PD-L1在一定程度上促进了肿瘤辐射微粒的免疫逃逸

来自辐照乳腺癌细胞的TMP抑制细胞毒性T细胞活性

PD-L1与多种免疫细胞表达的PD-1结合，并负调节细胞毒性T细胞的活性[35]. 我们对源自辐射细胞的TMPs的蛋白质组学特征表明，TMPs可能在暴露于辐射后的免疫调节中发挥作用。因此，我们试图研究TMP的免疫调节抑制活性。我们重点关注EMT/6和PyMT细胞，因为它们在放射治疗反应中表现出最高百分比的TMP表达PD-L1。作为阴性对照，我们选择使用4T1细胞，因为它们产生低水平的PD-L1-阳性TMP，而不考虑辐射。如材料和方法部分所述，使用CRISPR-Cas9在三种细胞系中进行PD-L1敲除。流式细胞术证实了PD-L1在EMT/6、PyMT和4T1细胞中缺乏表达（图。S4系列). 为了评估PD-L1阳性TMPs对T细胞活化的影响，从未经治疗或照射的WT和PD-L1 KO EMT/6、PyMT和4T1肿瘤细胞培养物中分离出TMPs，并与从非肿瘤荷瘤BALB/c或C57Bl/6小鼠的脾脏中新提取的脾细胞混合。然后将样品应用于T细胞活化试剂盒，并通过流式细胞术监测细胞毒性T细胞的活化。与从未经处理的培养物分离的TMP相比，从2 Gy辐照的WT EMT/6或PyMT培养物分离出的TMP抑制细胞毒性T细胞激活。然而，对于从PD-L1 KO EMT/6或PyMT培养物中分离出来的TMP，这种抑制作用并不明显（图。​（图2a）。2a个). 值得注意的是，从WT或PD-L1 KO 4T1细胞分离的TMP对T细胞激活没有影响，无论它们是从未经处理的细胞还是辐照的细胞分离的（图。第5页). PD-L1阳性EMT/6衍生TMP与活化CD8 T细胞之间的比率增加了6.56倍，这进一步解释了这些结果，而4T1的比率几乎没有变化（表第8节). 最后，与来自WT或PD-L1 KO EMT/6、PyMT和4T1细胞的TMP共同培养的脾细胞条件培养液中颗粒酶B的水平与T细胞激活试验的结果一致（图。​（图2b2亿和5亿). 总的来说，这些发现表明，辐射细胞产生的PD-L1阳性TMP在体外抑制细胞毒性T细胞活性中发挥作用。

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图2

辐照EMT/6和PyMT细胞产生的TMP抑制细胞毒性T细胞活性。一从幼稚的8-10周龄BALB/c小鼠中分离的脾细胞用CD3培养⁺/CD28型⁺如图所示，在没有（基线）或存在TMP的情况下，T细胞激活珠源自对照或辐照的WT EMT/6或PyMT细胞或其PD-L1 KO对应物。阴性对照（NC）是指没有活化珠的培养物。20小时后，收集脾细胞和活化的细胞毒性T细胞（CD8）的百分比⁺/CD25型⁺)流式细胞仪检测。b条所述培养物条件培养基中的颗粒酶B水平(一)用特异性ELISA检测。结果代表三个生物重复。c（c）,d日8至10周龄SCID和6 Gy亚致死剂量照射C57Bl/6小鼠(n个 = 将EMT/6或PyMT细胞以1:100的比例与未经治疗（幼年）小鼠的脾细胞混合，植入5只小鼠/组）。此外，在一些组中，这些样品与来自对照或2Gy辐照细胞的TMP混合，然后注射到小鼠体内。EMT/6或PyMT细胞与来自荷瘤小鼠的活化脾细胞的混合物用作阳性对照。将EMT/6和PyMT单独植入乳腺脂肪垫作为阴性对照。每周评估两次肿瘤生长(c（c）). 在实验结束时，提取肿瘤，并计算肿瘤细胞总数和活化CD8细胞（CD8）的百分比⁺/CD25型⁺)通过流式细胞术进行评估(d日). *第页 < 0.05, **第页 < 0.01, ***第页 < 0.001，通过单向方差分析和Tukey事后检验进行评估

接下来，为了评估TMPs在体内的免疫抑制作用，进行了经典的免疫WINN测定，如材料和方法部分所述。简单地说，将幼年小鼠的脾细胞与EMT/6或PyMT细胞以100:1的比例混合，并共同植入幼年小鼠乳腺脂肪垫中。在一些组中，来自对照或2Gy辐照细胞的TMP与肿瘤细胞和脾细胞混合，然后共同植入幼年小鼠的乳腺脂肪垫。单独植入EMT/6或PyMT细胞的小鼠或与从荷瘤小鼠获得的活化脾细胞共同植入的小鼠分别作为阴性和阳性对照。这些实验是在免疫损伤小鼠（SCID或亚致死性照射小鼠）中进行的，目的是消除免疫活性小鼠中发生的固有免疫反应。在EMT/6和PyMT模型中，与来源于2 Gy辐照细胞的TMP共同注射的小鼠的肿瘤生长率最高，表明TMP可能在免疫结节形成中发挥作用（图。​（图2c）。2厘米). 对提取肿瘤中细胞毒性T细胞的后续分析表明，来自2 Gy辐照细胞的TMP显著降低了CD8-阳性细胞的百分比及其激活状态（图。​（图2d）。二维). 值得注意的是，EMT/6和PyMT肿瘤中MDSC和巨噬细胞的百分比保持不变，这表明它们在我们的实验环境中不起作用（图。S6系列). 总之，来自辐照细胞的TMP有助于免疫抑制活性，部分是通过抑制细胞毒性CD8+T细胞。

来自辐照乳腺癌细胞的TMP在体内促进肿瘤生长并抑制T细胞活性

为了表征TMP的体内效应，我们首先研究了来自辐照培养物的TMP是否影响小鼠原位肿瘤模型中的肿瘤生长。为此，小鼠被原位植入EMT/6、PyMT或4T1细胞。当肿瘤达到约100 mm时^三给小鼠静脉注射相应的TMP（1×10⁵每次注射）来自未经处理或辐照的培养物。每周监测两次肿瘤生长，直到其中一组达到终点。与所有其他组相比，注射来自2 Gy辐照EMT/6和PyMT培养物的TMP的小鼠肿瘤生长增强，但并不总是显著。相反，来自未经治疗或辐照的4T1培养物的TMP对肿瘤生长没有明显影响（图。​（图3a3a年和S7A系列). 在结束时，切除肿瘤，制备成单细胞悬浮液，并通过流式细胞术分析，以量化激活的细胞毒性T细胞的水平。我们发现，用来自2 Gy辐照细胞培养物的TMP注射EMT/6或PyMT荷瘤小鼠可减少活化的细胞毒性T细胞（CD8）的数量⁺/CD25型⁺细胞），而4T1肿瘤中的细胞数量未受影响。脾脏中活化的细胞毒性T细胞水平也降低，EMT/6和PyMT外周血中的细胞毒性T细胞水平也有所降低，但对TMP注射的4T1荷瘤小鼠没有降低（图。3b–d日和S7B–D系列). 总之，这些结果表明TMP介导的免疫调节与体内肿瘤进展之间可能存在联系。

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图3

来自辐照EMT/6或PyMT细胞的TMP在体内促进肿瘤生长并抑制细胞毒性T细胞活性。一EMT/6或PyMT肿瘤细胞（5×10⁵/小鼠）分别原位植入8–10周龄雌性BALB/c和C57Bl/6小鼠的乳腺脂肪垫(n个 = 4-5只小鼠/组）。当肿瘤达到~100mm时^三，小鼠每3天静脉注射一次PBS（对照组）或来自对照组的TMP，或2 Gy照射的EMT/6或PyMT细胞（用箭头表示，1×10⁵TMP/鼠标）。每周监测两次肿瘤体积。b条–d日在终点，抽取血液，采集肿瘤和脾脏。活化CD8细胞（CD8⁺/CD25型⁺)在肿瘤中进行评估(b条)、脾脏(c（c）)和外周血(d日)流式细胞术检测*第页 < 0.05, **第页 < 0.01，通过单向方差分析和Tukey事后检验进行评估

来自辐照肿瘤细胞的TMP分布在脾脏和肝脏中，但不分布在淋巴结和肾脏中

为了进一步了解哪些器官参与了体内外周血循环TMP的免疫调节作用，我们重点研究了TMP在各种外周血细胞过滤器官中的分布模式。为此，8–10周龄BALB/c小鼠静脉注射PKH26荧光标记的TMP，这些TMP来自未经处理或2 Gy辐照的EMT/6培养物。24小时后，处死小鼠，对脾脏、肝脏、肾脏和腋窝淋巴结进行免疫染色和流式细胞仪分析。TMP在脾脏和肝脏中大量积累，但在肾脏和淋巴结中几乎未检测到（图。4a–c类). 重要的是，TMP的分布模式和累积都不受辐射照射的影响。这些结果表明，来自原发肿瘤细胞的TMP不仅在肿瘤部位发挥局部作用，而且在通过外周血分布时也发挥全身作用，但这种作用不会因放射治疗而改变。TMP通过定殖脾脏和肝脏等远距离器官，具有调节这些远距离器官部位免疫细胞活性的潜力。然而，它们的免疫调节作用并不一定涉及淋巴结。

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图4

辐射乳腺癌细胞产生的TMP积聚在脾脏和肝脏中。一用PKH26标记未经处理（对照）或2Gy辐照的EMT/6细胞释放的TMP，PKH26是一种膜荧光连接物。荧光标记TMP（1×10⁵TMP/小鼠）静脉注射至8–10周龄BALB/c小鼠(n个 = 3-4只小鼠/组）。对照小鼠注射PBS。24小时后，将指示器官均质化，PKH26的百分比⁺通过流式细胞术评估上清液中总微粒（MP）中的细胞（可能与TMP融合的细胞）和PKH26标记的TMP。b条所示为注射PBS（对照）的小鼠脾脏、肝脏、肾脏和腋窝淋巴结中总MP的PKH26标记TMP的代表性流式细胞仪斑点图，或未经处理（对照）或辐照细胞的TMP。c（c）小鼠脾脏、肝脏、肾脏和腋窝淋巴结的切片(一)用辐照EMT/6细胞的TMP注射后，用DAPI染色并用荧光显微镜进行分析。显示了具有代表性的图像。放大倍数×1000视野；比例尺=20µm*第页 < 0.05（脾脏），^$第页 < 0.05和^$$第页 < 0.01（对于肝脏），通过单向方差分析和Tukey事后检验进行评估

来自辐射细胞的TMP抵消T细胞介导的肿瘤生长抑制

为了进一步探讨TMP介导的免疫调节与肿瘤进展之间的可能联系，我们进行了T细胞过继转移实验。为此，CD8⁺从EMT/6和PyMT荷瘤小鼠的脾脏中分离出T细胞。CD8⁺然后，细胞单独培养24小时，或在未经处理或辐照的EMT/6或PyMT培养物中产生的TMP存在下培养24小时。随后，CD8⁺将各组细胞静脉注射到SCID小鼠或亚致死剂量照射的200 mm的C57Bl/6小鼠体内^三EMT/6和PyMT肿瘤。值得注意的是，在PyMT模型中，包括对照组在内的所有小鼠均受到同等剂量的辐射，以避免任何可能的辐射附加效应。每周重复一次过继转移，并监测肿瘤生长，直到其中一组达到终点。不出所料，接受CD8的小鼠⁺与接受幼年小鼠T细胞的小鼠相比，来自荷瘤小鼠的细胞显示出较慢的肿瘤生长速度。重要的是，接受CD8的小鼠肿瘤生长速度加快⁺用来自辐照EMT/6或PyMT培养物的TMP预培养的细胞。相反，接受CD8的小鼠⁺用来自未经处理的培养物的TMP预先培养的细胞显示出与接受来自荷瘤小鼠的T细胞的小鼠相似的肿瘤生长率（图。​（图5a）。5a级). 在实验结束时，采集肿瘤和脾脏，制备成单细胞悬浮液，用于评估CD8⁺流式细胞术检测T细胞。占总CD8的百分比⁺细胞和CD8的活化部分⁺CD25型⁺用来自辐射细胞的TMPs处理的PyMT和EMT/6荷瘤小鼠的脾脏中的细胞都减少了，尽管这些结果在EMT/6模型中没有达到统计学意义（图。​（图5b）。5亿). 同样，从辐照细胞中注射TMP导致活化的CD8显著减少⁺PyMT肿瘤中的细胞，而EMT/6肿瘤中的任何组之间均未检测到显著差异（图。第8节). EMT/6肿瘤模型中发现的T细胞活性无显著性结果可能是由于上次T细胞注射与实验终点之间的时间间隔所致。具体而言，在EMT/6模型中，在最后一次T细胞过继移植后7天进行分析，而在PyMT肿瘤模型中，肿瘤是在T细胞过渡性移植后3天收获的。总之，我们的结果表明，来自辐照肿瘤细胞的TMP抑制细胞毒性T细胞活性，从而加速肿瘤生长。

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图5

预先将细胞毒性T细胞暴露于来自辐照细胞的TMP可抵消T细胞介导的肿瘤生长抑制作用。收集8-10周龄幼鼠、EMT/6或PyMT荷瘤小鼠（分别为BALB/c和C57Bl/6小鼠）的脾脏，并制备成单细胞悬浮液，CD8⁺通过阴性选择分离细胞。CD8（CD8）⁺将来自荷瘤小鼠的细胞单独培养24小时（活化CD8），或与来自对照EMT/6或PyMT细胞的TMP（活化CD8+TMP对照）或2 Gy辐照EMT/6和PyMT电池（活化CD3+TMP 2 Gy）一起培养24小时。CD8（CD8）⁺将每组细胞静脉注射到8–10周龄的EMT/6荷瘤雌性SCID小鼠或PyMT荷瘤6 Gy亚致死剂量照射的C57Bl/6小鼠（10⁶细胞/鼠标，n个 = 5只小鼠/组）。对照小鼠注射PBS（未经处理）。一CD8的采纳转让⁺每周在指定的时间点（箭头）执行细胞操作，直到结束。每隔一天评估肿瘤生长情况。b条在实验结束时，取下脾脏，制备成单细胞悬液，用于评估CD8总量⁺细胞和活化T细胞（CD8⁺/CD25型⁺)通过流式细胞术*第页 < 0.05, **第页 < 0.01, ***第页 < 0.001，通过单向方差分析和Tukey事后检验进行评估

PD-L1 KO细胞的产生

根据Ran等人的研究，靶向PD-L1外显子3的24-base-pair gRNA序列（CACCGGTCCAGCTCTCTCTATA）被克隆到pSpCas9（BB）-2A-GFP（PX458）（Addgene质粒#48138）中[49]获得pSpCas9-GFP-PD-L1。因此，用pSpCas9-GFP-PD-L1电穿孔EMT/6、PyMT和4T1细胞。48小时后，对GFP阳性细胞进行分选，并使用FACSAria™IIIu分选仪（BD Bioscience，San Jose，CA，USA）将单个细胞电镀在96个板中。用流式细胞术检测扩增集落PD-L1的表达。PD-L1外显子3的Sanger测序进一步证实了PD-L1完全缺失的克隆。将原始细胞培养物汇集起来用作WT对照。

TMP的生成和收集

培养肿瘤细胞（如文中所示），直到它们达到80%的融合，然后用无血清（SF）培养基代替培养基。随后，使用直线加速器6 MeV电子束，使用Elekta Precise（瑞典Elekta），以每分钟40 cGy的剂量率，将细胞暴露于电离辐射中，在室温下总剂量为2 Gy或6 Gy，作为单个组分（以色列海法拉姆巴姆医疗中心放射治疗部）。对照细胞没有受到辐射。为了收集来自细胞的TMP，在辐射后48小时收集条件培养基（CM），并在3300×克在室温下放置20分钟，以去除漂浮细胞。然后将无细胞上清液以20000×克在4°C下放置1小时，以沉淀TMP。将颗粒重新悬浮在磷酸盐缓冲溶液（PBS）中，分为小份，并在−80°C下储存，直至再次使用。在一些实验中，如前所述，从血液中提取TMP[19].

TMP的质谱和蛋白质组分析

TMP在Smoler蛋白质研究中心（Technion）进行蛋白质组学分析。将提取的TMP颗粒重新悬浮在8M尿素、100mM碳酸氢铵中，并进行超声波处理。蛋白质在60°C下用3mM DTT还原30分钟，在室温下用9mM碘乙酰胺在100mM碳酸氢铵中在黑暗中修饰30分钟，并在37°C下以1:50的酶与底物比例在2M尿素、25mM碳酸氢铵和修饰的胰蛋白酶（Promega，Madison，WI，USA）中消化过夜。额外进行胰蛋白酶化4小时。使用C18尖端（美国马萨诸塞州霍利斯顿市哈佛仪器公司）对所得胰蛋白酶肽进行脱盐，干燥后再悬浮在0.1%甲酸中。使用Q Exactive plus质谱仪（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科学公司）和毛细管HPLC（easy nLC 1000，赛默飞世科学公司），通过LC-MS/MS对样品进行分析。将肽装入装有Reprosil C18-Aqua（Dr Maisch GmbH，德国）的C18自制毛细管柱（20 cm，75微米ID）中的溶剂a（水中0.1%甲酸）中。用（5–28%）线性梯度的溶剂B（95%乙腈和0.1%甲酸）溶解肽混合物120分钟，然后在28–95%和95%乙腈与0.1%甲酸的水溶液中以0.15的流速进行10分钟梯度和25分钟梯度的拆分μl/min，在正模式下（m/z 350–1800，分辨率70000），使用从第一次MS扫描中选择的10个最主要离子（>1电荷）的重复全MS扫描，然后碰撞诱导离解（HCD，35标准化碰撞能量）进行质谱分析。启用了动态排除列表，排除持续时间为20秒。

使用MaxQuant软件1.5.2.8对质谱数据进行分析，以便使用Andromeda搜索引擎进行峰值拾取识别和定量，并在校准后搜索质量公差为20 ppm和4.5 ppm的鼠标uniprot数据库。蛋氨酸氧化和蛋白质N端乙酰化被认为是可变修饰，而半胱氨酸上的氨基甲酰被认为是静态修饰。将最小肽长度设置为7个氨基酸，最多允许两次错漏。使用目标经济策略将肽和蛋白质水平的错误发现率（FDR）过滤到1%。对蛋白质表进行过滤，以消除反向数据库中的标识、常见污染物和单肽标识。使用相同的软件，基于肽的提取离子电流（XIC），通过无标签分析对数据进行量化，从而能够从每个LC/MS运行中对任何实验中确定的每个肽进行定量。使用Perseus 1.5.0.31软件进一步分析蛋白质组输出[50]. 无标签量化（LFQ）强度值[51]是日志₂转化。每次比较（EMT/6对照与辐射或PyMT对照与辐射）都是单独处理的，随后进行数据过滤，只保留至少一个样品组中三个重复中至少两个重复中定量的蛋白质。学生的t吨测试采用基于排列的FDR校正，截止值为0.05，S0校正为0.1[34]. 富集分析采用Fisher精确试验进行，FDR截止值为0.02。主成分分析是在数据插补后进行的，方法是用形成正态分布的值替换缺失的值，将原始数据分布的标准偏差降为1.6，宽度降为0.4。

TMP数量和大小分析

如前所述，使用流式细胞术对TMP进行量化[31]. 简单地说，使用0.78µm大小的珠子（美国印第安纳州邦斯实验室公司）测量TMP的大小，并计算TMP数量与计数珠子（邦斯实验室有限公司）之间的比率。在一些实验中，使用NanoSight NS300（英国马尔文）和NanoSight-NS300 NTA v2.3软件（英国马尔文）对TMP进行尺寸表征。

动物模型

所有动物研究和动物实验方案均由Technion动物护理和使用委员会批准。EMT/6或4T1电池（5×10⁵)将其原位植入8–10周龄雌性BALB/c小鼠的乳腺脂肪垫中（Envigo，以色列）。PyMT电池（5×10⁵)将其原位植入8-10周龄雌性C57Bl/6小鼠的乳腺脂肪垫中（Envigo，以色列）。MDA-MB-231细胞（2×10⁶)将其原位植入8-10周龄雌性SCID小鼠（Envigo，以色列）的乳腺脂肪垫中。在大多数实验中，n个 = 除非另有说明，否则使用5只小鼠/组。在所有实验中，小鼠被随机分配到实验组。所有放射程序、肿瘤接种和注射TMP均为盲法。肿瘤体积用游标卡尺测量，按宽度×宽度×长度×0.5计算。当肿瘤达到100毫米时^三，小鼠静脉注射1×10⁵TMP来源于EMT/6、PyMT或4T1细胞（在100μl PBS中）。对照组小鼠注射PBS。在一些实验中，当肿瘤达到100–200 mm时^三，将小鼠暴露于单剂量2 Gy辐射（局部），并用抗PD-1（100μg/小鼠，每周两次）或其IgG对照物进行治疗。根据参考文献所述，在照射后48小时从口腔窦后出血处采集外周血，分离TMP进行进一步分析[19]. 当肿瘤达到终点时（通常为1000–1500 mm^三)如文章所示，处死小鼠，收集肿瘤、脾脏和血液进行进一步分析。

在T细胞过继转移实验中，从500 mm的脾脏中采集^三EMT/6和PyMT荷瘤小鼠或幼年小鼠，随后制备成单细胞悬浮液以提取脾细胞，如前所述[52]. CD8（CD8）⁺然后使用MojoSort进行阴性选择，从脾细胞悬浮液中分离细胞^TM（TM）小鼠CD8 T细胞分离试剂盒（BioLegend，加利福尼亚州圣地亚哥，美国）符合制造商的说明。CD8（CD8）⁺将来自荷瘤小鼠的细胞在37℃下孵育24小时，加入或不加入从2 Gy辐照或对照EMT/6或PyMT细胞（1×10）中获得的TMP⁵TMP/1×10⁶CD8（CD8）⁺细胞），然后清洗以去除游离TMP。接下来是CD8⁺将细胞静脉注射到原位植入的10周龄SCID小鼠体内，小鼠的直径为100–200 mm^三EMT/6肿瘤或10周龄C57Bl/6小鼠经亚致死性照射（全身照射6 Gy，剂量率为125 cGy/min），照射剂量为100–200 mm^三PyMT肿瘤。这种过继性T细胞移植每周重复一次。在实验结束时，处死小鼠，采集肿瘤和脾脏进行进一步分析，如下所述。

如前所述执行WINN分析[53,54]. 简单地说，脾脏是从幼年小鼠或500毫米^三EMT/6或PyMT荷瘤小鼠。随后，将其制备成单细胞悬浮液以获得脾细胞。将幼年小鼠的脾细胞与EMT/6或PyMT细胞以100:1（50×10）的比例混合⁶脾细胞/0.5×10⁶EMT/6或PyMT电池）以及TMP（1×10⁵)从原始或2Gy辐照的EMT/6或PyMT细胞中提取。将细胞和TMP的混合物皮下注射到8-10周龄SCID小鼠（EMT/6肿瘤）和亚致死剂量照射的C57Bl/6（PyMT肿瘤）的侧翼。将来自荷瘤小鼠的活化脾细胞和肿瘤细胞的混合物用作阳性对照。定期监测肿瘤生长。在终点，切除肿瘤，进行单细胞悬浮处理，并分析T细胞活性。

细胞毒性T细胞活性和癌细胞杀伤的评价

根据制造商的说明，使用小鼠T细胞激活试剂盒（德国Miltenyi Biotec）评估细胞毒性T细胞活性。简言之，脾细胞（10⁶)在含有或不含有抗小鼠CD3ε和CD28生物素化珠（10⁶珠子/样品）。这些珠子模拟抗原呈递细胞并激活静止的T细胞。随后，将细胞以470×克在室温下保持5分钟。细胞颗粒在PBS中重新悬浮，总CD8水平⁺T细胞和活化T细胞（CD8⁺/CD25型⁺)通过流式细胞术进行定量，如下所述。同时，根据制造商的说明，使用特定ELISA（美国明尼苏达州明尼阿波利斯R&D Systems公司）对脾脏和肿瘤细胞上清液中颗粒酶B的分泌水平进行量化，从而对颗粒酶B分泌进行评估。

对于T细胞杀伤试验，CD8⁺使用MojoSort从EMT/6或PyMT荷瘤小鼠的脾细胞悬浮液中通过阴性选择分离细胞^TM（TM）小鼠CD8 T细胞分离试剂盒（BioLegend，加州圣地亚哥，美国），符合制造商的说明。CD8⁺然后在37°C下，在未经处理或2 Gy辐照的EMT/6或PyMT细胞（WT或PD-L1 KO细胞）中存在或不存在TMP的情况下培养细胞24小时。对于药物PD-L1抑制，添加10µg/ml抗小鼠PD-L1抗体（BioXCell，西黎巴嫩，NH；cat.BP0101）。随后，用PBS清洗T细胞以去除游离TMP和未结合抗体，然后与EMT/6或PyMT细胞以10:1的比例培养24小时（25000–2500个细胞）。将碘化丙锭（PI，500 nM）添加到培养物中，以识别死细胞。使用Inccyte Zoom HD/2CLR系统（密歇根州安娜堡埃森生物科学公司）监测T细胞杀伤效果。所有实验均使用至少三个生物重复进行三次。

流式细胞仪采集与分析

如前所述，从肿瘤、脾或外周血细胞制备的单细胞悬浮液[52]根据制造商的说明，使用从BioLegend（加利福尼亚州圣地亚哥BLG）或BD Biosciences（新泽西州富兰克林湖BD）购买的抗体进行免疫染色。以下标记组合用于定义总T细胞（CD8⁺，猫。BLG-100714），活化的细胞毒性T淋巴细胞（CD8⁺，猫。BLG-100714/CD25⁺，猫。BD-102007），髓源性抑制细胞（MDSC，CD11b⁺，猫。BLG-101230/1级⁺，猫。BD-108408）和巨噬细胞（F4/80⁺，猫。BLG-123116）。对来自对照或放射治疗小鼠乳腺癌细胞的TMP进行免疫染色，并分析PD-L1的表达。在从小鼠获得的外周血样本中，通过人类白细胞抗原（HLA，cat.BD-311406）免疫染色鉴定来自MDA-MB-231肿瘤的TMP，并分析人类PD-L1表达（cat.BD.329706）。同样，对乳腺癌细胞及其衍生TMP进行PD-L1表达分析（cat.BD-124312）。如前所述，使用Annexin V和7-氨基放线菌素D（7-AAD）区分活细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞和死亡细胞[55]. 在一些实验中，根据制造商的说明，用PKH26荧光细胞连接器（美国密苏里州圣路易斯Sigma-Aldrich）标记TMP。这些PKH26标记的TMP或与其融合的细胞被鉴定为阳性事件。使用LSRFortessa流分析仪系统（BD Bioscience，San Jose，CA，USA）或CyAN ADP流式细胞仪（Beckman Coulter，CA，US）采集到至少200000个事件，然后使用FlowJo 7.6.1软件（FlowJo，LLC，Ashland，or，USA，）进行分析。

免疫染色

脾脏、肝脏、肾脏和淋巴结被埋入OCT（Tissue-Tek，Sakura Finetek USA Inc.，Randor，PA，USA）中，并在−80°C下保存，直到进一步处理。接下来，使用Leica CM1950 Clinical Cryostat（Leica Biosystems，德国）对组织进行冷冻切片（10μm）。切片在4°C下用4%多聚甲醛固定30分钟，用4'-6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）（美国宾夕法尼亚州哈特菲尔德电子显微镜科学公司）染色以染色细胞核，并使用倒置荧光显微镜Leica CTR 6000显微镜系统（德国Leica Microsystems公司）对每个×100物镜进行分析。

本研究由以色列癌症研究基金资助，Buckstein家族资助YS和RSK，欧洲研究委员会（编号771112）资助，Rappaport基金资助YS。