循环。作者手稿；PMC 2019年11月1日提供。
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血管紧张素转换酶抑制剂
一种新的作用机制
高血压和血管研究部（H.P.，O.A.C.，N.V.，T.-D.L.，A.M.，N.-E.R.）和生物统计和研究流行病学部（E.L.P.），Henry Ford Hospital，Detroit，Mich。
致密歇根州底特律市W Grand Blvd 2799号E&R 7015室亨利福特医院高血压和血管研究部FAHA博士Nour Eddine Rhaleb。1belahrn处的gro.shfh 摘要
背景-
血管紧张素转换酶（ACE）抑制剂是治疗高血压、心力衰竭和其他心血管和肾脏疾病的有价值的药物。ACE抑制剂的心脏保护作用是通过阻断血管紧张素（Ang）I向Ang II的转化和激酶水解来介导的。在这里，我们报道了一种新的机制，该机制可能解释ACE抑制的心脏抗纤维化作用，包括阻断N-乙酰-芳基-天冬氨酰-赖氨酰-脯氨酸（Ac-SDKP）的水解。
方法和结果-
为了研究Ac-SDKP在ACE抑制剂卡托普利治疗效果中的作用，我们使用了血管紧张素Ⅱ诱导的大鼠高血压模型，该模型接受ACE抑制剂单独或与Ac-SDKP的阻断单克隆抗体（mAb）联合治疗。这些高血压大鼠有左心室肥厚（LVH）以及心肌纤维化、细胞增殖、转化生长因子增加-β（转化生长因子-β)转化生长因子作用的信号介质Smad2（P-Smad2）的表达和磷酸化-βACE抑制剂既没有降低血压，也没有降低LVH；然而，它显著降低了LV胶原，从13.3±0.9降至9.6±0.6μ克/毫克干重(P（P）<0.006），mAb（12.1±0.6；P（P）<0.034，ACE抑制剂vs.ACE抑制剂+单克隆抗体）。此外，间质胶原体积分数和血管周围胶原（苦味酸红染色）的分析显示出非常相似的趋势。同样，ACE抑制剂显著降低LV单核细胞/巨噬细胞浸润、细胞增殖和TGF-β并且这些作用被mAb阻断。Ang II增加Smad2磷酸化3.2±0.9倍；ACE抑制剂将其降低至0.6±0.1倍(P（P）<0.001），而单克隆抗体阻止了这一下降至2.1±0.3(P（P）<0.001，ACE抑制剂与ACE抑制剂单克隆抗体）。当ACE抑制剂被Ac-SDKP替代时，也发现了类似的结果。
结论-
我们的结论是，在血管紧张素Ⅱ诱导的高血压中，ACE抑制剂的心脏抗纤维化作用是由于抑制Ac-SDKP水解，导致心脏细胞增殖（可能是成纤维细胞）、炎性细胞浸润、TGF减少-β表达、Smad2激活和胶原沉积。
关键词：血管紧张素、抑制剂、高血压、生长物质、胶原蛋白
血管紧张素转换酶（ACE）抑制剂是治疗高血压、心力衰竭和其他心血管和肾脏疾病的重要药物。有证据表明，它们通过抑制血管紧张素（Ang）I向Ang II的转化和激酶水解而起作用。1在这里，我们报道了一种新的机制，它介导ACE抑制的心脏抗增殖和抗纤维化作用，包括血浆和组织中N个-乙酰丝氨酸-天冬氨酰-赖氨酰-脯氨酸（Ac-SDKP），是多能干细胞增殖的天然抑制剂。2，三ACE抑制剂阻止内源性Ac-SDKP降解，并将其循环浓度提高约5倍。4，5我们之前报道过Ac-SDKP在体外抑制大鼠心脏成纤维细胞增殖和胶原合成6，7并在体内预防高血压大鼠左心室（LV）纤维化。8，9血管紧张素Ⅱ诱导的高血压不仅与心脏成纤维细胞增殖和间质/血管周围纤维化有关，还与转化生长因子的表达有关-β（TGF），10这是刺激胶原蛋白合成的核心。11此外，TGF-β用抗转化生长因子阻断-β中和抗体可预防压力超负荷大鼠的心肌纤维化和舒张功能障碍。12有充分的文件证明TGF-β信号通过配体诱导形成I型和II型丝氨酸/苏氨酸激酶受体的异聚复合物而发生。13当TGF-β受体被激活，R-Smads（Smad2和Smad3）被磷酸化，并与共同介质Smad4形成二聚体。14Smad2/3-Smad4复合物转位到细胞核，在那里二聚体可以通过与其他转录因子的相互作用直接或间接调节特定的基因转录。14
我们测试了ACE抑制剂的抗增殖和抗纤维化作用至少部分由Ac-SDKP介导的假设。为此，我们研究了（1）ACE抑制剂（卡托普利）或外源性Ac-SDKP是否能阻断LV单核细胞/巨噬细胞浸润、细胞增殖和胶原沉积；（2） 抗Ac-SDKP的封闭性单克隆抗体（mAb）拮抗ACE抑制剂和Ac-SDKP的作用；（3）ACE抑制剂和Ac-SDKP抑制心肌胶原的机制与TGF的降低有关-β转化生长因子作用的下游介质Smad2的表达和磷酸化-β由于血管紧张素转换酶抑制剂在血管紧张素Ⅱ诱导的高血压中的抗纤维化作用与血流动力学变化无关，15，16我们选择这个模型来检验我们的假设。
方法
该研究由亨利福特医院动物护理和使用委员会批准。
动物与实验设计
使用戊巴比妥钠（50 mg/kg IP）麻醉体重为200至255 g的雄性Sprague-Dawley大鼠（Charles River，Wilmington，Del）。在肩胛骨和皮下形成的口袋之间做了一个小切口，刚好能容纳一个渗透微型泵（Alzet 2 ML4）。植入该泵以输送Ang II（750μ克·千克−1·d日−1)和/或Ac-SDKP（由加拿大谢尔布鲁克大学Domenico Regoli博士和Witold Neugebauer博士合成）或生理盐水加0.01N乙酸。在饮用水中注射卡托普利和免疫球蛋白G（IgG，400μg/kg）或抗AcSDKP单克隆抗体（400μg/kg）每隔一天腹腔注射一次。Ac-SDKP和卡托普利治疗与Ang II同时开始，持续4周。大鼠分为6组：（1）假手术组+IgG，（2）血管紧张素Ⅱ+IgG组，（3）血管紧张素Ⅱ+卡托普利组（100 mg·kg−1·d日−1)+IgG，（4）Ang II+卡托普利+单克隆抗体，（5）Ang II+Ac-SDKP（800μ克·千克−1·d日−1)+IgG和（6）Ang II+Ac-SDKP+单克隆抗体。
在研究之前，我们测试了当内皮素-1（ET-1）刺激培养的成年大鼠心脏成纤维细胞时，mAb（1:1000）是否阻断Ac-SDKP对胶原合成的影响。6我们发现对照细胞中的胶原蛋白为5.7±0.8μg/mg蛋白质；ET-1为14.3±0.5（10−8摩尔/升），5.3±0.7，ET-1AcSDKP（10−9mol/L）和14.2±1.5（ET-1Ac-SDKPmAb）。在另一项研究中，我们测试了与给予腹腔内IgG（n=5）或mAb（n=5）4周的假大鼠相比，用mAb慢性阻断内源性Ac-SDKP是否会增加左心室胶原沉积。
每周测量一次收缩压（SBP），连续4周。实验结束时，用50 mg/kg戊巴比妥钠麻醉动物。心脏在舒张时停止，脑室内注射15%KCl，并迅速切除。对左心室（包括隔膜）进行称重，并从顶点到底部进行横向切片。
羟脯氨酸测定
如前所述，通过羟脯氨酸测定测定心肌和肾组织的胶原蛋白含量。9，17简单地说，在110°C下用6N HCl干燥、均质并水解组织16小时。0到5的标准曲线μ使用g羟脯氨酸。数据表示为μg胶原蛋白/mg干重，假设胶原蛋白平均含有13.5%的羟脯氨酸。18
胶原形态计量学
截面测量6μ使用改良的汗液和普希特勒法将m脱蜡、复水并用苦味酸红染色。19简单地说，切片后固定在Bouin液中，然后用苏木精铁染色显示细胞核。然后用0.1%苦味酸红染色1小时，并用0.5%醋酸洗涤两次。图像通过电脑数码相机（Spot Diagnostic）获得，并在显微镜（Nikon E600）下使用正常光和偏振光检查胶原蛋白形态。20
细胞增殖（Ki-67）和LV单核细胞/巨噬细胞计数（ED1）的测定
截面测量6μm脱蜡并复水。为了揭示抗原，将切片在10 mmol/L柠檬酸钠缓冲液（pH 6.0）中的微波炉中煮沸10分钟。它们是在dH中清洗的2O并在3%H中培养2哦2在室温下孵育10分钟，然后在室温下在封闭溶液中预孵育30分钟，最后在室温下与鼠抗大鼠巨噬细胞/单核细胞单克隆抗体（ED1，1:1000稀释；Chemicon）孵育三十分钟16或使用单克隆鼠抗鼠Ki-67抗原抗体（1:50；Dako）在4°C下过夜。21，22用Vectastain ABC试剂盒（Vector Laboratories）检测ED1和Ki-67抗原。切片用二氨基联苯胺底物（载体）显影，并用苏木精复染。检测一半LV中Ki-67阳性细胞。计数带有深棕色细胞核的增殖细胞，并以细胞/mm表示2.
Western Blot检测组织TGF-β和Smad
蛋白质（60μg） 在不还原TGF的条件下，对LV提取物进行12%SDS-PAGE-β或10%SDS-PAGE在还原条件下用于Smads。蛋白质被转移到硝化纤维膜上。主要抗体为鼠抗TGF单克隆抗体-β1,2,3（1:1000；研发系统）、山羊抗Smad2/3或Smad7多克隆抗体（1:300；Santa Cruz Biotechnology）或兔抗p-Smad2多克隆抗体（1:1000，细胞信号技术）。将抗肌动蛋白的山羊多克隆抗体（1:500；Santa Cruz）与上述一级抗体一起添加作为管家蛋白。重组人TGF-β1（研发系统）和TGF提取物-β经处理的HepG2细胞（细胞信号）被用作TGF的阳性对照-β和p-Smad2。结果通过生物扫描仪进行量化，并表示为与假手术相比的倍数增加。阳性条带的分子量如下：TGF-β，25kDa；Smad 2/3，65 kDa；Smad7，51 kDa；和p-Smad2，58 kDa。
Ac-SDKP尿液水平
将尿液收集在装有赖诺普利的小瓶中24小时（最终浓度为10μmol/L）并在2000年离心克持续15分钟。使用竞争性酶免疫分析试剂盒（SPI-BIO）对尿液Ac-SDKP进行定量，并以微克/24小时表示。23
统计分析
采用方差分析（ANOVA）、重复测量和协变量（基线收缩压）检查收缩压。所有其他变量通过单因素方差分析进行分析。变量的对数变换用于稳定方差。分为6组：（1）假手术+IgG，（2）Ang II+IgG，（3）Ang IIcaptopril+IgG，（4）Ang IIcaptoprilmAb，（5）Ang IIAc SDKP+IgG，（6）Ang II+Ac SDKP+mAb。预先指定了七项比较（1对2、2对3、2对4、2对5、2对6、5对6、3对4）。使用Hochberg的事后比较方法判断显著性。数值表示为平均值±SEM。所有概率值P（P）<0.05。
结果
收缩压和左心室肥大
血管紧张素Ⅱ+载体组的收缩压显著增加(P（P）<0.005）Ang II输注开始后1周，持续升高3周。卡托普利和AcSDKP单独或联合单抗治疗4周对高血压均无影响(). Ang II+载体组LV重量显著增加(P（P）<0.001），并且卡托普利和Ac-SDKP（有或没有mAb）均未降低LV肥厚(). 用单克隆抗体治疗假大鼠并没有改变LV重量与体重的比率。
ACE抑制剂或Ac-SDKP治疗4周后，Ang II诱导高血压大鼠的收缩压（n=10-13，顶部）和左室重量与体重的比值（LVW/BW）（n=5-6，底部）。血压和左室肥厚不受任何治疗的影响*P（P）<0.05 vs Ang II+车辆。
Ac-SDKP尿液水平
慢性Ang II输注对尿Ac-SDKP无显著影响()但在给予ACE抑制剂的大鼠中增加了5倍(P（P）=0.0008）和Ac-SDKP(P（P）=0.0001). 出乎意料的是，单克隆抗体只减弱了慢性Ac-SDKP输注的效果，从3.81±0.56降至1.83±0.47μg/24小时(P（P）=0.0055），但不影响ACE抑制剂（5.37±0.61μg/24小时）().
在缺乏或存在抗血管紧张素转换酶抑制剂单克隆抗体的情况下，服用ACE抑制剂或Ac-SDKP 4周后，患有血管紧张素II诱导的高血压大鼠的24小时尿Ac-SDKP（n=4至7）。
LV胶原蛋白含量
血管紧张素Ⅱ+载体组LV胶原显著增加（13.3±0.9μg/mg干LV wt）与对照组相比（8.9±0.7μ克/毫克LV干重；P（P）<0.002），并且这种增加被卡托普利显著减弱（9.6±0.6μ克/毫克LV干重；P（P）<0.006）或Ac-SDKP（9.7±0.4μ克/毫克LV干重；P（P）<0.015) (). 单克隆抗体显著减弱卡托普利的作用(P（P）<0.039）和Ac-SDKP(P（P）<0.015）(). 假手术组用单克隆抗体治疗后，血压正常大鼠的LV胶原含量没有改变，为8.9±0.4μ给予IgG和8.8±0.3的假手术组干LV重量（g/mg）μg/mg假手术组干LV wt，给予单克隆抗体(P（P）=NS）。随后的研究方案不包括与假阳性单克隆抗体的比较。
ACE抑制剂或Ac-SDKP治疗4周后，Ang II诱导高血压大鼠左室胶原沉积。两者都能预防心脏纤维化，抗Ac-SDKP单克隆抗体（n=9至12）减弱了这一作用。
LV间质和血管周围胶原
与对照组（5.10.3%；P（P）<0.001），卡托普利均能显著抑制这种增加（5.6±0.2%；P（P）<0.001）或AcSDKP（6.0±0.1%；P（P）<0.001) (). 单克隆抗体显著减弱卡托普利的作用(P（P）<0.001）和AcSDKP(P（P）<0.001) (). 假手术组血管周围胶原面积与冠状动脉管腔面积之比为4.0±0.9，在血管紧张素Ⅱ型高血压大鼠中显著增加至9.9±1.4(P（P）<0.001）。ACE抑制剂和Ac-SDKP显著减弱血管周围胶原的增加，血管周围胶原面积与管腔面积的比值降至3.6±0.6(P（P）<0.001）和3.8±0.7(P（P）<0.001），分别为(). 单克隆抗体显著减弱卡托普利的作用(P（P）<0.001）和Ac-SDKP(P（P）<0.001) ().
血管紧张素Ⅱ诱导高血压大鼠在ACE抑制剂或Ac-SDKP单独或与抗Ac-SDKP-mAb联合用药4周后左室间质胶原沉积（红色染色；顶部）（苦味酸红，×400）；底部，LV间质胶原定量分析。ACE抑制剂和Ac-SDKP均能减轻心肌纤维化，抗Ac-SDKP-单克隆抗体（n=5）可降低这种作用。
显示血管紧张素转换酶抑制剂或Ac-SDKP单独或与抗Ac-SDKP-mAb联合用药4周后Ang II诱导的高血压大鼠左室血管周围胶原沉积（红色染色；上图）的代表性图像（苦味酸红×400）；底部，定量分析LV血管周围胶原。ACE抑制剂和Ac-SDKP均能减缓心脏纤维化，抗Ac-SDKP单克隆抗体（n=5）可减弱这种作用。
LV中的细胞增殖和单核细胞/巨噬细胞
Ki-67阳性细胞（细胞增殖标记物）定位于LV的血管系统和间质空间（棕色细胞；). 给予Ang II+载体的大鼠LV中有更多Ki-67阳性细胞（826细胞/mm2)比假手术（512个细胞/mm2;P（P）<0.001) (). ACE抑制剂或Ac-SDKP治疗使Ang II输注大鼠的增殖细胞数量正常化，mAb阻断ACE抑制剂或Ac-SDKP的抗增殖作用(). 我们证实，与对照组相比，Ang II+载体组的ED1阳性细胞显著增加(P（P）<0.001）。卡托普利和Ac-SDKP治疗显著减少LV中ED1阳性细胞的数量(P（P）<0.001) ()mAb阻断ACE抑制剂或Ac-SDKP的抗炎作用。
在存在或不存在抗-Ac–SDKP单克隆抗体的情况下，ACE抑制剂或Ac-SDKP治疗4周后，Ang II诱导的高血压大鼠中Ki-67阳性细胞（细胞增殖指标）的代表性LV免疫组织化学染色。
A、 在存在或不存在抗-Ac-SDKP单克隆抗体的情况下，ACE抑制剂或Ac-SDKP治疗4周后，Ang II诱导的高血压大鼠体内Ki-67阳性细胞和B、ED1阳性细胞（单核细胞/巨噬细胞）。与假手术组相比，Ang II+载体组大鼠左室炎性细胞浸润和细胞增殖增加。ACE抑制剂或Ac-SDKP减弱了这些作用，抗Ac-SDKP-mAb阻断了ACE抑制剂和Ac-SDKP的作用（n=5-6）。
TGF公司-βLV中的表达（Western Blot）
TGF公司-β在Ang II+载体组的LV中高度表达。TGF的Western blot-β显示了25 kDa的频带。假手术组中几乎没有这种条带，在用卡托普利或Ac-SDKP治疗的Ang II诱导的高血压组中几乎看不到，但在mAb组中存在(，顶部）。定量分析表明TGF-β与对照组相比，表达增加了257倍(P（P）<0.001），ACE抑制剂显著降低（5±2倍；P（P）<0.001）或Ac-SDKP（2.1±0.5倍；P（P）<0.001）。单克隆抗体阻断ACE抑制剂或Ac-SDKP对TGF的作用-β表达式(，底部）。
TGF公司-βWestern blot（WB）检测到LV中的表达，显示典型的同型二聚体（25kDa）条带（顶部）。定量分析显示TGF-β在Ang II诱导的高血压大鼠的左心室中高度表达（下图）。ACE抑制剂或Ac-SDKP降低TGF-β抗Ac-SDKP单克隆抗体阻断ACE抑制剂和Ac-SDKP的作用。P、 TGF阳性对照-β（n=4至7）。
左心室中p-Smad2、Smad2/3和Smad7的表达
P-Smad2在Ang II诱导的高血压大鼠的左心室中高表达（增加3.2±0.9倍；P（P）<0.017) (，顶部）。ACE抑制剂（0.6±0.1倍；P（P）<0.001）或Ac-SDKP（1.4±0.3倍；P（P）<0.034）降低Smad2磷酸化表达，mAb阻断ACE抑制剂或Ac-SDKP对P-Smad2的作用(，顶部）。在血管紧张素Ⅱ诱导的高血压中，左室Smad2/3蛋白含量没有改变，也不受ACE抑制剂或Ac-SDKP的影响(，底部）。Smad7（51 kDa）的表达在任何组中均无显著变化().
A、 Western blot显示LV中磷酸化Smad2（p-Smad2）表达为58kDa带（顶部）。p-Smad2在血管紧张素Ⅱ诱导的高血压大鼠左室高表达（下图）。ACE抑制剂或Ac-SDKP降低P-Smad2的表达，抗Ac-SDKP-单克隆抗体阻断ACE抑制剂和Ac-SDKP的作用。B、 Smad2/3表达（58kDa）在所有组中同样明显。β-肌动蛋白（40 kDa）表现出均匀的凝胶负载。P、 P-Smad2阳性对照（n=4-7）。
左心室Smad7表达（51 kDa）的Western blot（顶部）和定量分析（底部）。所有6组之间没有显著差异。β-肌动蛋白在所有组中的表达同样明显（n=4至7）。
讨论
ACE抑制剂用于治疗高血压和充血性心力衰竭，避免心肌梗死后的重塑和再梗死，以及改善糖尿病肾病和其他肾脏疾病。它们还被证明可以减少或减缓糖尿病、癌症和衰老的发展。24——26因此，了解ACE治疗效果背后的机制可以产生治疗这些疾病和其他疾病的新方法。虽然已知ACE可水解许多肽，但ACE抑制剂的治疗效果主要归因于抑制Ang I向Ang II的转化和激酶水解。在这里，我们显示了另一种肽Ac-SDKP介导ACE抑制剂的一些作用。
我们以前曾报道过，长期服用ACE抑制剂或外源性Ac-SDKP，使血浆Ac-SDKP浓度增加到类似水平，具有类似的抗炎和抗纤维化作用。16我们的结论是Ac-SDKP可能是ACE抑制剂抗炎和抗纤维化作用的重要介质；然而，缺乏直接证据。在本研究中，我们假设ACE抑制的抗纤维化作用是由Ac-SDKP介导的。为了测试Ac-SDKP在ACE抑制剂作用中的作用，我们使用了一种更直接的方法，用一种特定的单克隆抗体阻断内源性Ac-SDKP的作用。用单克隆抗体对血压正常大鼠进行慢性治疗并没有改变LV胶原含量，表明内源性低水平Ac-SDKP不参与维持正常LV胶原。在这个高血压模型中，ACE抑制剂和Ac-SDKP都阻止了（1）LV胶原沉积（间质和血管周围），（2）LV间质细胞增殖，（3）LV单核细胞/巨噬细胞浸润，（4）TGF增加-β以及（5）Smad2的激活；此外，所有这些影响都发生在血压或心肌肥厚没有变化的情况下。ACE抑制剂和Ac-SDKP的作用均被抗Ac-SDKP单克隆抗体显著阻断。因此，我们得出结论，在血管紧张素Ⅱ诱导的高血压中，ACE抑制的抗纤维化和抗增殖作用主要由Ac-SDKP介导。这是一种新的机制，ACE抑制可以减少心脏纤维化，而不依赖于其降压作用。
在接受ACE抑制剂或Ac-SDKP治疗的大鼠中，尿Ac-SDKP增加5倍；这种作用仅在给予Ac-SDKP的大鼠中被单克隆抗体阻断，而在ACE抑制剂中没有被阻断，原因尚不清楚。需要进一步研究肾脏及其在Ac-SDKP的产生和降解中的作用，以澄清这一点。众所周知，在人类血浆和循环单核细胞中发现Ac-SDKP。23在小鼠中，它分布在几个组织中，包括肺、肾和心脏。27胸腺肽-β4最可能是肽的前体，因为其N末端包含Ac-SDKP。我们已经报道了负责Ac-SDKP释放的酶是脯氨酰寡肽酶。28Ac-SDKP被NH裂解为非活性形式2-ACE的末端催化域。4它在循环中的半衰期为4.5分钟，可能会持续释放。5以前，我们已经证明体外Ac-SDKP抑制成纤维细胞增殖和胶原合成。6我们还表明，这种四肽对醛固酮盐大鼠具有抗纤维化作用9或2肾1夹高血压（2K-1C）8心肌梗死后大鼠心脏。29Ac-SDKP阻止巨噬细胞/单核细胞浸润并减少表达TGF的细胞数量-β结缔组织生长因子。29这些研究清楚地表明，体外和体内外源性给予Ac-SDKP具有抗纤维化作用。在本研究中，我们发现ACE抑制的抗纤维化作用是由内源性Ac-SDKP介导的。Pokharel等人最近的研究进一步证明了这一点，30报告称，心脏选择性过度表达ACE的转基因大鼠表现出明显的心脏纤维化，但心脏Ang II浓度正常。TGF公司-β和Smad-R磷酸化与ACE基因的表达数量直接相关，而Ac-SDKP则相反。他们认为该模型中纤维化的发展涉及Ac-SDKP的减少。
在本研究中，我们还测试了通过Ac-SDKP抑制ACE可能减少纤维化的机制，重点是其对间质细胞增殖、TGF-βTGF的表达和信号转导-β（R-Smads和Smad7）。我们之前已经证明，体外Ac-SDKP抑制成纤维细胞增殖，6在体内，它抑制心脏细胞增殖，可能是成纤维细胞。8，9在这里，我们证明ACE抑制抑制心脏细胞增殖是Ac-SDKP的结果，因为单克隆抗体阻断了ACE抑制剂的作用。此外，我们已经证明，在各种高血压模型中施用Ac-SDKP可减少表达TGF的细胞数量-β在心里。本研究清楚地表明，ACE抑制剂和Ac-SDKP均能降低心脏TGF-β，并且这些作用被mAb阻断。TGF公司-β是一种重要的纤维化前细胞因子，同时刺激细胞增加大多数基质蛋白的合成，减少基质降解蛋白酶的产生，并增加蛋白酶抑制剂的产生。12，31，32TGF公司-β在高血压心脏中，炎症细胞（巨噬细胞）的加速浸润或血管紧张素Ⅱ作用于心脏成纤维细胞和肌成纤维细胞都会增加。10Lee等人33报道Ang II刺激TGF的自分泌-β在成年大鼠心脏成纤维细胞中，并表明其对成年心肌的影响可能部分由自分泌/旁分泌机制介导，包括TGF的产生和释放-β心脏成纤维细胞。TGF公司-β通过2种不同的受体丝氨酸/苏氨酸激酶进行信号传导，14TGF公司-βI型受体（T-βR-I）和T-βR-II，它们一起形成一个四聚体复合物-βR-I与T结合-βR-II。T型-βR-II激活T-β丝氨酸残基磷酸化后的R-I，这反过来导致R-Smads（Smad2和Smad3）的磷酸化（激活）。活化的R-Smads与co-Smad4形成异基因异构体，这些复合物转移到细胞核，在那里它们与启动子区域结合，启动子区域通过与其他转录因子的相互作用直接或间接启动特定的基因转录。14因此，Smad2的磷酸化和向细胞核的移位是细胞信号调节的关键步骤。
TGF增加-βSmad2、3和4蛋白表达与心肌梗死瘢痕愈合慢性期I型胶原表达增加呈正相关。34在本研究中，我们发现ACE抑制剂通过内源性Ac-SDKP发挥作用，抑制LV Smad2磷酸化，表明对R-Smad激活的干扰。这可能是因为抑制Smad蛋白的合成或活化以及核移位；但是，由于ACE抑制剂和Ac-SDKP均未显著影响Smad2/3的总蛋白含量，因此Ac-SDKP或ACE抑制剂（通过内源性Ac-SDKP-起作用）似乎更有可能通过与TGF降低相关的机制抑制Smad2的磷酸化（激活）-β表达式。然而，也可能涉及其他未知机制，因为AcSDKP抑制外源性转化生长因子的作用-β心脏成纤维细胞和系膜细胞中Smad的激活。7，35
Smad7属于抑制Smads类，可阻止R-Smad激活，从而下调TGF-β发送信号。36，37研究表明，Smad7表达降低在心肌梗死后心脏纤维化的发病机制中起着作用，38Smad7的瞬时基因转移和表达可防止博莱霉素诱导的Smad2磷酸化和小鼠肺纤维化。39我们质疑ACE抑制剂或Ac-SDKP是否可以诱导Smad7表达，但通过Western blot检测不到Smad7信号的任何差异。这可能表明（1）Smad7表达很低，Ac-SDKP不会强烈诱导其表达7或（2）Smad7的抑制作用与它在细胞中的表达和数量增加无关，而与它从细胞核转移到细胞质并与T竞争性结合的能力有关-βR-I，如Kanasaki等人35在人肾小球系膜细胞中。他们证明，通过Ac-SDKP处理，抑制性Smad7从细胞核输出到细胞质，这是我们无法在LV样本中检测到的。因此，TGF的抑制-βAc-SDKP和ACE抑制剂（通过内源性Ac-SDKP作用）在注入血管紧张素II的高血压大鼠左室的表达和Smad2磷酸化也可能是介导ACE抑制剂抗纤维化作用的重要因素。
总之，ACE抑制剂增加血浆AcSDKP，进而抑制LV炎症细胞浸润、间质细胞增殖（很可能是成纤维细胞）、TGF-βSmad2活化和胶原沉积。用抗Ac-SDKP单克隆抗体在体内中和Ac-SDKP-可显著减弱ACE抑制剂的作用，而不会造成任何血流动力学影响，这一事实证实了这一点。这些发现表明，Ac-SDKP通过阻断血管紧张素Ⅱ型高血压大鼠胶原蛋白的生成来预防心脏纤维化，很可能是通过抑制TGF-β及其亚细胞信号转导（p-Smad2）。ACE抑制剂增加血浆5和组织Ac-SDKP40减少心脏和肾脏纤维化。1，41——44我们的结论是，Ac-SDKP可能是ACE抑制剂在高血压中抗炎和抗纤维化作用的重要新介质。
临床展望
ACE抑制剂用于治疗高血压和充血性心力衰竭，避免心肌梗死后的重塑和再梗死，以及改善糖尿病肾病和其他肾脏疾病。它们还被证明可以减少或减缓糖尿病、癌症和衰老的发展。因此，了解ACE治疗效果背后的机制可以产生治疗这些疾病和其他疾病的新方法。虽然已知ACE可水解许多肽，但ACE抑制剂的治疗效果主要归因于抑制Ang I向II的转化和激酶水解。在这里，我们发现另一种抑制多能干细胞增殖的肽Ac-SDKP可能是ACE抑制剂的一些作用的原因。我们发现ACE抑制剂增加了血浆Ac-SDKP，进而抑制LV炎症细胞浸润、间质细胞增殖（很可能是成纤维细胞）、TGF-βSmad2活化和胶原沉积。在体内用抗Ac-SDKP单克隆抗体中和Ac-SDKP-可显著减弱ACE抑制剂的作用，而不会产生血流动力学影响，这证实了Ac-SDKP.在ACE抑制剂体内作用中的重要性。这些发现表明，Ac-SDKP通过阻断血管紧张素Ⅱ型高血压大鼠胶原蛋白的生成来预防心脏纤维化，很可能是通过抑制TGF-β及其亚细胞信号转导（p-Smad2）。因此，Ac-SDKP可能是ACE抑制剂在高血压中抗炎和抗纤维化作用的重要介质。
致谢
本研究得到了美国心脏协会拨款0130128N和NIH拨款HL-71806-01（Rhaleb博士）和HL-28982（Carretero博士）的支持。
披露
Carretero博士是辉瑞公司（Pfizer）的一笔赠款的接受者（与本研究无关），并曾担任诺华公司（Novartis）的顾问。Rhaleb博士获得了HFH机构基金A10163的研究支持。
工具书类
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