RNF208是一种雌激素诱导的E3连接酶，靶向可溶性波形蛋白以抑制三阴性乳腺癌的转移

ERα调节RNF208的表达

由于RNF208在内腔型乳腺癌亚型（ERα阳性）中的表达增加，我们使用公共微阵列数据集研究了RNF208和ERα表达之间的关系({“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE2034”，“term_id”：“2034”}}GSE2034标准;{“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE5460”，“term_id”：“5460”}}GSE5460标准). 乳腺癌中RNF208的表达与ERα状态呈正相关（图2年). 接下来，我们测试了RNF208是否可能是真正的雌激素反应靶基因。将MCF-7和T47D细胞培养在无酚培养基中，用木炭剥离血清去除残留的外源性雌激素和雌激素样化合物。有趣的是，E2处理显著诱导RNF208表达，类似于其他ERα应答基因，如FOXOM1型和绿色1（图2亿)和siRNA诱导的ESR1系列敲除减弱E2诱导的RNF208（参考编号208）在T47D电池中（图2厘米)表明RNF208的表达可能取决于管腔乳腺癌细胞中ERα的表达。为了确定E2诱导的RNF208的表达是否与RNF208启动子的直接转录激活有关，我们生成了RNF208基因启动子的缺失结构，该启动子包含雌激素反应元件（ERE），插入pGL3荧光素酶报告基因上游（图二维; 补充图^2年). 值得注意的是，E2处理使RNF208启动子片段的荧光素酶活性增加至−1154 bp，而缺失位置−1121 bp或−724 bp对T47D和MCF-7中的E2处理没有反应（图第二版; 补充图^3a年). 为了确定E2诱导的RNF208启动子激活是否增加了ERα与RNF208基因位点的直接结合，我们在T47D细胞中使用抗ERα抗体进行染色质免疫沉淀（ChIP）。E2处理显著增加了包含一个ERE位点的−1131 bp至−1124 bp启动子区域内ERα的相互作用，表明内源性ERα被招募到RNF208启动子中（图第2页). 为了进一步确定位于−1131 bp至−1124 bp区域的哪个ERE位点负责E2诱导的RNF208启动子激活，我们生成了一个携带两个替换（GACC至GAAA）的ERE突变结构（mtR4）。E2处理后，T47D细胞和MCF-7中全长RNF208启动子的荧光素酶活性增加，而ERE突变显著抑制了RNF208的启动子激活（图2克; 补充图^3亿). 此外，RNF208启动子−1131/−1124 bp区域的缺失显著减弱了MCF-7细胞中E2诱导的RNF208表达（图2小时). 由于RNF208在TNBC细胞中表达不良，我们接下来利用公共基因组数据库研究RNF208的下调是否是TNBC细胞启动子内异常DNA甲基化的结果({“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE68379”，“term_id”：“68379“}}GSE68379型). RNF208启动子的甲基化水平在TNBC细胞中不显著，表明甲基化与RNF208沉默无关（补充图²). 考虑到ESR1型TNBC细胞中RNF208的表达受到表观遗传机制（如DNA甲基化）的抑制，我们进一步研究了RNF208在TNBC细胞的低表达是否可能是由于沉默ESR1系列通过DNA甲基化表达。有趣的是，5-氮杂-dC处理导致TNBC细胞（MDA-MB-231，Hs578T）中ERα和RNF208的表达水平增加（图第2页，补充图^{3立方厘米}). 更引人注目的是，siRNA敲低ERα减弱了5-aza-dC诱导的TNBC细胞中RNF208的增加，这意味着ERα的表达是诱导RNF208所必需的（图第2节). 总之，我们的研究结果表明，RNF208是一个直接的雌激素反应靶基因，依赖于ERα。

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图2

内腔型乳腺癌细胞中RNF208的表达被ERα转录激活。

一的比较RNF208（参考编号208）已发表微阵列数据集中ERα阳性和阴性乳腺癌样本的表达({“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE2034”，“term_id”：“2034”}}GSE2034标准和{“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE5460”，“term_id”：“5460”}}GSE5460标准).b条ERα靶基因的RT-PCR（顶部）和免疫印迹（底部）分析(FOXOM1、GREB1、ESR1)和RNF208在EtOH或E2处理的ERα阳性乳腺癌细胞中的表达。分别在MCF-7或T47D细胞中处理10nM或20nM的E2，并对E2进行24小时的RT-PCR和48小时的免疫印迹分析。GAPDH公司以β-actin为内对照。c（c）实时定量RT-PCR（qRT-PCR）RNF208（参考编号208）中的表达式ESR1系列-E2处理后击倒T47D细胞。d日包括RNF208启动子序列中ERα结合位点的荧光素酶报告子图解。e（电子）用RNF208启动子的各种缺失结构转染T47D细胞，然后用E2或不用E2处理24小时。E2处理后，检测细胞的荧光素酶活性。（f）ChIP分析显示E2处理的T47D细胞中ERα向人类RNF208启动子募集。用抗正常IgG或抗ERα抗体进行沉淀。克用pGL3对照、RNF208启动子或其突变（mtR4）质粒转染T47D细胞，该质粒含有突变的雌激素反应元件位点（CACC序列被GAAA取代），然后进行荧光素酶分析。小时RT-PCR和免疫印迹分析显示，E2处理24小时（mRNA）或48小时（蛋白质）后，对照或ERE敲除MCF-7细胞中RNF208表达。我TNBC细胞中ERα与5-氮杂-dC处理的免疫印迹分析。用10μM 5-aza-dC处理Hs578T和MDA-MB-231细胞96 h，并使用β-actin进行归一化。j个TNBC细胞瞬时转染20 nM对照siRNA或ESR1系列siRNA，然后用10μM 5-aza-dC处理96小时。用所示抗体对细胞裂解物进行免疫印迹。全部P（P）值由未配对的双尾Student’st吨测试(e（电子）,克). 这些数据代表了三个独立实验的平均值±标准差。的源数据(c（c）,e（电子）,克,小时)在源数据文件中可用。未处理的斑点和凝胶的原始扫描(b条,（f）,小时−j个)如补充图所示¹³.

RNF208过表达降低肿瘤生长和肺转移

我们的发现使我们验证了RNF208在乳腺癌进展中的生理功能。我们首先研究了RNF208的表达水平是否影响体外和体内的肿瘤发生。RNF208过表达显著降低了TNBC细胞的增殖（图3a年). 为了进一步测试RNF208对体内TNBC细胞致瘤能力的影响，我们将RNF208-tolu TNBC细胞皮下注射到免疫缺陷小鼠的侧翼。RNF208的过度表达显著降低了TNBC细胞的肿瘤体积（图3亿). 此外，细胞增殖标记Ki-67的表达降低（图3立方厘米; 补充图^4a类)然而，与对照组织相比，RNF208过度表达的原发肿瘤组织中细胞死亡标记物活性caspase-3增加（图三维; 补充图^4b个).

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图3

RNF208的过度表达可减少TNBC细胞的肿瘤发生和肺转移。

一RNF208-过表达Hs578T和MDA-MB-231细胞的细胞加倍。每个点代表三份培养皿中细胞数的平均值。b条NOD/SCID小鼠侧翼皮下注射对照和RNF208-过表达TNBC细胞的肿瘤形成和生长(n个 = 每组6个）。每周测量原发肿瘤体积，8周后处死小鼠（Hs578T和MDA-MB-231）。显示了具有代表性的原发肿瘤图像（顶部）和肿瘤体积（底部）。c（c）显示Ki-67和RNF208在原发性肿瘤组织中表达的代表性IHC图像(b条). 原始放大倍数×100。比例尺，100μm。d日使用RNF208-过表达MDA-MB-231细胞的裂解物进行活性caspase-3表达的免疫印迹分析。β-actin作为内部对照。e（电子）,（f）稳定表达RNF208蛋白的TNBC细胞的Transwell迁移和Matrigel侵袭试验。24小时后，迁移(e（电子）)并被入侵(（f）)结晶紫染色后计数细胞数。克NOD/SCID小鼠的代表性生物发光（BLI）成像(n个 = 5个/组），显示6至8周肺转移，来源于对照组和RNF208-过表达MDA-MB-231-Luc的侧向尾静脉注射。小时用印度墨水染色的代表性全肺图像显示转移性结节（顶部），散点图显示肺转移性结节的数量（底部）。全部P（P）值由未配对的双尾Student’st吨测试(一,b条、和小时). 数据代表平均值±标准差(一,b条,e（电子）,（f）,小时)在源数据文件中可用。未处理的斑点和凝胶的原始扫描(d日)如附图所示¹³.

由于致瘤潜能与肿瘤细胞转移的侵袭性增强密切相关，我们接下来使用Transwell迁移和Matrigel侵袭分析检查RNF208是否影响细胞迁移和侵袭性。RNF208的过度表达显著降低了Hs578T和MDA-MB-231细胞的细胞迁移和侵袭（图3e、f). 我们进一步观察到，RNF208-过表达MDA-MB-231细胞在免疫缺陷小鼠的肺转移和转移性肺结节中显著减少（图3g小时). 然后，我们研究了RNF208的缺失是否增加了乳腺癌细胞管腔亚型的侵袭潜力。出乎意料的是，RNF208的敲除和敲除都没有改变上皮-间充质转化（EMT）标志物的表达，如E-钙粘蛋白和波形蛋白，或对照和RNF208缺陷的T47D细胞的细胞迁移能力（补充图⁵)这表明RNF208的缺失可能不足以诱导管腔型乳腺癌亚型的侵袭性表型和癌症进展。综上所述，这些结果强烈表明RNF208可能在TNBC细胞的癌症进展中起到抑癌作用。

RNF208过度表达降低了波形蛋白的稳定性

为了评估RNF208在乳腺癌进展中作用的分子机制，我们对RNF208过度表达的MDA-MB-231细胞进行了基于质谱的甲醛交联分析。通过质谱分析，波形蛋白被鉴定为RNF208的潜在结合蛋白（图4a类). 由于波形蛋白与转移癌进展中侵袭性癌细胞的间充质表型相关，我们首先研究RNF208是否调节Hs578T和MDA-MB-231细胞中EMT标记物的表达。有趣的是，RNF208过度表达强烈降低了波形蛋白蛋白的表达水平，而不影响其mRNA或E-cadherin的表达（图4b、c). 为了确定波形蛋白在RNF208过度表达细胞中表达水平的降低是否是其蛋白稳定性减弱的原因，我们测量了用蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺处理后波形蛋白的半衰期。与对照细胞相比，RNF208-烦恼MDA-MB-231细胞显示出更快的波形蛋白降解速率（图第4天). 此外，通过蛋白酶体抑制剂MG132治疗，而不是通过自噬抑制剂，如巴非霉素A1（BAF）、氯喹（CQ）和3-甲基腺嘌呤（3-MA），可以挽救RNF208过度表达时波形蛋白稳定性降低的情况（补充图^6b条). 与该观察结果一致，MG132治疗也显著恢复了RNF208异位表达细胞中波形蛋白稳定性的降低（图第四版).

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图4

RNF208通过促进K27连接的多泛素化诱导波形蛋白的蛋白酶体降解。

一基于质谱的交联分析中分析的RNF208结合伙伴候选列表。b条免疫印迹分析显示对照组和RNF208-过度表达Hs578T和MDA-MB-231克隆细胞（#1-#3）中的波形蛋白、E-cadherin和RNF208。β-actin作为内部对照。c（c）RT-PCR显示RNF208（参考编号208）和VIM公司在对照和RNF208-过度表达的Hs578T或MDA-MB-231细胞中表达；18秒被用作内部控制。d日免疫印迹分析显示在环己酰亚胺（CHX，50μg ml⁻¹)用于指定的时间（左）。使用ImageJ软件（右）量化数据，并使用β-actin表达进行归一化。e（电子）免疫印迹分析显示对照组和RNF208-过度表达Hs578T和MDA-MB-231细胞中波形蛋白蛋白的表达水平，以及蛋白酶体抑制剂MG132。用10μM MG132处理细胞6 h，用所示抗体对细胞裂解物进行免疫印迹。（f）免疫沉淀分析显示RNF208和波形蛋白之间的内源性相互作用。MG132处理293T细胞后，用Myc-RNF208和Flag-Vimentin质粒共转染细胞。用抗Myc抗体免疫沉淀细胞裂解物，然后用指示的抗体免疫印迹。WCL全细胞裂解物。克免疫沉淀分析显示RNF208的异位表达导致了波形蛋白的泛素化。经MG132处理后，293T细胞与HA-Ubiquitin、Flag-Vimentin或Myc-RNF208质粒共转染293T。用抗Flag免疫沉淀法检测波形蛋白泛素化，然后用所示抗体进行免疫印迹。小时免疫沉淀分析显示RNF208通过K27介导的波形蛋白泛素化。293T细胞与Flag-Vimentin共转染，HA-Ubiquitin（野生型，K27，K29，K49）的不同连接。K63）或Myc-RNF208质粒，然后用抗Flag抗体免疫沉淀细胞裂解物。我在Myc-RNF208质粒不存在或存在的情况下，将Flag Vimentin质粒与HA泛素的野生型、K27或赖氨酸突变体（K27R）一起共转染到293T细胞中。用抗Flag抗体对细胞裂解物进行免疫沉淀，然后用指示的抗体进行免疫印迹。中未处理的斑点原始扫描(b条−我)如补充图所示¹³.

由于波形蛋白被确定为RNF208的结合伙伴，我们接下来通过293T和Hs578T细胞的共免疫沉淀来测试RNF208和波形蛋白之间的相互作用。正如预期的那样，免疫沉淀分析显示了这两种蛋白质之间的外源或内源性相互作用（图第4页; 补充图^6厘米). 考虑到RNF208 E3连接酶的泛素转移活性，我们接下来研究RNF208是否介导波形蛋白的泛素化。值得注意的是，RNF208的异位过度表达诱导了波形蛋白的多泛素化（图4克). 为了确定RNF208-多泛素化波形蛋白是否与任何类型的多泛素链相关，在MG132治疗时，在存在或不存在Myc-RNF208的情况下，用Flag-Vimentin和HA-Ubiquitin（野生型、K27、K29K、K48和K63）瞬时转染293T细胞。有趣的是，RNF208以与野生型HA-Ub相同的模式，而不是通过任何其他链类型，专门促进了K27仅泛素（HA-K27 Ub）对波形蛋白的强健多泛素化（图4小时). 使用K27R泛素突变体的进一步实验表明，在K27R存在下未检测到RNF208诱导的波形蛋白多泛素化，K27R突变体将泛素的赖氨酸27残基突变为精氨酸（HA-K27R Ub），表明RNF208对波形蛋白的多泛素化可能依赖于K27泛素连接链的形成（图第4页). 免疫沉淀分析表明，RNF208过度表达诱导MDA-MB-231细胞内内源性K27连接的波形蛋白多泛素化（补充图^6厘米). 综上所述，我们的结果表明，RNF208通过K27泛素连接的多泛素化降低了波形蛋白的稳定性，使RNF208成为TNBC细胞中新型的波形蛋白负调控因子。

RNF208表达与波形蛋白表达呈负相关

接下来，我们对乳腺癌患者中RNF208和波形蛋白表达之间的相关性进行了调查。为此，我们使用了从韩国首尔国立大学医学院获得的乳腺癌TMA。值得注意的是，RNF208和波形蛋白在管腔亚型癌症患者和TNBC组织中呈负表达（图5a、b). 为了进一步支持这一观察，我们检查了乳腺癌患者的匹配肿瘤样本。事实上，在乳腺癌患者的匹配肿瘤组织中观察到RNF208和波形蛋白表达之间存在显著的反向关系（图5厘米). 此外，在异种小鼠实验中，与对照组织相比，RNF208阳性原发肿瘤组织中的波形蛋白表达降低（图5天). 综上所述，这些结果表明RNF208的表达与波形蛋白介导的乳腺癌细胞的侵袭性癌症进展密切相关。

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图5

乳腺癌患者RNF208的表达与波形蛋白的表达呈负相关。

一典型的IHC图像显示RNF208和波形蛋白在管腔亚型或TNBC患者肿瘤组织中的表达。原始放大倍数，×100。比例尺，50μm。b条堆叠条形图显示了乳腺癌患者TMA中RNF208和Vimentin的表达（RNF208的Luminal(N个 = 189），波形蛋白(N个 = 185）和类似基底的TNBCN个 = 74).P（P）数值采用Fisher精确检验计算。条形图中的数字表示根据IHC强度评分得出的患者人数。c（c）显示乳腺癌患者TMA匹配肿瘤中RNF208和波形蛋白IHC强度的图(N个==========================================================================================================190).P（P）值由配对的双尾Student’st吨测验。d日图中显示RNF208和波形蛋白在原发性肿瘤组织中表达的代表性IHC图像3亿.原始放大倍数，×100。比例尺，50μm。的源数据(b条,c（c）)在源数据文件中可用。

波形蛋白降解需要RNF208的活性

考虑到RNF208包含一个具有泛素化E3连接酶活性的RING结构域，我们假设RNF208的RING域可能与波形蛋白相互作用以促进多泛素化。事实上，免疫沉淀分析表明，波形蛋白特异性结合到RNF208的RING结构域，该结构域具有E3连接酶活性，但不结合到N端和C端区域（补充图^第7页). 与此结果平行，鉴于富含半胱氨酸的基序被称为E3连接酶活性的活性位点，我们还研究了RNF208的活性是否与波形蛋白的多泛素化有关。为此，我们生成了RNF208突变体（C143A、C167A和C186A），其中RNF208环结构域中推测的富含半胱氨酸的基序在不同物种中高度保守（补充图^7亿)，被丙氨酸取代。重要的是，RNF208的非活性突变体没有与波形蛋白结合（图第6页)RNF208的C143A/C167A/C186A（3MT）突变体不能促进波形蛋白的多泛素化（图6b条). 此外，免疫印迹分析表明，Myc-RNF208（3MT）突变体的异位表达不能诱导波形蛋白降解（图6厘米). 因此，RNF208的RING域中的C143、C167和C186位点对波形蛋白的多泛素介导降解至关重要。此外，我们发现RNF208与波形蛋白的头部结构域特异性结合，但不与杆和尾部结构域结合（补充图^第7页c). 基于靶蛋白的赖氨酸残基发生泛素化的事实，我们在波形蛋白的头部结构域中鉴定了一个赖氨酸残留。为了检测该残基是否对RNF208介导的波形蛋白多泛素化至关重要，我们用丙氨酸替换不同物种进化上保守的Lys97，从而生成了一个波形蛋白突变体（K97A）（补充图^7天). 虽然野生型波形蛋白受到RNF208的多泛素化作用，但波形蛋白（K97A）突变体没有经历多泛素作用（图6天). 此外，环己酰亚胺处理表明，在RNF208存在的情况下，波形蛋白（K97A）突变体的稳定性不受影响（图6e、f). 因此，波形蛋白的Lys97残基是RNF208诱导波形蛋白多泛素化以调节其稳定性的主要靶点。

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图6

RNF208 E3连接酶的活性是通过与波形蛋白头部结构域的相互作用对波形蛋白进行多泛素介导降解所必需的。

一MG123处理后，将野生型RNF208或RNA208突变体（C143A、C167A、C186A）质粒与Flag-Vimentin共转染至293T细胞。b条将Flag-Vimentin质粒与HA-Ubiquitin质粒共转染到含有野生型RNF208或RNF208突变株（3MT，C143A/C167A/C186A）的293T细胞后，用抗Flag抗体免疫沉淀细胞裂解物，并用抗HA抗体免疫印迹观察泛素化的Vimentin。c（c）免疫印迹分析显示对照、野生型RNF208和RNF208突变（3MT）过度表达MDA-MB-231细胞中的波形蛋白表达水平。d日在没有或存在Myc-RNF208质粒的情况下，将HA-Ubiquitin质粒与Flag-Vimentin的野生型或赖氨酸突变体（K97A）共转染293T细胞。用抗Flag抗体对细胞裂解物进行免疫沉淀，并用抗HA抗体通过免疫印迹观察泛素化的波形蛋白。e（电子）,（f）在没有或存在Myc-RNF208质粒的情况下，将Flag-Vientin或Flag-Veintin（K97A）质粒共转染到293T细胞中。用环己酰亚胺（CHX，50μg ml）处理细胞⁻¹)在指定的时间内(e（电子）). 使用ImageJ软件对数据进行量化(（f）)β-actin作为内部对照。克用印度墨水染色的代表性全肺图像显示8周后转移性结节，来源于对照侧尾静脉注射，野生型RNF208或RNF208突变型（3MT）-过度表达MDA-MB-231细胞（左）(n个==========================================================================================每组5个）。散点图显示肺转移结节的数量（右）。这个P（P）值由未配对的双尾Student的t吨测验。数据表示平均值±SD。小时具有代表性的IHC图像显示RNF208和Vimentin在肺组织中的表达(克). 原始放大倍数×100。比例尺，50μm。的源数据(克)在源数据文件中可用。中未处理的斑点原始扫描(一−e（电子）)如补充图所示¹³.

接下来，我们使用野生型和过度表达MDA-MB-231细胞的3MT突变体RNF208，研究RNF208 E3连接酶的活性是否直接影响TNBC细胞在体内的转移潜能。有趣的是，RNF208（3MT）突变过度表达MDA-MB-231细胞导致免疫缺陷小鼠的细胞增殖和迁移以及转移性肺结节显著增加，与对照细胞相似（图6克; 补充图⁸). 根据这一观察结果，肺转移组织的免疫组织化学染色显示，RNF208过表达降低了组织切片中波形蛋白的表达水平，而RNF208（3MT）突变并不影响其表达水平（图6小时). 我们进一步研究了在RNF208表达细胞中表达不可降解的K97A突变型波形蛋白是否可以挽救转移表型。我们使用siRNA靶向VIM公司删除对照组和RNF208-过表达MDA-MB-231细胞中内源性波形蛋白水平和过表达野生型波形蛋白或波形蛋白（K97A）突变体。有趣的是，RNF208过表达显著降低了对照细胞和野生型波形蛋白过表达细胞中的细胞迁移，而RNF208过度表达诱导的细胞迁移减少在波形蛋白（K97A）突变过表达细胞（补充图^第九章). 与该观察结果一致，与RNF208或RNF208/野生型波形蛋白过表达细胞相比，注射RNF208/Vimentin（K97A）突变过表达细胞的小鼠的转移性肺结节增加，表明RNF208通过靶向波形蛋白的Lys97残基减少肺转移（补充图^9亿). 总的来说，这些结果表明RNF208 E3连接酶的活性是通过与头部结构域的相互作用实现波形蛋白的多泛素介导降解所必需的，最终减弱TNBC细胞的转移能力。

质粒

通过PCR从MCF-7 cDNA中扩增出全长人RNF208互补DNA（cDNA），并将其亚克隆到生态RI和Xho公司I位点，产生Flag-RNF208和Myc-RNF208。RNF208 cDNA亚克隆到克拉我和不是pEBG-GST（NIH）的I位点。Flag-RNF208或Myc-RNF208被亚克隆到Xho公司我和克拉LPCX载体（NIH）的I位点，分别产生LPCX-Flag-RNF208或LPCX-Myc-RNF208。J.P.（AICT，韩国）善意提供了人类标志-维酮，S.H.P.（韩国成均馆大学）善意提供HA-Ub和HA-Ub突变体（K27/K29/K48/K63）。用PCR从MCF-7细胞基因组DNA中扩增人RNF208启动子，并用HiYield分离^TM（TM）基因组DNA迷你试剂盒（Real Genomics）。扩增的PCR片段被克隆到千磅我和Xho公司pGL3基本载体（Promega）的I位点。补充数据中列出了本研究中PCR扩增的引物序列¹.

稳定细胞系的产生

为了产生逆转录病毒，在转染前24小时将GP2-293细胞接种在100 mm培养板上。使用聚乙烯亚胺（PEI）进行转染，每个平板含有10μg DNA和5μg VSV-g。在敲除实验中，使用PEI转染10μg DNA、10μgΔ8.2和5μg VSV-g前24 h，将Lenti-293细胞接种在100 mm培养板中。转染后，收集含有重组逆转录病毒或慢病毒的条件培养基，并通过0.45μm灭菌过滤器过滤。然后，立即向MDA-MB-231和Hs578T细胞施加3ml过滤后的逆转录病毒，并向T47D细胞添加3ml过滤过的慢病毒，这些细胞在感染前已在100-mm培养皿中培养18小时。将聚brene（Sigma-Aldrich）添加至最终浓度8μg ml⁻¹，上清液与细胞孵育8h。抽吸培养基并用新鲜病毒上清液替换，重复该程序。感染后，将细胞置于新鲜生长培养基中24小时，并像往常一样进行培养。选择2μg ml⁻¹感染48小时后开始注射嘌呤霉素（Sigma-Aldrich）。为了瞬时击倒ERα，使用Lipofectamine®RNAiMAX试剂（Invitrogen）在靶细胞系中转染20μM siESR1 RNA双链体（Bioneer）。

RNA提取、RT-PCR和实时qRT-PCR

根据制造商提供的方案，使用易蓝色总RNA提取试剂盒（Promega）从细胞和组织中分离总RNA。使用2μg纯化RNA，使用M-MLV逆转录酶（Promega，M1705）进行逆转录。用特异性引物PCR扩增合成的cDNA。PCR产物通过1.5%琼脂糖凝胶电泳和Redsafe（Chembio，21141）染色进行可视化，并使用ImageQuant LAS 4000图像分析仪（GE Healthcare）进行分析。18S rRNA基因被用作内部对照。定量实时PCR（qRT-PCR）使用合适的引物，使用2×SYBR Green PCR Master Mix（TaKaRa）进行，由QuantStudio 5（Applied Biosystems）进行。

RNA测序

总RNA用DNase I处理，用miRNEasy Mini Kit（Qiagen）纯化，然后用Agilent 2100生物分析仪（Agilent）检查质量。使用Illumina平台（Illumina）分析具有90bp配对末端文库的转录组。RNA测序数据以登录码存放在基因表达综合数据库（GEO）中{“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE100878”，“term_id”：“100878”}}GSE100878标准.

染色质免疫沉淀

如前所述，使用ERαChIP级抗体（Abcam）进行ChIP分析²⁷特别是，通过生物破坏者TOS-UCW-310-ES对交联细胞进行超声处理（输出功率250W；内部30 s超声处理21个周期，30 s；Cosmo Bio，日本）。引物序列见补充数据¹使用PROMO v3.0.2软件预测RNF208启动子区域的ERE。为了标准化，PCR分析中使用了5%的输入染色质。

CRISPR基因组编辑

为了删除RNF208启动子的−1131/−1124区域，我们使用GeneArt生成了引导RNA（gRNA）^TM（TM）精确gRNA合成试剂盒（invitrogen）符合制造商提供的协议。按照制造商的方案，使用Neon转染系统将gRNA、ssODN和Cas9蛋白（Toolgen）转染MCF-7细胞。为了生成RNF208敲除细胞，我们按照Zhang-lab协议将退火的靶序列寡核苷酸插入PX459载体（Addgene）²⁸细胞感染慢病毒颗粒8 mg ml⁻¹聚乙烯处理。感染后，用正常培养基替换含病毒培养基，然后在2 mg ml中重新选择RNF208敲除细胞⁻¹嘌呤霉素。补充数据中列出了目标序列和ssODN序列信息¹.

人乳腺癌组织芯片与免疫组织化学

1996年1月至2004年12月，经机构审查委员会批准（IRB批准号：3-2013-0268），收集了韩国延世大学医学院江南断流医院手术室的人类乳腺癌组织。所有涉及人类参与者的程序均按照相关道德标准执行。对于免疫组织化学，用兔抗RNF208多克隆抗体（Abcam，ab121658）对每个TMA玻片进行染色，并用苏木精进行复染。染色后，在显微镜下对切片进行评分，并根据乳腺癌亚型分析RNF208和Vimentin的表达水平。

体内肿瘤形成与肺转移

所有程序均由CHA实验动物研究中心（韩国Seongnam）和Woojung生物动物设施（韩国水原）批准。对于肿瘤形成分析，总计1×10⁷将逆转录病毒感染的Hs578T和MDA-MB-231细胞重新悬浮在1:3 PBS/水凝胶（The Well Bioscience）溶液中，并皮下注射到6周龄雌性NOD/ShiLtJ-Rag2em1AMC Il2rgem1AMC（NRGA，Joong-Ah Bio）小鼠中(n个 = 每组6个），以测量肿瘤生长。从注射后4周开始每周监测肿瘤大小，并使用以下公式计算肿瘤体积V（V） = (A类 × B²)/2，其中V（V）是体积（mm^三),A类是长直径（mm），以及B是短直径（mm）。对于肺转移试验，逆转录病毒感染的MDA-MB-231-Luc细胞（1×10⁶)通过尾静脉注射到雌性NOD/SCID小鼠体内。从注射后4周开始每周监测肺转移的发生情况，并使用IVS-200系统（Xenogen Corp）测量生物发光信号。肺部用印度墨水染色，并计数结节进行定量分析。肿瘤组织用10%福尔马林溶液固定，石蜡包埋。玻片切片用所示抗体进行免疫组化染色。

免疫沉淀和免疫印迹分析

细胞在冷PBS中洗涤两次，并在IP缓冲液（50mM Tris，pH 7.4，150mM NaCl，1%Triton X-100，0.5%脱氧胆酸钠，2mM EDTA和10%甘油）加上磷酸酶和蛋白酶抑制剂（Roche）中裂解。将全细胞提取物与适当的一级抗体在4°C下孵育过夜。根据制造商的方案，用Dynabeads（Thermo Fisher Scientific）或谷胱甘肽Sepharose 4B（GE Healthcare）沉淀抗体结合蛋白。用裂解缓冲液洗涤珠子三次，然后在2×SDS样品加载缓冲液中洗脱。通过SDS–聚丙烯酰胺凝胶电泳分离洗脱后的蛋白质，转移到PVDF膜（Millipore），并使用适当的一级抗体与辣根过氧化物酶结合的二级抗体通过化学发光检测（GE Healthcare）。兔抗RNF208抗体（ab175506，稀释度1:1000）、泛素抗体（链接特异性K27）（ab181537，稀释度1-1000）和鼠抗波形蛋白[V9]抗体（ab8069，稀释度1:1000）、波形蛋白[RV202]抗体（ab8978，稀释度:1000）和ERα[E115]抗体（ab 32063，稀释度1:2000）均来自Abcam。抗泛素（sc-8017，稀释度1:1000）、GST[B-14]（sc-138，稀释度1:2000）和Myc[9E10]（sc-40，稀释度1:2000）的小鼠抗体以及抗p-波形蛋白S39（sc-16673，稀释度1-500）和HA[Y-11]（sc-805，稀释度1-1000）的兔抗体来自圣克鲁斯。针对Flag[M2]（F3165，稀释度1:5000）和β-肌动蛋白[AC-74]（A5316，稀释度1:10000）的小鼠抗体来自Sigma。抗E-cadherin的小鼠抗体（610181，稀释度1:1000）来自BD Biosciences，抗Cleaved Caspase-3的兔抗体（#9664，稀释度1-1000）来自Cell Signaling。为了分离可溶性/不溶性蛋白质，使用RIPA缓冲液[20 mM Tris-HCl（pH 7.5）溶解细胞裂解液。150 mM氯化钠，1 mM钠₂EDTA公司。1 mM EGTA。1%NP-40]并分离上清液和颗粒。在95°C下煮沸5 min后，在2×SDS样品加载缓冲液中洗脱不溶蛋白。使用的主要抗体在补充数据中列出².

蛋白质相互作用分析的交联

如前所述，对RNF208过度表达的Hs578T细胞进行交联以进行质谱分析²⁹特别是，将细胞固定在PBS中1%的甲醛中。将洗脱的蛋白质装载在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上并通过电泳分离。凝胶上的交联蛋白用考马斯蓝（Tech&Innovation）染色，并在韩国大田基础科学研究所（Korea Basic Science Institute，Korea）通过质谱分析。补充数据中列出了RNF208绑定合作伙伴候选^三.

体外泛素化测定

将Flag-Vimentin、Myc-RNF208和HA-Ub质粒转染至293T细胞，并在细胞收获前6 h添加10μM MG132。然后，在SDS裂解缓冲液中裂解293T细胞[10 mM Tris-HCl（pH 8.0）、150 mM NaCl、1%SDS、5 mM NEM、蛋白酶抑制剂]。将裂解物煮沸10 min，并用稀释缓冲液[10 mM Tris-HCl（pH 8.0）、150 mM NaCl、1%Triton X-100]稀释10倍。在4°C下用Flag（Sigma-Aldrich）将蛋白裂解物旋转过夜。用Dynabeads沉淀抗体结合蛋白（Thermo Fisher Scientific）。用洗涤缓冲液A[10 mM Tris-HCl（pH 8.0）、150 mM NaCl、1%Triton X-100、0.1%SDS]洗涤沉淀物一次，用洗涤缓冲溶液B[10 mM-Tris-HCl（pH8.0），150 mM氯化钠、1%Trion X-100]洗涤两次。蛋白质在2×SDS样品加载缓冲液中洗脱，并进行Western blot分析。

荧光素酶检测

RNF208（参考编号208）使用FuGENE HD（Promega）将启动子萤光素酶转染到MCF-7或T47D细胞中。根据制造商的协议，使用荧光素酶检测系统试剂盒（Promega）分析荧光素素酶活性。所有检测均一式三份，荧光素酶活性与β-半乳糖苷酶活性进行标准化。

细胞迁移和侵袭检测

按照制造商的方案，使用透明PET膜插入物（Falcon，353097）进行Transwell迁移分析。总计5×10⁴按照制造商的方案，用BioCoat Matrigel侵入室（Corning，354578）进行侵入分析。细胞在没有FBS的DMEM培养基中饥饿24小时。饥饿的细胞（1×10⁵)在含有无血清DMEM的顶室中接种，在含有10%FBS的底室中接种。培养24小时后，用棉签去除非侵入性细胞。通过膜迁移并粘附在膜下表面的细胞用70%乙醇固定，并用0.05%结晶紫染色。对每个视野中的侵入细胞数量进行量化以进行统计分析。

伤口愈合试验

细胞接种1×10⁵细胞在六孔板中正常培养18小时。p200尖端用于细胞刮除和创面。刮除后，将细胞在低血清培养基（含1%FBS）中培养指定时间。为了比较伤口愈合率，在创面形成后立即使用带×20物镜的倒置荧光显微镜（Nikon Ti-E H600L）拍摄0h图像。根据拍摄的图像在指定时间计算伤口愈合百分比。通过ImageJ测量虚线区域之间的细胞迁移面积，并将其归一化为对照细胞。

统计学和再现性

本研究使用GraphPad Prism 5和SPSS版本18软件计算统计显著性。使用log-rank Mantel−Cox检验分析预测乳腺癌患者无复发生存率的意义。采用单因素方差分析（ANOVA）比较GDC数据集中不同乳腺癌亚型。对于所有其他比较，未配对的双尾学生t吨使用了测试。P（P） < 0.05被认为具有统计学意义。所有实验至少重复三次。没有使用统计方法预先确定样本量。样本量是根据该领域的文献选择的。

这项工作得到了大韩民国卫生和福利部癌症控制国家研发计划的资助（HA17C0037）。K.-M.Y是由教育部资助的韩国国家研究基金会拨款（NRF-2017R1D1A1B03035390）的接受者。