相比，DBCU组的Asx含量明显降低，DBCU组的Ile、Arg、Leu、Tyr和Lys含量明显增加(第页< 0.05).

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图6

BCU对DON攻击仔猪血清游离氨基酸的影响。数据表示为平均值±SEM；^A–C用于表示统计上的显著差异(第页< 0.05). Con：基础饮食；DON:4 mg/kg脱氧雪腐镰刀菌烯醇基础日粮；BCU:5 g/kg基础日粮黄芩素铜，DBCU:4 mg/kg脱氧雪腐镰刀菌烯醇+5 g/kg基础饮食黄芩素铜。

3.7. 肠道营养消化吸收相关基因表达

如所示图7与对照组相比，添加5 g/kg BCU的日粮降低了食糜中麦芽糖酶的活性(第页<0.05），但BCU组和DBCU组的麦芽糖酶活性没有明显差异。在空肠中，DBCU组的麦芽糖酶mRNA水平显著高于其他组(第页< 0.05). 在回肠中，DON组的氨肽酶N和麦芽糖酶mRNA水平显著高于Con组(第页<0.05），DBCU组的氨肽酶N mRNA水平显著低于Con组和DON组(第页< 0.05). BCU组的氨肽酶N和麦芽糖酶mRNA水平与Con组无显著差异。

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图7

BCU对DON攻击仔猪肠道消化酶相关基因的影响(n个= 7). （a） 麦芽糖酶；（b） 空肠；（c） 回肠。数据表示为平均值±SEM；^A–C用于表示统计上的显著差异(第页< 0.05). Con：基础饮食；DON:4 mg/kg脱氧雪腐镰刀菌烯醇基础日粮；BCU:5 g/kg基础日粮黄芩素铜；DBCU：基础日粮中4 mg/kg脱氧雪腐镰刀菌烯醇+5 g/kg黄芩苷铜。

如所示图8在空肠中，DON组的TasR3和GPR41 mRNA水平显著高于其他三组(第页<0.05），而Con、BCU和DBCU组之间的TasR3和GPR41 mRNA水平没有显著差异。在回肠中，与Con组相比，GPR40 mRNA的表达没有差异，而DBCU组GPR40的mRNA水平显著降低(第页< 0.05).

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图8

BCU对DON攻击仔猪肠道营养敏感基因的影响(n个= 7). （a） 空肠；（b） 回肠。数据表示为平均值±SEM；^A–C用于表示统计上的显著差异(第页< 0.05). Con：基础饮食；DON:4 mg/kg脱氧雪腐镰刀菌烯醇基础日粮；BCU:5 g/kg基础日粮黄芩素铜；DBCU:4 mg/kg脱氧雪腐镰刀菌烯醇+5 g/kg黄芩苷铜基础日粮。

作为图9结果表明，DON组空肠ZNT5 mRNA水平显著高于Con组(第页< 0.05). DBCU组ZNT5 mRNA水平显著低于DON组(第页<0.05），而DBCU组的ZIP4和MT mRNA水平显著高于DON组(第页< 0.05). 在回肠中，DON组的MT mRNA水平显著低于Con组。DBCU组ZNT5 mRNA水平显著高于Con组，MT mRNA水平明显高于DON组，DMT1 mRNA水平也显著低于Con组和DON组。BCU组ZNT5 mRNA水平显著高于Con组，而DMT1 mRNA水平则显著低于Con组。

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图9

BCU对DON攻击仔猪肠道锌转运蛋白基因的影响(n个= 7). 数据表示为平均值±SEM；^{A、 B}用于表示统计上的显著差异(第页< 0.05). Con：基础饮食；DON:4 mg/kg脱氧雪腐镰刀菌烯醇基础日粮；BCU:5 g/kg基础日粮黄芩素铜；DBCU:4 mg/kg脱氧雪腐镰刀菌烯醇+5 g/kg黄芩苷铜基础日粮。

4.讨论

粮食中DON的污染程度是镰刀菌毒素中最高的，对动物健康构成很大威胁。先前的研究表明，脱氧雪腐镰刀菌烯醇减少或破坏了喂食，并导致呕吐和体重减轻。肖等人通过30天的喂养试验发现，DON显著降低了断奶仔猪的ADG和ADFI[8]. Li等人还表明，喂食DON污染饲料的仔猪的生长性能显著下降[32]. Goyarts等人发现DON并没有改变生长猪的饲料增益比，而Bergsjo等人表明，生长猪食用DON污染的饲料会降低饲料利用效率[33,34]. 黄芩苷是一种黄酮类化合物。一些研究还表明，饮食中添加类黄酮可以改善氧化应激，提高肉鸡和猪的生长性能[35——38]. 目前的研究结果表明，在4mg/kg日粮显著降低了ADFI和ADG，对F/G没有影响。然而，与Con组相比，添加BCU和DON的日粮并没有改变ADFI及ADG，这意味着添加BCU可以提高脱氧雪腐镰刀菌烯醇激发仔猪的生长性能。也有研究表明，小鼠口服DON会引起肝脏炎症反应和脾脏免疫功能障碍[39,40]. 不同的研究表明，DON对相对器官重量的影响不同[41,42]. 在本研究中，DBCU组的相对肝脏重量与DON组相比明显降低，DBCUs组的相对脾脏重量趋于高于DON组。这一结果可能归因于黄芩苷对肝脏和脾脏的保护作用，如先前的研究所示[16,43,44].

以往的研究表明，脱氧雪腐镰刀菌烯醇的毒理机制是：DON与真核细胞核糖体上的80S亚基结合，激活MAPK通路，产生氧化应激反应，抑制DNA和蛋白质的合成，从而产生细胞毒性和免疫毒性[45——48]. 相比之下，黄芩苷是一种黄酮类化合物，具有良好的抗氧化作用。以前的研究报道，一方面，黄酮类化合物可以影响酶的活性，包括增强抗氧化活性和抑制氧化酶活性；另一方面，黄酮类化合物直接去除活性氧物种[49——52]. 为了了解DON和BCU对仔猪抗氧化能力的影响，我们首先测量了仔猪的血清抗氧化指数。在目前的研究中，膳食中添加DON可降低血清中的Mn-SOD活性，BCU可部分缓解DON对Mn-SOD活性的影响。膳食中添加DON和BCU显著降低了血清中NO的浓度。谷胱甘肽是一种重要的抗氧化剂，可以清除体内的自由基。饮食中补充BCU会增加血清中GSH的浓度。Yang等人和Calabrese等人表明，饲料中添加DON会导致肉鸡空肠中的氧化应激[53,54]. 因此，我们进一步测定了肠道抗氧化蛋白的表达。在本研究中，膳食中添加DON显著增加了空肠中HO-1蛋白的表达以及HO-1、p-Nrf2和p-NF-κ回肠中的B蛋白表达。与添加DON相比，添加DON和BCU的膳食显著降低了空肠中HO-1蛋白、p-Nrf2和p-NF的表达-κ回肠中的B物质。这些结果表明，在脱氧雪腐镰刀菌烯醇激发的猪中，以5 g/kg的饲料添加BCU可以抑制肠道氧化应激相关蛋白的表达。这些结果与之前的研究结果类似，该研究发现黄酮类化合物通过NF激活抗氧化能力并减轻肠道损伤-κB和Nrf2途径[55——57]. 肝脏是人体排毒的重要器官，具有良好的抗氧化活性。因此，我们检测到肝脏中抗氧化基因的表达。饮食中补充DON也显著增加了肝脏中P70S6K、4E-BP1和HSP70的mRNA水平。与添加DON相比，添加DON和BCU显著降低了P70S6K、4E-BP1和HSP70的mRNA水平，增加了AMPK的mRNA含量α2和HO-1在肝脏中。这些结果表明，BCU可以缓解DON攻击猪肝脏的氧化应激。一些文章还报道了黄酮类化合物激活AMPK通路，抑制Nrf2和HO-1的表达，并保护小鼠的肝脏[44,58,59]. 综上所述，根据肠道、肝脏和血清结果，日粮中添加BCU可以提高仔猪的抗氧化能力，从而减轻DON造成的损伤。

从上述研究结果可以看出，添加DON会降低仔猪的生长性能，并导致氧化应激损伤。肠是DON进入人体后的主要靶点。生长性能下降与DON引起的肠道损伤之间的关系可以忽略不计。以往研究表明，DON可引起肠上皮细胞损伤，改变肠绒毛高度和肠隐窝深度，阻碍营养物质的吸收[1,60,61]. 在本研究中，DON组的绒毛高度显著高于DBCU组，这与之前的研究不同[10]. 肠道对营养物质的消化和吸收需要消化酶。在食糜中，BCU组的麦芽糖酶活性降低。在空肠中，DBCU组的麦芽糖酶mRNA水平显著高于其他三组。在回肠中，DON组的氨肽酶N和麦芽糖酶mRNA水平显著高于其他三组。这可能是因为DON组中的麦芽糖酶被破坏，所以产生了更多的麦芽酶用于消化。肠道对营养素的吸收始于营养敏感基因。在空肠中，DON组的TasR3和GPR41 mRNA水平显著增加，可能是因为DON组营养不足，因此表达了更多的受体来吸收营养。氨基酸是仔猪的能量来源，随血液输送到各种组织。为了了解仔猪的氨基酸代谢，我们还测定了血液中游离氨基酸的含量。赖氨酸是猪体内第一种限制性氨基酸。赖氨酸的缺乏会导致猪的生长性能下降。DBCU组的血清赖氨酸含量显著高于DON组，这意味着BCU可能会增加DON攻击仔猪对赖氨酸的吸收。磷酸化是一种常见的翻译后修饰，在调节信号转导和基因表达中起着重要作用[62,63]. 在真核生物中，磷酸化主要发生在丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基上[28,62]. 目前的研究表明，DON组的Ser浓度趋向于低于DBCU组。这可能是因为DON促进抗氧化相关蛋白的磷酸化并消耗大量丝氨酸，膳食中补充DON和BCU可以降低抗氧化相关蛋白磷酸化。此外，DON组的Leu浓度也明显低于Con组和DBCU组。亮氨酸不仅是蛋白质合成的底物，也是肌肉组织蛋白质合成的关键调节因子。DON组生长性能下降也可能与Leu吸收受阻有关[64,65].

5.结论

综上所述，日粮BCU在缓解DON对仔猪的影响方面发挥了有益的作用，如提高断奶仔猪的生长性能和抗氧化能力，调节肠道营养吸收。这些结果提高了我们对BCU在肠道中的功能的理解，并支持BCU在动物生产中的应用。

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