氧化介质细胞Longev。2019; 2019: 7591840.
白藜芦醇通过PI3K/Akt介导的Nrf2信号通路减轻氧化应激诱导的肠屏障损伤
,1,2 ,1 ,1 ,1 ,
1和1,三 于庄
1湖南省动物肠道生态与健康国际联合实验室，湖南师范大学生命科学学院动物营养与人类健康实验室，湖南长沙，410081
2江西省动物健康重点实验室，江西农业大学动物科学技术学院动物种群健康研究所，地址：中国江西省南昌市经济技术开发区志民大道1101号，邮编：330045
吴惠荣
1湖南省动物肠道生态与健康国际联合实验室，湖南师范大学生命科学学院动物营养与人类健康实验室，湖南长沙，410081
王祥祥
1湖南省动物肠道生态与健康国际联合实验室，湖南师范大学生命科学学院动物营养与人类健康实验室，湖南长沙，410081
何解玉
1湖南省动物肠道生态与健康国际联合实验室，湖南师范大学生命科学学院动物营养与人类健康实验室，湖南长沙，410081
何善平
1湖南省动物肠道生态与健康国际联合实验室，湖南师范大学生命科学学院动物营养与人类健康实验室，湖南长沙，410081
尹玉龙
1湖南省动物肠道生态与健康国际联合实验室，湖南师范大学生命科学学院动物营养与人类健康实验室，湖南长沙，410081
三中国湖南省长沙市，中国科学院亚热带农业研究所，农业部中南部动物营养与饲料科学科学观察与实验站，亚热带农牧科学人类工程与研究中心，亚热带农业生态加工重点实验室
1湖南省动物肠道生态与健康国际联合实验室，湖南师范大学生命科学学院动物营养与人类健康实验室，湖南长沙，410081
2江西省动物健康重点实验室，江西农业大学动物科学技术学院动物种群健康研究所，地址：中国江西省南昌市经济技术开发区志民大道1101号，邮编：330045
三中国湖南省长沙市，中国科学院亚热带农业研究所，农业部中南部动物营养与饲料科学科学观察与实验站，亚热带农牧科学人类工程与研究中心，亚热带农业生态加工重点实验室
通讯作者。 特约编辑：雷浩
2019年3月10日收到；2019年7月31日修订；2019年11月5日验收。
这是一篇根据知识共享署名许可证发布的开放存取文章，该许可证允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制原始作品，前提是正确引用了原始作品。
摘要
氧化应激与多种肠道疾病有关，并与其病理过程密切相关。白藜芦醇（RSV）是一种植物提取物，在保护各种器官方面发挥着重要作用在体外和体内然而，RSV的益处存在争议，其对肠上皮细胞抗氧化作用的潜在机制尚不清楚。在这项研究中，我们评估了呼吸道合胞病毒对H诱导的氧化应激的影响2O（运行）2在IPEC-J2细胞中。我们发现RSV预处理显著提高了细胞活力；紧密连接（TJ）蛋白（克劳丁-1、闭塞素和ZO-1）表达水平增加；提高超氧化物歧化酶-1（SOD-1）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活性；降低H诱导的细胞内活性氧（ROS）水平和细胞凋亡2O（运行）2(对< 0.05). 此外，RSV以剂量依赖性方式上调Akt磷酸化、Nrf2磷酸化和抗氧化基因HO-1、SOD-1和CAT的表达水平(对<0.05）。短发夹RNA（shRNA）对Nrf2的敲除消除了RSV介导的H2O（运行）2-诱导细胞凋亡、RSV诱导TJ蛋白水平升高和抗氧化基因表达（SOD-1、CAT和GSH-Px）(对< 0.05). 与Nrf2基因敲除一致，PI3K/Akt抑制剂LY294002显著抑制了RSV诱导的Nrf2磷酸化和RSV诱导TJ蛋白水平的增加，以及H2O（运行）2处理(对< 0.05). 总之，这些结果表明，RSV可以通过PI3K/Akt介导的Nrf2信号通路直接保护IPEC-J2细胞免受氧化应激，这表明RSV可能是一种有效的饲料添加剂，可防止牲畜生产中的肠道损伤。
1.简介
肠道不仅是营养物质的主要消化和吸收器官，而且还对来自肠道环境的毒素、病原体和抗原起着选择性屏障的作用[1]. 肠屏障主要由紧密连接蛋白（TJs）、肠细胞膜、抗菌肽、粘膜和免疫系统组成。当肠屏障被破坏时，管腔毒素和抗原将通过屏障穿透上皮下组织，引起粘膜氧化应激和全身炎症反应[1]. 同时，活性氧（ROS）和促炎性细胞因子的过度产生会破坏肠道屏障和功能障碍。然而，由于肠道的复杂生理和/或化学环境，它极易受到氧化应激的影响。
氧化应激是指抗氧化系统和氧化系统之间的失衡，导致活性氧过量，可破坏细胞信号和功能。据信，氧化应激与炎症性肠病（IBD）、肠易激综合征和结肠癌等肠道疾病的发生有关[2–5]. 在生理条件下，活性氧维持在一定水平，过多的自由基通常被超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPH-Px）等抗氧化酶清除。然而，在抗氧化剂和氧化系统之间的失衡情况下，过量的活性氧可通过减少紧密连接和细胞数量来干扰上皮细胞的完整性和肠屏障[6]. 最近的研究表明，活性氧或其他自由基可以通过影响转录因子和氧化还原敏感信号通路来干扰细胞功能。核因子类红细胞2相关因子2（Nrf2）是一种转录因子，通过诱导抗氧化剂和2相解毒酶及相关蛋白的表达，对氧化状态具有重要的调节作用[7,8]. 就活性氧在肠损伤中的可能重要性而言，细胞有效上调抗氧化剂、减少活性氧的生成和清除自由基至关重要，自由基可能有助于增加肠通透性和上皮细胞凋亡。
植物提取物被认为是抗氧化剂和抗炎分子的潜在来源，这些抗氧化剂和消炎分子已被确定并建议作为对抗氧化应激相关疾病的治疗剂[9]. 白藜芦醇（RSV）是一种植物源二苯乙烯（多酚），具有广泛的健康益处[10–13]. 许多研究表明RSV作用于多个细胞靶点，如Nrf2、NF-Kβ、Sirt1和AMPK来控制与减少氧化应激、细胞凋亡和抗癌作用相关的过程和信号通路[1,14–16]. 然而，由于RSV的生物利用度低，有关饮食RSV健康效应的科学研究一直存在争议体内[17]. 靶组织中RSV的剂量极低，很难达到在体外研究[18]. 尽管RSV的功能仍存在争议，但我们假设RSV可以通过其在肠细胞中的快速代谢直接保护肠道免受氧化应激。因此，我们使用了在体外H诱导的氧化应激模型2O（运行）2研究RSV能否预防肠道损伤。我们的结果为RSV作为饲料添加剂在畜牧生产中防止肠道损伤的未来应用提供了见解。
2.材料和方法
2.1、。化学品和试剂
细胞培养所需的Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM）、胎牛血清（FBS）和抗生素（青霉素和链霉素）均来自Gibco（加利福尼亚州卡尔斯巴德，美国）。白藜芦醇（RSV）和LY294002（PI3K/Akt抑制剂）从Selleckchem（美国休斯顿）获得。针对Nrf2、Keap1和β-肌动蛋白来自Abcam，抗claudin-1和clodin抗体来自Selleckchem（美国休斯顿），抗ZO-1抗体来自Proteintech（中国武汉）。质粒pLKO.1、pLKO-scraft、pCMV-DR8.9和pCMV-VSVG是冯平慧教授（美国南加州大学）赠送的礼物。
2.2. 细胞培养
猪肠上皮细胞（IPEC-J2细胞）和人胚胎肾293（HEK293T）细胞由美国德克萨斯农工大学吴国耀教授提供。所有细胞均在含有10%热灭活胎牛血清（FBS；Gibco）的Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM；Gibco's modified Eagle's medium）中培养，并保持在37°C和5%CO2.
2.3. Nrf2-Knockdown IPEC-J2细胞系的建立
短螺旋RNA（shRNAs）是使用在线shRNA设计工具设计的(https://portals.broadinstitute.org/gpp/public网站/)并通过Age I/EcoR I克隆到慢病毒载体pLKO.01中。质粒pLKO-shNrf2或pLKO-Scraft、pCMV-DR8.9和pCMV-VSVG转染293T细胞产生慢病毒。在转染后48小时，收集慢病毒，并用其在聚brene（8μg/mL）。感染后48小时，选择感染细胞并用嘌呤霉素（2μg/mL）。shRNAs的序列如所示.
表1
| 姓名 | 发夹RNA序列 |
|---|
| shNRF2-传感器 | CCGGCATACTTTGGAGGCAAGATATCGATATCTGCCTCCAAAGTTTTTG |
| shNRF2-反义 | AATTCAAAAAACATACTTGGAGGCAAGATATCCGAGATATCTGCCTCAAGATATG |
2.4. 细胞活力分析
根据制造商的说明，使用CCK-8分析（熊本Dojindo）评估细胞活力。简单地说，IPEC-J2细胞在96个板中以8×10的密度培养4每个孔的细胞数。第二天，用含有不同浓度H的培养基处理细胞2O（运行）2持续4小时，然后检测细胞活力。呼吸道合胞病毒在H前处理6小时2O（运行）2以及浓度为25的LY294002（PI3K抑制剂）μM在H之前预处理2小时2O（运行）2和RSV治疗[19].
2.5. T-SOD、CAT和GSH-Px活性分析
用0浓度的RSV预处理IPEC-J2细胞μM、 25个μM、 和50μM持续6小时，然后用或不用400处理μ月H2O（运行）2按照说明，使用商业检测试剂盒（中国南京建成）对各组细胞进行裂解，以测定T-SOD、CAT和GSH-Px的活性。计算T-SOD、CAT和GSH-Px的活性，并将其表达为U/mg蛋白。
2.6. ROS产生的测量
使用商业ROS检测试剂盒（中国Beyotime）测量细胞内ROS的相对水平。简单地说，IPEC-J2细胞在处理前在6孔板中培养16小时，用RSV（0μM、 25个μM、 和50μM） 4小时，然后用H暴露2O（运行）2(500 μM） 诱导活性氧生成4小时。用PBS清洗细胞两次，然后用5μM 2′，7′-二氯荧光素二乙酸酯（DCFHDA）30分钟。使用荧光微孔板阅读器（Tecan，Sunrise）在525/610 nm的激发/发射波长下测量荧光强度。
2.7条。膜联蛋白V-FITC/碘化丙锭（PI）凋亡检测
使用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒（KeyGEN，南京，中国）测定细胞凋亡。简单地说，IPEC-J2细胞在处理前在6孔板中培养16小时，用Ly294002预处理，然后用RSV（0μM、 25个μM、 和50μM） 或H2O（运行）2根据实验设计。在每次特定处理后，收集细胞，用冰镇PBS清洗两次，然后以2000 rpm离心5分钟。细胞在500 rpm内再次悬浮μL的1x结合缓冲液并转移至无菌流式细胞仪玻璃管。5 μAnnexin V-FITC和5的Lμ添加L PI，并在室温（25°C）和黑暗条件下培养样品10分钟。最后，根据制造商的说明（美国加利福尼亚州富勒顿贝克曼）进行流式细胞术分析。
2.9. Western Blot分析
根据实验设计，用指示的试剂处理细胞，并用RIPA缓冲液（Beyotime）裂解以提取细胞总蛋白。根据说明，使用BCA蛋白质检测试剂盒（中国贝尤泰姆）对蛋白质浓度进行量化。如前所述进行Western blot分析。所示蛋白质标准化为β-肌动蛋白，并使用ImageJ（美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院）进行分析。
3.统计分析
三个独立实验的代表性结果表示为平均值±平均值标准误差（SEM）。采用单因素方差分析（ANOVA）和LSD检验进行多重比较，结果为对<0.05被认为具有统计学意义。统计分析由GraphPad Prism 7进行。
4.结果
4.1. H的浓度依赖效应2O（运行）2和RSV对细胞活性的影响
确定合适的H浓度2O（运行）2在随后的实验中，我们用不同浓度的H处理IPEC-J2细胞2O（运行）2或RSV，并通过CCK-8分析测定处理细胞的活性。如所示高浓度RSV对IPEC-J2细胞有轻微抑制作用，RSV在200℃和200℃时均显著降低IPEC-J1细胞的活力μM和400μM持续6小时(). H治疗2O（运行）2与对照组相比，4h后细胞明显收缩。我们发现浓度为500μ月H2O（运行）2与对照组相比，细胞活力急剧下降至40%(). 呼吸道合胞病毒预处理（20μM、 50个μM） 显著减弱500μ月H2O（运行）2以剂量依赖的方式(). 根据这些结果，我们使用了500μ月H2O（运行）2诱导氧化应激并使用20μM或50μM RSV在随后的实验中。
呼吸道合胞病毒和H的影响2O（运行）2关于IPEC-J2细胞的生存能力。（a） 将IPEC-J2细胞与增加浓度的RSV孵育6 h（a）和h2O（运行）2持续4h（b），然后通过CCK-8分析测定细胞活力。结果显示为与对照组（0μM） ●●●●。数值为平均值±SE；n个= 8. 星号表示与对照组相比有显著差异(对< 0.05).
RSV对H的保护作用2O（运行）2-诱导IPEC-J2细胞氧化损伤。用指示浓度的RSV预处理IPEC-J2细胞，然后与200μM或500μ月H2O（运行）2持续4小时。（a） 在与RSV（6 h）和h孵育后，对IPEC-J2细胞进行CCK-8检测2O（运行）2（4小时）。（b，c）采用Annexin V和碘化丙啶（PI）双重染色，通过流式细胞术分析凋亡细胞。结果显示为与对照组（0μM） ●●●●。数值为平均值±SE。上标大写字母相同的列和上标大写字符不同的列表示无显著差异(对>0.05）和显著差异(对<0.05）。
4.2. 白藜芦醇提高IPEC-J2细胞中TJ mRNA的表达
肠道的完整性依赖于紧密连接。紧密连接（TJ）是肠屏障功能的主要决定因素，它封闭相邻上皮细胞之间的细胞旁间隙。在这里，我们检测了经或不经RSV和/或H处理的IPEC-J2细胞单层中TJ mRNA的表达2O（运行）2。如所示qRT-PCR结果显示，用H2O（运行）2与对照组相比()而RSV联合治疗逆转了H2O（运行）2-诱导TJ蛋白（克劳丁-1、闭塞素和ZO-1）下调。Western blot检测的蛋白水平（claudin-1、clodin和ZO-1）与TJ蛋白的mRNA水平一致().
白藜芦醇和/或H的作用2O（运行）2TJ蛋白水平。用指示浓度的RSV预处理IPEC-J2细胞，然后与500μ月H2O（运行）2持续4小时。（a） 采用实时定量PCR（qRT-PCR）检测claudin-1、clodin和ZO-1的表达。数据显示为标准化后处理细胞中靶基因转录物的丰度与对照细胞中靶基因转录物的丰度之比β-肌动蛋白。（b） 用蛋白质印迹法检测claudin-1、occludin和ZO-1的蛋白质水平β-肌动蛋白作为负荷控制。数值为平均值±SE；n个= 3. 相同上标大写字母和不同上标大写字符的列表示无显著差异(对>0.05）和显著差异(对<0.05）。
4.3. 白藜芦醇提高IPEC-J2细胞抗氧化能力及抗氧化基因表达
抗氧化酶的活性和表达是减轻器官或细胞氧化应激损伤的主要反应。如所示，单独用RSV处理的细胞之间没有发现显著的ROS差异，而RSV显著降低了H2O（运行）2-以剂量依赖的方式处理细胞(). 结果表明，RSV显著提高了经或不经H处理的细胞中T-SOD、CAT和GSH-Px的活性2O（运行）2（图–). qRT-qPCR结果显示高浓度的H2O（运行）2显著降低SOD-1、GSX-1、过氧化氢酶（CAT）和HO-1基因的表达，而RSV逆转了H2O（运行）2-诱导SOD-1、CAT、GSX-1和HO-1基因下调（图–).
白藜芦醇和/或H的作用2O（运行）2IPEC-J2细胞中ROS水平和T-SOD、CAT和GSH-Px活性。用0浓度的RSV预处理IPEC-J2细胞μM、 20个μM、 和50μM培养6小时，然后与500μM小时2O（运行）2持续4小时。（a） ROS的荧光强度由荧光微孔板阅读器测量。（b–d）在指示浓度下用或不用RSV预处理细胞6小时，然后在h的存在下孵育2O（运行）2浓度为500μM、 使用商用试剂盒用分光光度计检测细胞裂解液中T-SOD（b）、CAT（c）和GSH-Px（d）的活性。数值为平均值±SE；n个= 6. 相同上标大写字母和不同上标大写字符的列表示无显著差异(对>0.05）和显著差异(对<0.05）。
白藜芦醇和/或H的作用2O（运行）2IPEC-J2细胞中SOD-1、CAT、GSX-1和HO-1的表达。用指示浓度的RSV预处理IPEC-J2细胞6小时，然后与500μ月H2O（运行）2持续4小时。用qRT-PCR检测SOD-1（a）、CAT（b）、GSX-1（c）和HO-1（d）的表达。数据显示为处理细胞中的目标基因转录物丰度与对照细胞中的靶基因转录物的丰度之比β-肌动蛋白。数值为平均值±SE；n个= 6. 相同上标大写字母和不同上标大写字符的列表示无显著差异(对>0.05）和显著差异(对<0.05）。
4.4. 白藜芦醇保护IPEC-J2细胞抵抗H2O（运行）2-通过Nrf2/Keap1通路诱导屏障功能障碍
鉴于RSV是一种有效的抗氧化剂，可以促进抗氧化基因的表达，我们研究了RSV是否通过Akt和Nrf2/Keap1信号通路减轻氧化应激，这是参与细胞生存和氧化应激反应的关键细胞级联反应。qRT-qPCR结果显示H2O（运行）2治疗显著降低了Nrf2和Keap1基因的表达，而RSV显著逆转了H2O（运行）2-诱导Nrf2和Keap1基因下调(). Western blot分析表明，RSV以剂量依赖的方式增强了Nrf2和Akt的磷酸化(对<0.05），而Nrf2、Keap1和Akt的蛋白水平没有显著变化().
白藜芦醇和/或H的作用2O（运行）2IPEC-J2细胞中的Akt和Nrf2/Keap1通路。用指示浓度的RSV预处理IPEC-J2细胞6小时，然后与500μM小时2O（运行）2持续4小时。（a） 用qRT-PCR检测Nrf2和Keap1的表达。数据显示为处理细胞中的目标基因转录物丰度与对照细胞中的靶基因转录物的丰度之比β-肌动蛋白。（b） Western blot检测Keap1、Nrf2、Akt、p-Nrf2和p-Akt的蛋白水平β-肌动蛋白作为负荷控制。（b） 蛋白质水平被量化，数据表示为平均值+SD。上标大写字母相同的列和上标大写字符不同的列的平均值没有显著差异(对>0.05）和显著差异(对<0.05）。
4.5. Nrf2在RSV诱导的氧化应激细胞保护中的作用
确认Nrf2在保护IPEC-J2细胞抵抗H2O（运行）2-在诱导氧化应激的情况下，我们通过shRNA沉默了IPEC-J2细胞中Nrf2基因的表达，然后用RSV和/或H处理Nrf2敲除细胞2O（运行）2，然后测定细胞活力、细胞凋亡和抗氧化基因的表达。shRNA对Nrf2的敲除在很大程度上消除了RSV预处理基于细胞活力和抗氧化基因表达变化的有益影响。qRT-PCR分析表明，敲除IPEC-J2细胞中的Nrf2可显著降低细胞活力()SOD-1、CAT、克劳丁-1、闭塞素和ZO-1的mRNA表达（图和)并废除RSV对细胞凋亡的保护作用()氧化应激。Western blot分析表明，Nrf2的敲除显著降低了Nrf2（p-Nrf2）的磷酸化/β-肌动蛋白）与氧化应激对照组（SC组）比较。然而，与对照组相比，Nrf2敲除细胞中Akt的磷酸化没有受到影响().
白藜芦醇对H的影响2O（运行）2-诱导Nrf2-knowdown IPEC-J2细胞的细胞毒性。用或不用50μM RSV培养6小时，然后与500μ月H2O（运行）2持续4小时。（a） 使用CCK-8分析测定细胞活力。结果显示为与对照组（0μM） ●●●●。（b，c）用qRT-PCR检测SOD-1、CAT、claudin-1、clodin和ZO-1的相对表达。数据显示为处理细胞中的目标基因转录物丰度与对照细胞中的靶基因转录物的丰度之比β-肌动蛋白。（d） 采用Annexin V-PI双重染色，流式细胞术分析凋亡细胞。（e） 用Western blot检测Nrf2、Akt、p-Nrf2和p-Akt的蛋白水平β-肌动蛋白作为负荷控制。数值为平均值±SE。具有相同上标大写字母和不同上标大写字母的列表示没有显著差异(对>0.05）和显著差异(对<0.05）。
4.6. PI3K/Akt在RSV诱导的氧化应激细胞保护中的作用
检测Akt在RSV诱导的H细胞保护中的作用2O（运行）2-诱导氧化应激，我们用PI3K/Akt抑制剂LY294002预处理细胞，然后用RSV和/或H处理这些细胞2O（运行）2我们发现LY294002消除了RSV对H的保护作用2O（运行）2-诱导细胞活性下调()，抗氧化基因()，和TJ蛋白水平()和H2O（运行）2-诱导细胞凋亡(). 此外，与对照组相比，LY294002处理降低了Akt、Nrf2、p-Akt和p-Nrf2的蛋白水平().
RSV和选择性抑制剂LY294002对H的影响2O（运行）2-诱导IPEC-J2细胞的细胞毒性。用25μM LY294002 2小时，然后用50μM RSV与500孵育前4小时μ月H2O（运行）2持续4小时。（a） 使用CCK-8分析测定细胞活力。结果显示为与对照组（0μM） ●●●●。（b，c）用qRT-PCR检测SOD-1、CAT、claudin-1、clodin和ZO-1的相对表达。数据显示为处理细胞中的目标基因转录物丰度与对照细胞中的靶基因转录物的丰度之比β-肌动蛋白。（d） 采用Annexin V-PI双重染色法对凋亡细胞进行流式细胞术分析。（e） 用Western blot检测Nrf2、Akt、p-Nrf2和p-Akt的蛋白水平β-肌动蛋白作为负荷控制。数值为平均值±SE。上标大写字母相同的列和上标大写字符不同的列表示无显著差异(对>0.05）和显著差异(对<0.05）。
5.讨论
肠道是营养物质的主要消化和吸收器官，对内源性和外源性抗原具有选择性屏障作用。大量研究表明，肠道健康，尤其是肠道屏障的完整性，在维持机体健康状态方面起着至关重要的作用。氧化应激是肠道疾病中肠屏障破坏的关键因素。因此，鉴定合适的植物提取物作为对抗氧化应激相关疾病的治疗剂是目前的研究热点。在本研究中，IPEC-J2细胞暴露于H2O（运行）2诱导氧化应激。我们发现H2O（运行）2治疗导致细胞活力和TJ蛋白表达降低，ROS过度产生，氧化和抗氧化障碍，最后诱导细胞凋亡。此外，结果还表明RSV显著降低了H2O（运行）2-通过增加细胞活力和上调抗氧化基因的表达诱导细胞损伤。
作为一种膳食补充剂，RSV是一种多酚化合物，包含在各种水果和草药中。自从RSV被证实具有多种生物功能（抗氧化、抗炎、抗癌等）以来，它的实际应用受到了极大的关注[10,11,20–22]. 在本研究中，我们的结果表明，白藜芦醇能有效保护IPEC-J2细胞免受氧化应激诱导的肠道损伤，且毒性较低。小肠是RSV吸收和代谢的主要场所；因此，我们假设肠道上皮可能是呼吸道合胞病毒有益作用的潜在靶点，尽管肠道和微生物会产生第一次通过效应。同时，在许多情况下，如缺血/再灌注损伤模型和LPS诱导模型，研究了呼吸道合胞病毒的抗炎和抗氧化作用[23,24]. 然而，根据现代医学观点，氧化应激在许多疾病（如肠道炎症）的进展中起着关键作用。肠道完整性是肠道功能的基本保证。肠完整性依赖于TJ，TJ是肠屏障功能的主要决定因素，它封闭相邻上皮细胞之间的细胞旁间隙[25,26]. 阻塞蛋白、克劳丁和ZO-1是主要的肠屏障蛋白[27]. 在本研究中，ZO-1、闭塞素和克劳丁-1的表达在H2O（运行）2治疗，而RSV通过上调H2O（运行）2-诱导的氧化应激。此外，结果表明RSV显著降低了H2O（运行）2-通过提高IPEC-J2细胞的活性和降低凋亡率诱导细胞损伤。很容易推测RSV主要通过上调氧化状态来减轻肠道损伤，尤其是屏障破坏。
氧化应激是由于亲氧化因子和抗氧化因子之间的不平衡造成的。生物体或细胞具有抗氧化系统，包括SOD、过氧化氢酶和GSH过氧化物酶，以清除过量产生的ROS。本研究表明，RSV能上调过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH过氧化物酶）的活性，并在H2O（运行）2-诱导的氧化应激或正常状态。一方面，RSV可以通过上调抗氧化酶活性直接清除自由基在体外和体内[21,28]. Wang和他的同事表明RSV可以保护Caco-2细胞抵抗H2O（运行）2-通过降低丙二醛水平和细胞内ROS积累诱导氧化损伤。据报道，RSV通过上调哺乳仔猪的SOD和GSH-Px活性来改善线粒体的生物生成和氧化还原状态[29]. 另一方面，在许多研究中，RSV还可以上调抗氧化基因的表达，这与我们的结果一致。在本研究中，RSV增加了SOD、GSXs和HO-1的表达。在细胞内抗氧化系统中，HO-1、SOD、CAT和GPX是2期基因，被称为Nrf2/Keap1信号通路介导的靶基因。同时，许多研究表明，RSV通过上调HO-1表达来减轻氧化应激诱导的肠功能障碍[30]. 抗氧化基因的上调是细胞对氧化应激的适应，主要或部分受Nrf2途径的调节[31].
Nrf2是细胞内氧化应激的关键传感器，是一种转录因子，在调节抗氧化剂和2相解毒酶及相关蛋白中起着核心作用[32]. Keap1与细胞质中的Nrf2结合，促进Nrf2泛素化，从而在生理条件下防止Nrf2移位到细胞核[33]. 当细胞内ROS水平急剧增加时，过量产生的ROS修饰Keap1上的反应性半胱氨酸残基，然后Keap1与Nrf2解离，导致Nrf2易位到细胞核中并表达其靶基因[33,34]. 最近的研究表明，Nrf2的磷酸化促进Keap1/Nrf2解离和Nrf2核移位。在本研究中，RSV以剂量依赖性的方式上调p-Nrf2和p-Akt的水平，表明RSV可能通过激活Nrf2信号通路来减轻氧化状态。许多研究表明，RSV治疗显著上调Nrf2和HO-1的表达体内和在体外[35,36]. 此外，Nrf2基因敲除抑制了RSV诱导的抗氧化基因和肠上皮细胞屏障的上调，表明Nrf2可能是RSV缓解氧化应激的主要靶点。然而，在我们的研究中，RSV处理后Akt蛋白的磷酸化水平增加。PI3K/Akt信号通路通常参与不同类型反应性ROS损伤细胞中Nrf2依赖性转录[37,38]. Han的研究表明，绿原酸通过PI3K/Akt介导的Nrf2信号通路诱导HO-1表达，保护MC3T3-E3细胞免受氧化应激，提示Nrf2可能是PI3K/Akt的下游信号靶点[19]. 因此，Western blot分析表明，特异性PI3K/Akt抑制剂抑制了RSV诱导的Nrf2磷酸化水平的增加{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“LY290042”，“term_id”：“1257839980”，“term_text”：“LY290042“}}LY290042号此外，RSV诱导的细胞活力、细胞凋亡、抗氧化基因和TJ表达的变化也受到抑制剂的抑制。这些结果类似于Nrf2敲低对IPEC-J2细胞的作用。此外，当Nrf2被敲除时，Akt的磷酸化水平没有受到影响。这表明PI3K/Akt途径在RSV诱导的Nrf2活化对氧化应激的细胞保护作用中起着关键作用。
总之，本研究结果为RSV对H的潜在细胞保护作用提供了重要证据2O（运行）2-诱导肠屏障功能障碍。RSV预处理通过促进抗氧化系统的活性、降低细胞内ROS和凋亡率以及上调肠屏障来保护IPEC-J2细胞免受氧化应激。RSV的这些细胞保护作用至少部分依赖于PI3K/Akt介导的Nrf2信号通路。
致谢
本研究得到了中国博士后科学基金（2017M612562）、中国科学院前沿科学重点研究项目（QYZDY-SSW-SMC008）、湖南省科技计划（2017XK2020）、湖南师范大学潇湘学者特聘教授基金、，国家千人计划、湖南百人计划。
数据可用性
用于支持本研究结果的数据可根据要求从相应作者处获得。
工具书类
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