核心提示：本研究探讨了慢性胰腺炎（CP）大鼠模型中孤束核（NTS）在内脏高敏感性发病机制中的作用。我们证明，CP大鼠在NTS尾侧表现出增强的兴奋性突触传递。这种增强可能是通过谷氨酸释放增强和膜谷氨酸受体招募介导的。抑制尾侧NTS神经元兴奋性突触传递和神经活动可减轻CP大鼠内脏超敏反应。我们的结果表明，尾部NTS是处理胰腺疼痛的主要中枢部位，也是治疗CP患者慢性内脏疼痛的潜在治疗靶点。
简介
持续疼痛是慢性胰腺炎（CP）的主要特征，具有深刻的社会经济影响[1]. 疼痛性脑瘫的治疗仍然是一个主要挑战，因为目前的治疗方法未能产生令人满意的结果。更有效的治疗需要根据我们对疼痛性脑瘫神经生物学的新进展发现新的靶点[2,三]. 解剖学知识表明胰腺感觉信息进入中枢神经系统通过交感神经和迷走神经。前者穿过腹腔神经丛到达下胸椎脊髓通过内脏神经，而内脏神经穿过结状神经节，与孤束核（NTS）相连通过腹部迷走神经[4]. 以往关于疼痛性脑瘫中枢处理的研究通常集中在胸椎后角[5-7]. 一般来说，外周敏化的长时间刺激促进了背角神经元的异常兴奋。这一过程被称为中枢敏化，导致慢性胰腺疼痛中的内脏超敏反应[8-10]. 不幸的是，对NTS在疼痛性CP中的作用关注较少。
NTS是位于延髓背内侧的初级内脏传入的关键中继站。众所周知，NTS的嘴侧三分之一与味觉和口腔躯体感觉调节有关[11]而尾部三分之二是一般内脏感觉的主要中枢[12]. 越来越多的形态学证据表明[13,14]和化学[15-17]胃肠道有害刺激诱导NTS内Fos过度表达，提示NTS参与内脏疼痛的处理。然而，NTS在内脏疼痛中作用的细胞和分子机制尚未报道。
谷氨酸是NTS内的主要兴奋性神经递质。兴奋性突触传递通常由谷氨酸对两种不同的离子受体的作用介导，这两种受体是N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDAR）和α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体（AMPAR），它们在NTS内内脏感觉的处理中起着主要作用[18,19]. 越来越多的临床前研究提供了证据，证明在慢性高血压和缺氧等病理情况下，NTS内谷氨酸能突触传递的可塑性变化，包括NMDAR和AMPAR的上调、修饰和膜插入[20-22]. 我们之前的研究还表明，慢性心肌梗死（CMI）引起内脏疼痛时，NTS内兴奋性突触传递增强[23]. NTS的化学损伤和药物抑制对心脏内脏痛均有镇痛作用[23,24]. 考虑到这些，我们假设NTS内兴奋性突触传递增强，并导致疼痛性CP内脏过敏。
在本研究中，我们首先检测了导管内三硝基苯磺酸（TNBS）注射诱导的CP大鼠NTS中Fos的表达。随后采用电生理方法探讨NTS内兴奋性突触传递的变化。然后，应用免疫印迹和电子显微镜来揭示这些变化的潜在分子基础。最后，我们证明了NTS在疼痛性CP发病机制中的镇痛作用通过药理学方法和化学遗传学。
材料和方法
动物和实验设计
81只雄性Sprague-Dawley大鼠（250-280 g）由第四军医大学实验动物中心（中国西安）提供。所有手术均按照国际疼痛研究协会的指导方针进行[25]并经第四军医大学动物保护和使用委员会批准。我们采取了一切措施来减少动物的不适。实验前，将动物驯化到实验室条件（23°C，12h/12h光/暗，50%湿度）下两周，并提供水和食物随意在诱导胰腺炎前后12h，停止进食和饮水。组织采集用动物被过量服用2%戊巴比妥钠（静脉注射，100 mg/kg）安乐死，而手术用动物则被深度麻醉通过2%戊巴比妥钠（静脉注射，40 mg/kg）。
实验1：CP大鼠NTS内Fos-免疫活性（-ir）神经元表达增加的证据将8只大鼠平均分为两组（假手术组和TNBS组）。如前所述，胰腺炎是通过导管内输注0.4 mL 2%TNBS（Sigma，St.Louis，MO，USA）诱发的[26]. 假大鼠接受等量的生理盐水。术后第14天（POD），取脑组织进行Fos免疫染色。
实验2：疼痛性CP对NTS内兴奋性突触传递的影响18只大鼠被平均分为两组（假手术组和TNBS组）。在POD 14上，获取包含NTS的脑干切片，用于电生理记录。
实验3：疼痛性CP对NTS内囊泡谷氨酸转运体（VGluTs）、NMDAR亚基NR2B和AMPAR亚基GluR1表达的影响12只大鼠平均分为4组（假手术组、TNBS POD 7组、POD 14组和POD 28组）。根据上述时间点处死所有经TNBS治疗的大鼠，并对其进行NTS采样，以进行VGluT1、VGluT2、NR2B和GluR1免疫印迹。
实验4：CP导致NTS内NR2B和GluR1膜插入疼痛的证据将6只大鼠平均分为两组（生理盐水组和TNBS组）。在POD 14上，对脑干进行NR2B和GluR1电子显微镜取样。
实验5：NTS内微量注射CNQX（AMPAR拮抗剂）和AP-5（NMDAR拮抗剂19只大鼠分为三组（生理盐水组6只、CNQX组6只和AP-5组7只），在TNBS治疗前7天在NTS上植入套管。在POD 14上，在NTS微量注射药物前后监测腹部撤回阈值（AWT）。
实验6：NTS兴奋性神经元的激活或失活对CP大鼠内脏超敏反应的影响18只大鼠平均分为三组（CaMKIIa-Gq、CaMKII-mCherry和CaMKIIa-Gi组），在TNBS治疗前7天将病毒注射到NTS。在POD 14上，在氯氮平-N-氧化物（CNO）处理前后监测AWT。
冯-弗雷试验
作为对CP大鼠腹部机械性超敏反应的测量，通过以下方法监测AWT冯·弗雷灯丝（VFF；斯托尔廷，基尔，威斯康星州，美国）分析[26]. 对于VFF分析，在测试前3天将指定用于刺激的腹部区域剃光。这些动物在测试仪器中习惯了直到平静下来。将力从0.16 g增加到26 g的VFF施加在腹部5次，每次持续5-8 s，间隔5 min。引起至少3次撤回反应的最小力被视为AWT。
免疫组织化学染色
在POD 14上，实验1中的大鼠被深度麻醉，然后灌流100 mL 0.01 mol/L磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4），随后灌流500 mL 4%多聚甲醛（PFA）固定液于0.1 mol/L的磷酸盐缓冲液中（PB，PH7.4）。灌注后，将大脑取出，置于4°C的30%蔗糖溶液中24小时，然后将35µm厚的冠状切片切成六个盘子，每六个连续切片六组。接下来，将第一组中的切片在室温（RT）下在10%正常驴血清中孵育40分钟，以阻断非特异性免疫反应性，然后在4°C下与以下抗体按顺序孵育过夜：（1）小鼠抗Fos（1:500；Abcam，Cambridge，MA，United States）在4°C下孵育24小时；（2） 生物素化驴抗鼠剂（1:500；Millipore，Billerica，MA，United States），室温下4小时；和（3）Avidin-biotin复合物（1:200；ABC试剂盒，Vector，加利福尼亚州伯灵盖姆，美国）在室温下反应2小时。然后用0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液（含有0.02%DAB（日本熊本市多津市）和0.003%h2O（运行）2用于可视化Fos。最后，将切片放在玻璃载玻片上，盖上盖子进行检查通过光学显微镜（日本东京奥林巴斯AH-3）。使用Fluoview 1000显微镜（奥林巴斯）捕获并分析图像。对于Fos-ir神经元计数，一名对实验一无所知的研究人员对假手术组和TNBS组（每组四只大鼠）中每只大鼠每个脑区至少四个部分的Fos-ir神经细胞平均数量进行了计数。我们将定量限制在内侧前额叶皮层（mPFC）、前扣带回皮层（ACC）、岛叶皮层（IC）、室旁丘脑核（PVT）、中央丘脑内侧核（CM）、杏仁核、中脑导水管周围灰质（PAG）、中缝背核（DR）、臂旁核（PBN）和NTS，所有这些都与内脏疼痛密切相关[17,27].
全电池接线灯录音
在POD 14上，对实验2中的大鼠进行麻醉，并在4°C下用振动棒在含氧ACSF（mmol/L:124 NaCl，2.5 KCl，2 MgSO）中切割含有NTS的冠状脑干切片（300μm）4，2氯化钙2，25氯化钠三，1 NaH2人事军官4，37葡萄糖，pH 7.4）。然后，将切片转移到RT下含氧ACSF的恢复室中1小时。对于全细胞补丁灯记录，将切片放置在28°C下含氧CCSF的记录室中。微量移液管内基于钾的细胞内溶液（8-10 MΩ）包含以下物质（单位：mmol/L）：120 K-葡萄糖酸盐、5 NaCl、0.2 EGTA、10 HEPES、2 MgATP、0.1 Na三GTP，1氯化镁2和10磷酸肌酸（用KOH调节至pH 7.2，290 mOsm）。假设直径较小（<15μm）的神经元接收兴奋性传入[28,29]，视觉预选于NTS尾侧神经元的连合和内侧部。在记录之前，将同心双极电极放置在相邻的孤束上，以最小电压（1-15 V，0.1 ms脉冲宽度）施加刺激脉冲。只有具有清晰的单突触诱发兴奋性突触后电流（EPSC）峰值的神经元才能进行自发EPSC（sEPSCs）记录。记录sEPSCs至少10分钟，膜夹持在-60 mV下，并对5至10分钟的sEPSC进行统计分析。所有记录均在苦毒毒素（100μM，Sigma）存在下进行，以阻断GABAA类受体介导的抑制性突触电流。所有录音均使用MultiClamp 700B放大器（Axon Instruments，Sunnyvale，CA，United States）进行，并使用DigiData 1550B以5 kHz的频率进行数字化。如果访问电阻（10-30 MΩ）在实验期间变化了15%，则丢弃数据。
蛋白质印迹分析
在冷的ACSF中收获实验3中的大鼠的脑干组织。根据我们之前的研究，为VGluT1、VGluT2、NR2B和GluR1分析准备总蛋白[30]. 随后，对每个样品中的30µg蛋白质（通过双茚四酮酸蛋白质分析进行定量测量；Thermo Scientific；Rockford，IL，United States）进行10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳，并电泳转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（Immobilon-P、Millipore、Billerica、MA、美国）。用5%DifcoTM脱脂牛奶在含有吐温（TBST）的Tris缓冲盐水中封闭2 h后，在4°C下用以下主要抗体孵育膜过夜：小鼠抗VGluT1（1:500；Millipore）；鼠抗VGluT2（1:500；Synaptic Systems，Goettingen，Niedersachsen，德国）；兔抗pNR2B-Tyr1472（1:500；密理博）；兔抗NR2B抗体（1:500；英国剑桥Abcam）；兔抗GluR1（1:500；密理博）；和兔抗pGluR1-Ser845（1:500；毫米波）。然后用辣根过氧化物酶（HRP）结合二级抗体（山羊抗兔/小鼠，1:5000；美国新泽西州皮斯卡塔韦Amersham Pharmacia Biotech）培养免疫印迹。为了验证等负荷，我们还用兔抗GAPDH（1:5000；北京TDY生物技术有限公司，中国北京）探测了膜。通过增强化学发光（ECL）检测方法（Amersham Pharmacia Biotech）观察带状物，并将其暴露于薄膜中。使用ImageJ软件对扫描图像进行量化和分析。靶蛋白水平根据GAPDH水平进行标准化，并表示为相对于假手术组的折叠变化。
电子显微镜
实验4中的大鼠被深度麻醉，灌流100 mL 0.01 mol/L PBS，然后灌流500 mL含有4%PFA和0.05%戊二醛的0.1 mol/L的PB固定剂。立即取出脑干，并在4°C下不含戊二醛的同一固定液中固定4小时，然后用振动棒（Microslicer DTM-1000；Dosaka EM，日本京都）将下延髓横切成50μm的切片。这些部分被进一步分为四组，分为四道菜。随后对前两个培养皿中的切片进行NR2B和GluR1染色。
将切片在含有30%蔗糖和10%甘油的0.05 mol/L PB中冷冻30分钟。将切片冻融，然后在含有20%正常山羊血清的封闭溶液中在0.05 mol/L Tris缓冲盐水（TBS；pH 7.4）中培养30分钟，然后用兔抗GluR1（1:200；Millipore）培养或兔抗NR2B（1:200；Abcam）在4°C下培养12小时。在TBS中洗涤后，将切片在与1.4 nm金颗粒（1:100；纳米探针；美国纽约州Stony Brook）结合的抗兔抗体中培养8小时。然后对切片进行如下处理：（1）在0.1 mol/L PB中用1%戊二醛后置10分钟；（2） 使用HQ银试剂盒（纳米探针）进行银增强；（3） 1%OsO4在0.1 mol/L PB中放置1h；和（4）1%乙酸铀酰在70%乙醇中放置1小时。脱水后，将切片安装在玻璃载玻片上，并嵌入环氧树脂中（Durcupan；瑞士布赫的Fluka）。在电子显微镜下，免疫反应性由分布在体细胞和树突细胞质中的免疫金粒子确定。含有两个以上免疫金粒子的不对称突触连接被认为是免疫反应性突触后结构。计算了孤束核尾侧连合和内侧各不对称突触中单个金粒子与突触后活动区最近边缘的平均距离。
药物微量注射和行为测试
将大鼠深度麻醉并固定在立体定向仪上（RWD Life Sciences，深圳，广州，中国）。引导套管（26号；RWD生命科学）被植入NTS尾部（前角尾侧14.00 mm）[31]. 简单地说，进行了枕部部分开颅手术，并切开硬脑膜和蛛网膜，以暴露脑干背表面的外阜水平。经鉴定，菖蒲被用作前/后和外侧立体定位零坐标。引导套管被植入NTS中，其坐标为：头侧0.8 mm，侧方0 mm，延髓背表面腹侧0.3 mm[24]. 在POD 14上，通过位于导管下方0.2 mm处的注射器套管（30号）进行NTS内注射。微型注射器（10μL，Hamilton，NV，美国）通过一根细聚乙烯管连接到注射器上，并由电动泵（ALCBIO，中国上海）驱动。AP-5（50 mmol/L，0.4μL）或CNQX（20 mmol/L，0.4μL）以0.05μL/min的速率输注至尾部NTS，以等量的生理盐水作为对照。在取出注射套管之前，所有注射都要再进行5分钟。在TNBS治疗前和POD 14微量注射药物前后30min测量AWT。验证了注射部位事后（post-hoc）排除定位不准确的大鼠。
化学成因和行为测试
为了特异性调节尾侧NTS兴奋性神经元的活动，我们在TNBS治疗前7天，将钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱa（CaMKIIa）启动子驱动病毒（rAAV2/9-CaMKIIa-hM4Di/hM3Dq-mCherry，0.25μL/30 min，BrainVTA，湖北武汉，中国）注入尾侧NTS，假手术组注射等量rAAV2/9-CaMKIIa-mCherry。病毒通过一个玻璃微吸管（尖端直径15-25μm）通过压力注入NTS，该玻璃微吸液管连接在汉密尔顿微量注射器（1μL）上，其坐标为写字菖蒲嘴侧0.8 mm，外侧0 mm，延髓背表面腹侧0.5 mm。在TNBS治疗前和给药前1 h和给药后1 h（静脉注射，3 mg/kg）对POD 14进行AWT测试。验证了注射部位事后（post-hoc），并排除了位置不准确的大鼠。
数据分析
结果表示为平均值±SEM。两组之间的统计分析由Student’st吨-测试（SPSS 17.0）。采用单因素方差分析和LSD进行多组间的统计比较事后（post-hoc）测试。每个实验的分析数字都显示在相应的数字中。P（P）<0.05被认为具有统计学意义。
结果
TNBS治疗增加NTS尾部Fos表达
Fos被广泛用作疼痛刺激条件下神经元激活的指标[32]. 在本研究中，当大鼠表现出强烈的内脏超敏反应时，我们选择POD 14作为Fos免疫染色的时间点[33]. 由于NTS是一个沿吻-尾轴的长脑区，我们计算了覆盖整个NTS的五个不同冠状面上Fos-ir神经元的数量。如图所示，在嘴侧NTS中Fos表达没有明显变化（Bregma-14.16:TNBS 142.25±14.08与生理盐水143.25±25.13；Bregma-14.88:TNBS 226±21.41与生理盐水158.75±23.56；P（P）> 0.05; 图和). 然而，在CP大鼠的尾部NTS中发现了更多的Fos-ir神经元（Bregma-13.44:TNBS 238.5±27.49与生理盐水155±15.35；Bregma-14.16:TNBS 108±6.99与生理盐水72.5±6.34；Bregma-14.88:TNBS 76.75±11.06与生理盐水41.75±3.19；P（P）< 0.05;n个=每组4只大鼠的4个切片；图-). 在NTS尾侧，Fos在NTS内侧（SolM）和连合（SolC）区域的表达比外侧（SolL）区域更丰富（图-)CP大鼠。这些数据为疼痛性CP条件下尾侧NTS的激活提供了形态学证据。
慢性胰腺炎大鼠孤束核内Fos表达神经元数量上调。A-E：假手术（左）和慢性胰腺炎（右）大鼠孤束核（NTS）不同冠状面内Fos的免疫化学染色。顶部面板中的矩形在底部面板中被进一步放大。棒材=顶部面板500μm，底部面板200μm；F： 直方图显示盐水和三硝基苯磺酸（TNBS）治疗大鼠NTS不同部位Fos表达神经元的资格。n个=每组4只大鼠，未配对t吨-测试，一P（P）<0.05，TNBS与伪装。4伏：4第个心室；CC：中央运河；SolIM：孤束核，中间部分；SolM：孤束核，内侧；SolL：孤束核，外侧部；SolC：孤束核，连合部；TNBS：三硝基苯磺酸。
除NTS外，CP大鼠的许多其他疼痛相关区域也表现出较高水平的Fos表达(补充图1). 在皮层区域(补充图1A-C)TNBS处理在mPFC、ACC和IC中诱导显著的Fos染色。在皮层下区域(补充图1D-E)Fos的表达主要见于PVT和CM以及杏仁核。在中脑(补充图1F)TNBS治疗增加了PAG和DR中Fos的表达。脑干中(补充图1G)在PBN的外侧部分也观察到大量Fos表达。这些观察结果表明，这些与疼痛的感觉和情感方面相关的经典大脑区域在疼痛的CP期间被激活。
TNBS治疗增强NTS尾侧兴奋性突触传递
随后，我们评估了CP大鼠尾部NTS内基底突触传递的电生理变化。SolM和SolC内的二级神经元，接收来自孤束的感觉输入[34]，在电压灯模式下记录。两组大鼠尾部NTS神经元sEPSCs的记录示例如图所示与假大鼠相比，CP大鼠sEPSC振幅的累积概率向右移动（图，左），事件间间隔向左移动（图，右侧）。平均sEPSC振幅（图，左侧）显著升高（19.60±1.39 pA与14.71±1.07 pA；P（P）< 0.01;n个CP和假大鼠分别为13和14）。平均频率（图（右）也显著升高（5.87±1.12 Hz与2.55±0.44赫兹，P（P）P<0.01）。这些结果表明，突触前递质释放概率和突触后反应性的增加都可能有助于增强CP大鼠尾部NTS的突触传递。
慢性胰腺炎大鼠孤束尾核自发兴奋性突触后电流的振幅和频率增加。A： 假（左）大鼠和三硝基苯磺酸（TNBS）治疗（右）大鼠在-60 mV电压下记录的典型自发兴奋性突触后电流（sEPSCs）；B： 假手术和慢性胰腺炎（CP）大鼠sEPSCs累积振幅（左）和事件间隔（右）直方图；C： 显示假手术和CP大鼠sEPSC频率（左）和振幅（右）的总结图。未付款t吨-测试，b条P（P）<0.01，TNBS与伪装。sEPSC：自发兴奋性突触后电流；TNBS：三硝基苯磺酸。
TNBS治疗增加尾部NTS内VGluT2的表达
VGluT对于谷氨酸能突触传递至关重要，通过谷氨酸包装和随后在中枢神经系统内刺激时的胞外释放。VGLUTs水平的变化可能对突触传递产生重大影响[35,36]. VGluT1和VGluT2端子都存在，而VGlu2端子在NTS中占主导地位[37]. 为了检测CP大鼠尾侧NTS内VGluT的表达变化，我们进行了生化研究，以测量不同时间点VGluT1和VGluT2的水平。生化分析显示，VGluT2的表达在CP过程中在NTS尾侧上调（图和)，假手术组和CP大鼠之间的VGluT1水平没有显著变化（图和). 这些数据表明，CP刺激谷氨酸的分泌，这可能是NTS尾侧突触前递质释放增加的原因。
三硝基苯磺酸治疗上调孤束尾核内囊泡谷氨酸转运体2的表达。A： 术后第7、14和28天孤束尾核（NTS）内VGluT1和VGluT2的典型Western blot；B： 三硝基苯磺酸（TNBS）处理后，NTS尾侧VGluT1含量无变化；C： TNBS治疗后，POD 7、14和28时，NTS尾部的VGluT2数量显著增加。n个=每组3只大鼠，单因素方差分析，一P（P）<0.05时，b条P（P）<0.01，TNBS与伪装。TNBS：三硝基苯磺酸；VGluT1：囊泡谷氨酸转运体1；VGluT2：囊泡谷氨酸转运体2。
TNBS治疗增加了尾部NTS内GluR1和NR2B的表达
NMDAR是由一个专性NR1亚基和NR2A-D亚基组成的四异体配体门控离子通道[38]. 其中，NR2B参与各种突触信号事件，并参与一系列功能，包括学习记忆和慢性疼痛[39]. AMPAR也是一种含有GluR1-4的异聚四聚体。虽然GluR2是NTS中最丰富的亚单位[18]，GluR1在包括慢性内脏疼痛在内的病理条件下表现出表达变化，并可能在突触可塑性中发挥关键作用[21,22]. 考虑到这些，我们检测了这两个具有代表性的谷氨酸受体亚基在NTS尾侧的表达变化。生化分析表明，CP触发了GluR1表达的长期增加（图和)和NR2B（图和)位于NTS尾部。
三硝基苯磺酸治疗上调孤束尾核内N-甲基D-天冬氨酸受体2B亚型和α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体1亚型的表达。A： 术后第7、14和28天孤束尾核（NTS）内NR2B和GluR1的典型Western blot；B： 三硝基苯磺酸（TNBS）处理后POD 7、14和28时，NTS尾侧NR2B数量显著增加；C： TNBS处理后，POD 7、14和28时，NTS尾侧的GluR1数量显著增加；D： TNBS治疗后NTS尾部pNR2B和pGluR的代表性蛋白质印迹；E： TNBS处理后，NTS尾部pNR2B的数量显著增加；F： TNBS处理后，NTS尾部的pGluR1数量显著增加。n个=每组3只大鼠，单向方差分析，一P（P）< 0.05,b条P（P）< 0.01,c（c）P（P）<0.001，TNBS与伪装。GluR1：α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体亚型1；NR2B:N-甲基-D-天冬氨酸受体2B亚型；TNBS：三硝基苯磺酸。
磷酸化是谷氨酸受体膜靶向的重要翻译后修饰[40]. 皮质NMDAR的磷酸化，特别是其NR2B亚单位，导致突触NMPAR增强通过抑制NMDAR的内吞作用并介导疼痛的慢性化[41]. 同样，皮层GluR1磷酸化也有助于AMPAR在慢性疼痛期间的定位和功能[42-45]. 为了确认在NTS尾部疼痛的CP期间是否发生类似的翻译后修饰，我们使用磷酸化位点特异性抗体测量了NR2B和GluR1的磷酸化状态。我们的数据显示pNR2B（图和)和pGluR1（图和)这些发现表明，TNBS治疗导致谷氨酸受体的上调和修饰，这可能为增强NTS尾侧突触传递提供突触后证据。
CP大鼠NTS尾侧NR2B和GluR1膜插入增强
NMDAR和AMPAR都根据突触活动动态地进出膜，而突触活动又决定突触强度[46,47]. 我们的生化数据显示，CP大鼠的pNR2B和pGluR1上调，表明突触后NR2B和GluR1在尾部NTS内积聚。通过预埋电子显微镜，我们观察到更多NR2B颗粒更靠近CP大鼠尾部NTS神经元的突触活动区（221.2±14.33 nm，n个=152个突触/3只大鼠），而非假大鼠（332.3±20.9nm，n个=156个突触/3只大鼠，P（P）<0.001）（图-). 同样，在CP大鼠中，更多GluR1颗粒更靠近突触活动区（209.7±12.87 nm，n个=150个突触/3只大鼠），比假大鼠（266.1±15.94 nm，n个=145个突触/3只大鼠，P（P）<0.001）（图-). 这些结果强烈表明，CP可诱导尾侧NTS神经元内NR2B和GluR1的突触后积累。
三硝基苯磺酸治疗导致孤束尾核突触后N-甲基-D-天冬氨酸受体2B亚型和α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体1亚型积聚。A： 典型的电镜图像显示标记N-甲基-D-天冬氨酸受体2B亚型（NR2B）的免疫金颗粒分布在假手术（左）和慢性胰腺炎（右）大鼠孤束尾核（NTS）内的不对称突触内；B： 150 nm容器中NR2B粒子的百分比与距最近突触边缘距离的函数关系；C： 假大鼠和CP大鼠NR2B与突触边缘的平均距离；D： 典型的电子显微镜图像显示标记GluR1的免疫金颗粒分布在假（左）和CP（右）大鼠尾部NTS内的不对称突触中；E： 150 nm容器中α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体亚型1（GluR1）颗粒的百分比，作为与最近突触边缘距离的函数；F： GluR1与假大鼠和CP大鼠突触边缘的平均距离。A和D中的Bar=250 nm。一P（P）< 0.05,c（c）P（P）<0.001，TNBS与伪装。Ax：Axon；Den：树枝晶；GluR1：α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体亚型1；NR2B:N-甲基-D-天冬氨酸受体2B亚型；TNBS：三硝基苯磺酸。
抑制NTS尾侧兴奋性突触传递减轻CP相关内脏疼痛
随后，我们评估了抑制NTS谷氨酸能传递是否可以减轻CP大鼠胰腺伤害性反应的行为表现（图和). 行为学结果表明，在CP14大鼠尾侧NTS微量注射CNQX和AP-5可增加其AWT（CNQX组为7.00±1.02 g，AP-5组为8.00±0.81 g，AP-10±0.27 g）n个生理盐水组；n个=6（生理盐水组和CNQX组）和7（AP-5组）；P（P）< 0.001; 图). 这些行为结果表明，尾部NTS内的兴奋性谷氨酸能传递有助于CP大鼠的内脏超敏反应。
向孤束尾核注射6-氰基-7-硝基喹喔啉-2,3-二酮和氨基-5-磷酸，可缓解慢性胰腺炎引起的内脏超敏反应。A： 行为测试示意图；B： 显示孤束尾核内插管植入位置的代表性切片。钢筋=1 mm；C： 术后第14天，微量注射6-氰基-7-硝基喹喔啉-2,3-二酮（CNQX）和氨基-5-磷酸五烯酸（AP-5）代替生理盐水，可提高慢性胰腺炎大鼠的腹部退缩阈值。n个=生理盐水和CNQX治疗组中的6只大鼠和AP5治疗组中7只大鼠，单向方差分析，c（c）P（P）<0.001，CNQX或AP5组与生理盐水组。AWT：腹部收缩阈值；CC：中央运河；CNQX:6-氰基-7-硝基喹喔啉-2,3-二酮；AP-5：氨基-5-磷酸；TNBS：三硝基苯磺酸。
抑制兴奋性NTS尾侧神经元减轻CP相关内脏疼痛
最后，我们利用化学遗传学可逆、双向调节CP大鼠尾侧NTS神经元的活动。我们针对设计药物（hM4Di和hM3Dq DREADD）专门激活的抑制性和兴奋性设计受体[48]通过向NTS尾侧注射rAAV2/9-CaMKIIa-hM3Dq/hM4Di-mCherry来兴奋NTS尾端神经元（图和). 行为学结果表明，抑制兴奋性尾侧NTS神经元减轻胰腺痛觉过敏，同时激活它们，对CP大鼠POD 14的AWT无明显影响（Gi组13.67±2.55g，Gq组2.00±1.37g，mCherry组2.36±0.67g；n个=每组6人；P（P）<0.01，Gi与m樱桃；图). 这表明兴奋性尾部NTS神经元在CP诱导的内脏疼痛的产生中发挥着重要作用。
孤束尾核内兴奋性神经元失活可减轻慢性胰腺炎大鼠的内脏超敏反应。A： 行为实验示意图（左）和rAAV2/9-CaMKIIa-hM4Di/hM3Dq-mCherry结构（右）；B： 有代表性的图像显示hM4Di-mCherry的表达局限于孤束尾核（NTS）的连合核和内侧核。Bar=0.4 mm.C：抑制NTS尾侧兴奋神经元通过静脉注射氯氮平-N-氧化物可显著提高慢性胰腺炎大鼠的腹部收缩阈值（AWT），而激活这些神经元并不影响AWT。n个mCherry、Gq和Gi组中=6只大鼠，单向方差分析。b条P（P）<0.01，Gi与m樱桃。AWT：腹部收缩阈值；CC：中央运河；CNO：氯氮平-N-氧化物；SolM：孤束核，内侧；SolC：孤束核，连合部；Gr：股薄核；TNBS：三硝基苯磺酸。
讨论
NTS和内脏疼痛
NTS是一个二级亚核复合体，分别在嘴侧和尾侧处理味觉和一般内脏感觉传入。外周内脏传入终止于NTS的不同地形区域[49-51]. 对于胃肠输入，来自上消化道的迷走神经传入优先终止于中间NTS的中央亚核，而来自膈下消化道的传入则以SolM和SolC为靶点[50,52-54]. 越来越多的证据使用神经激活标记物，如Fos和磷酸化细胞外信号调节激酶，表明NTS在急性有害胃肠刺激和慢性回肠炎疼痛时被激活[13-16,55,56]. 我们以前的研究也表明，在肠易激综合征（IBS）和CMI相关内脏疼痛中，NTS中Fos的过度表达，尤其是SolM和SolC[17,23]. 根据这些发现，我们观察到TNBS治疗的大鼠SolM和SolC内Fos表达神经元数量增加，这为NTS参与CP相关内脏疼痛提供了形态学证据[17,23].
除了NTS外，我们还观察到，在疼痛的CP期间，一系列脑区Fos表达升高。在这些区域中，mPFC、ACC、IC和杏仁核参与疼痛的情绪维度[57]; PAG是降痛调节的主要区域[58]; PVT是丘脑中线核，编码胰腺伤害感受的情感和感觉成分[27]; PBN是一般内脏输入的另一个关键中继中心[59]. 先前的形态学证据表明，NTS向PBN、PVT和杏仁核发出直接投射[60]它可能会招募一个广泛的皮层和皮层下疼痛网络，以及用于处理或调节内脏疼痛的下行调节系统。这些潜在的通路值得进一步研究，以了解内脏疼痛的神经回路机制。
疼痛性CP时NTS内兴奋性突触传递增强
NTS是接受外周心血管、呼吸和胃肠输入的主要综合中心[61]. 谷氨酸能内脏感觉传入传入通过孤束并与二级NTS神经元相连[62,63]. 我们之前的研究表明，慢性心痛时NTS内兴奋性突触传递增强。在本研究中，我们还记录了CP大鼠的二级尾侧NTS神经元，并观察到sEPSCs的频率和振幅均显著增加，这表明可能涉及突触前和突触后机制。
VGluT选择性地位于谷氨酸能末端，其含量在病理状态下发生变化[18,64]. 包含VGluT2的端子遍布整个NTS，VGluT1正极端子主要分布在横向NTS内[37]. 对于迷走神经传入纤维，心脏迷走神经纤维主要表达VGluT1，而其他传入纤维主要表达VGluT2或两种亚型[65]. 在此，我们的生化结果表明，在CP大鼠中，VGluT2（在胰腺传入中表达）的含量，而不是VGluT1（与胰腺传入无关）的含量显著增加，这可能支持我们的功能证据，即NTS内sEPSC的频率增加。这里的一个局限性是，VGluT2的表达增加可能不仅反映了迷走神经初级传入的敏化，因为NTS内含有VGluT2的终末也来源于上脑结构[18].
在AMPAR亚单位中，含有GluR2的AMPAR对Ca不渗透2+而GluR2标记的AMPAR具有高Ca2+渗透率[66]. 已有大量文献证明，脊髓和皮层GluR1在慢性疼痛诱导的突触可塑性触发中起着重要作用[67,68]对于NTS，这也同样适用。根据我们的研究[23]，我们还观察到NTS GluR1的上调和突触后募集，这可能有助于疼痛性CP期间NTS的突触后增强。此外，新的证据也表明慢性高血压和缺氧时NTS中GluR1的结构和功能改变[21,22]. 这一证据表明NTS AMPA受体在病理条件下突触可塑性中的作用。
NMDAR在大脑皮层内诱导长时程增强过程中，对触发GluR1的突触后积累至关重要。NR2B是决定NMDAR突触运输的主要亚单位，在学习记忆和慢性疼痛中起着重要作用[67,69]. 据报道，在NTS内，NR2B在高频放电期间维持突触传递[70]. 我们的数据显示，CP大鼠NTS内NR2B的上调和膜募集。考虑到这些发现，我们推测致敏胰腺传入神经过度释放谷氨酸会触发NR2B的过度激活以及随后钙的膜转运2+-渗透性GluR1；过量的钙内流随后启动随后的细胞内信号通路以磷酸化GluR1和NR2B，从而促进其膜转运和NTS兴奋性传递的长期增强。我们研究的另一个局限性是，我们没有检查疼痛性CP中其他谷氨酸受体亚单位是否存在表达或修饰后的变化。NR2B和GluR1募集的详细信号机制也值得进一步研究。
NTS作为疼痛性CP的可行治疗靶点
NTS在内脏疼痛中的作用已在几种啮齿动物模型中得到证实。对于心痛，NTS谷氨酸受体的化学损伤和药物抑制均能缓解急性或慢性心痛[23,24]而向NTS微量注射谷氨酸可促进急性炎症性心痛[24]. 此外，化学性NTS损伤也减轻了腹膜炎相关的内脏疼痛[71]. 我们的数据显示，两者都阻断了NTS内兴奋性突触传递通过CNQX和AP-5以及兴奋性NTS神经元的化学基因失活可改善CP大鼠内脏超敏反应。然而，NTS兴奋性神经元的化学遗传激活并没有加重CP大鼠的内脏超敏反应。这可能是因为NTS兴奋性神经元在CP状态下已达到峰值活动；因此，进一步加强他们的活动并不能引起更多的疼痛感。我们的疼痛评估方法的一个局限性是，对腹壁压力的撤退反应是内脏敏感性的间接标志，不一定与胰腺本身有关[72]. 因此，测量胰腺刺激引起的防御行为可能是评估胰腺神经病变相关疼痛的更好方法。
目前疼痛性脑瘫的临床治疗依赖于阿片类药物和加巴喷丁等联合止痛治疗，这些药物可以达到理想的止痛效果，但不可避免地会产生严重的不良反应，如吸毒、情绪障碍和认知障碍[73,74]. 因此，迫切需要开发有效的疼痛性CP替代品。我们的研究支持NTS作为处理胰腺疼痛的主要中枢，这可能为旨在调节NTS活性的治疗方法在难治性胰腺炎疼痛的临床治疗中铺平道路。据我们所知，长期以来，针灸口面部穴位在临床上用于治疗内脏疼痛[75]这是针刺抑制NTS过度活动的结果[76,77]. 此外，NTS活性可以通过电疗法进行调节通过无创经皮迷走神经刺激治疗急慢性疼痛[78]. 我们乐观地认为，这些针对NTS的神经调节方法将极大地有益于患有疼痛CP的患者。
总之，我们提供了形态学、生物化学、生理学和行为学证据，表明尾部NTS内兴奋性突触传递的增强有助于疼痛CP期间的痛觉过敏。突触前和突触后机制都参与了这一过程。本文提供的数据加深了我们对胰腺疼痛中枢敏化的理解，并支持NTS（除胸脊髓外）作为胰腺疼痛处理的另一个重要中枢部位，这可能为胃肠病学家和疼痛医生治疗CP提供新的线索。
文章亮点
研究背景
中枢敏化在维持慢性胰腺炎（CP）引起的慢性疼痛中起着关键作用。以往关于疼痛性脑瘫中枢处理的研究通常集中在脊髓后角。然而，在疼痛的CP期间，对胰腺传入的另一个主要中枢部位孤束核（NTS）的关注较少。
研究动机
我们旨在研究大鼠尾侧NTS的可塑性变化及其在疼痛性CP形成中的作用。
研究方法
通过导管内注射三硝基苯磺酸（TNBS）建立大鼠慢性胰腺炎模型。腹部机械性超敏反应的评估方法为冯·弗雷灯丝试验。然后，采用Fos免疫组织化学染色，为疼痛性CP时NTS的激活提供形态学证据，同时采用斑贴记录法，探讨CP大鼠NTS基本兴奋传递的变化。接下来，通过免疫印迹分析VGluT1、NMDAR亚基NR2B和AMPAR亚基GluR1的表达。通过电子显微镜评估NR2B和GluR1的膜插入。最后，将AMPAR拮抗剂CNQX或NMDAR拮抗剂AP-5微量注射到NTS中，以在术后第14天（POD）阻断谷氨酸能传递，然后测试腹部撤回阈值（AWT）。还利用化学生成方法激活或抑制POD14上兴奋性NTS神经元的活性，然后测试AWT。
研究结果
TNBS治疗增加了NTS尾部Fos表达神经元的数量。CP大鼠NTS尾侧二级神经元sEPSC的频率和振幅显著增强。TNBS治疗上调了VGluT2的表达，增强了NTS尾侧NR2B和GluR1的磷酸化和突触后转运。阻断兴奋性突触传递可增加CP大鼠的AWT。化学生成抑制兴奋性NTS神经元的兴奋性也能显著减轻胰腺痛觉过敏。
研究结论
这些数据表明突触前和突触后机制都有助于增强NTS尾侧的兴奋性传递，从而在疼痛的CP条件下调节内脏超敏反应。
研究视角
所得结果加深了我们对胰腺疼痛中枢敏化的理解，并支持除胸椎脊髓外的尾侧NTS作为胰腺疼痛处理的另一重要中枢部位，这可能为胃肠病学家和疼痛医生治疗CP提供新的线索。
参与者信息
杨白，中国陕西省西安市第四军医大学解剖学、组织学和胚胎学系和梁锦康脑研究中心，邮编710032。
陈英彪，福建省福州市350101福建卫生学院解剖教研室。
邱新童，中国陕西省西安市第四军医大学解剖学、组织学和胚胎学系和梁锦康脑研究中心，邮编710032。
陈燕兵，中国陕西省西安市第四军医大学解剖学、组织学和胚胎学系和梁锦康脑研究中心，邮编710032。
马立天，中国陕西省西安市第四军医大学解剖学、组织学和胚胎学系和梁锦康脑研究中心，邮编710032。
李英琪，西安交通大学第二附属医院心内科，西安交通大学，西安710004，陕西省。
孙红科，西安交通大学第二附属医院心内科，西安交通大学，西安710004，陕西省。
张明明，中国陕西省西安市第四军医大学解剖学、组织学和胚胎学系和梁锦康脑研究中心，邮编710032。
张婷，中国陕西省西安市第四军医大学解剖学、组织学和胚胎学系和梁锦康脑研究中心，邮编710032。
陈涛，中国陕西省西安市第四军医大学解剖学、组织学和胚胎学系和梁锦康脑研究中心，邮编710032。
范伯元，西安交通大学第二附属医院心内科，西安交通大学，西安710004，陕西省。
李慧，中国陕西省西安市第四军医大学解剖学、组织学和胚胎学系和梁锦康脑研究中心，邮编710032。
李云青，中国陕西省西安市第四军医大学解剖学、组织学和胚胎学系和梁锦康脑研究中心，邮编710032。海南医科大学与第四军医大学神经科学联合实验室，海南省海口571199。nc.ude.ummf@tanatped.
