培养物和基质
用于形态计量分析的培养物与神经营养素对细胞存活影响的研究中的培养物相同(莫里森和梅森，1998年). 这里简要概述了培养物的制备方法。无血清培养基由Eagle’s基础培养基和厄尔盐（马里兰州盖瑟斯堡生命科技公司）组成，补充牛血清白蛋白（10 mg/ml；A-9418，西格玛，密苏里州圣路易斯）、谷氨酰胺（2 m）米，Life Technologies），葡萄糖（32米米)青霉素-链霉素（每个29 U/ml，Life Technologies）和西格玛I-1884补充剂（1:100稀释，最终浓度为5 ug/ml胰岛素、5 ug/ml转铁蛋白和5 ng/ml亚硒酸钠）。含有血清的培养基由Eagle的基础培养基、厄尔盐、谷氨酰胺、葡萄糖、青霉素-链霉素和10%的马血清组成（生命技术）。
培养表面在4°C下用高分子量（>300000 kDa）聚乙烯预处理过夜-d日-赖氨酸（500 ug/ml；Sigma或Specialty Media），并在使用前用蒸馏水洗涤三次。
颗粒-Purkinje共培养。如前所述纯化小脑颗粒神经元(Hatten，1985年;Baird等人，1992年;Hatten等人，1997年;莫里森和梅森，1998年). 简单地说，收集小脑并用胰蛋白酶分离，然后通过两步Percoll梯度旋转。收集35%和60%Percoll相之间界面处的致密细胞部分，并通过在预涂有poly-d日-赖氨酸（100 ug/ml；Sigma）。收集未粘附的神经元细胞，以1100 rpm离心5 min，计数，并将其镀入聚乳酸-d日-赖氨酸包被Lab-Tek微孔，每孔300000个细胞（这相当于11×105细胞/厘米2). 用这种方法纯化的培养物由～95%的颗粒细胞组成，通常含有<5%的GFAP阳性细胞。首先将颗粒细胞置于无血清培养基中，培养过夜，第二天加入Purkinje细胞。
如前所述纯化浦肯野细胞(Baptista等人，1994年;Hatten等人，1997年;莫里森和梅森，1998年). 简单地说，通过将木瓜蛋白酶分离的小脑细胞置于35%的Percoll缓冲垫上，获得富含Purkinje细胞的部分。通过使用抗GD3抗体进行负免疫筛选，从该组分中去除星形胶质细胞；通过使用抗Thy-1.2抗体进行正免疫筛选，选择Purkinje细胞，然后使用胰蛋白酶从表面去除。通过添加含马血清的培养基或卵粘蛋白胰蛋白酶抑制剂使胰蛋白酶失活，然后将细胞离心并重新悬浮在无血清培养基中，进行计数，并以每个Lab-Tek井30000个细胞的密度进行电镀（Nunc，Roskilde，Denmark；这相当于1×105细胞/厘米2). 用这种方法制备的培养物含有85–95%的钙结合蛋白-D2.8万-阳性Purkinje细胞。
培养基在14天内每3-4天更换一次。
神经营养素和TrkB-IgG。BDNF、NT-3和TrkB-IgG由G.Yancopoulos博士（Regeneron Pharmaceuticals，Tarrytown，NY）慷慨提供。NGF是劳埃德·格林博士（哥伦比亚大学病理学系）赠送的礼物。如前所述，生成了BDNF、NT-3和NGF的剂量-反应曲线(莫里森和梅森，1998年). 实验设计包括使Purkinje细胞在第14天的最大存活率的生长因子浓度在体外（DIV）。每个因子的最终浓度为：BDNF，10 ng/ml；NT-3，50纳克/毫升；NGF，10纳克/毫升；和TrkB-IgG，25 ug/ml。在Purkinje细胞在颗粒细胞单层上电镀1.5小时后添加因子，并在更换培养基时替换。
免疫细胞化学。Purkinje细胞按所述进行可视化(Baptista等人，1994年;Morrison和Mason，1998年)用4%多聚甲醛固定，用兔抗钙结合蛋白-D多克隆抗体进行免疫染色2.8万（瑞士贝林佐纳斯旺特；1:2000最终稀释）。这个标记物专门标记小脑内的浦肯野细胞(Wassef等人，1985年;Christakos等人，1987年). 免疫过氧化物酶法用于树突和脊椎的可视化。
分析
实验组。颗粒-浦肯野共培养物未经处理或用BDNF、TrkB-IgG或两者同时处理。对每个实验的树突复杂性、脊柱密度和脊柱形态进行量化。
细胞取样。使用Zeiss Axiophot或Leitz Dialux显微镜（20×或100×物镜）观察Purkinje细胞。对于每种实验条件，根据每个孔中的细胞位置，采用无偏、系统随机的方法选择9个Purkinje细胞进行形态计量分析。在每口井中，根据对整个井进行取样的计划，选择了九个视野，其中一个视野位于中心，其余八个视野均匀分布在中心和外围之间的井周围。通过设置标准坐标轴，精确确定了每个井的这些字段。在Leitz Dialux显微镜上用20倍物镜观察时，每个选定的视野直径为670μm。九个视野中的每一个都被细分为32个方块（每侧100μm），从中心开始顺时针方向编号，从1到32。在每个视野内，在数量最少的方框中选择一个隔离良好的浦肯野细胞。如果正方形包含多个Purkinje细胞，则将该正方形细分为16个25μm正方形，并通过类似的选择过程选择Purkinje细胞进行分析。
整体树突分化。为了评估BDNF对整体树突状分化的影响，钙结合蛋白免疫阳性细胞分为三类（表)（1）正常发育的Purkinje细胞，其特征是有一个大而圆的胞体和多个树突状突起，上面覆盖有棘；（2） 细胞体相对较小，不规则，有长而薄的双极神经突（这些细胞被认为代表未成熟的浦肯野细胞或发育异常的细胞）；（3）细胞无树突状突起，胞体较大，圆形，胞质边缘较宽。这些细胞被棘状结构所覆盖，与我们之前的研究中在稀疏的颗粒突起床上观察到的形态相似(Baptista等人，1994年).
表1。
BDNF不会改变颗粒Purkinje细胞的大体分化-Purkinje细胞共培养14天在体外
| 治疗 | 类别11年 | 第2类1-b个 | 第3类1-c（1-c） |
|---|
| 控制 | 96.6% (904)1天 | 1.1% (10) | 2.3% (22) |
| BDNF公司 | 94.2% (228) | 4.6% (11) | 1.2% (3) |
脊柱密度分析。清晰摄影机的重建是以棒状图形（“骨骼化”图形）的形式进行的，代表树突乔木的精确长度和复杂性（见图。); 使用扫描仪将这些重建转换为数字文件。测定近端和远端树突节段的脊柱密度。Purkinje细胞的树突状棘被定义为不分枝的附属物，从树突状轴大约以直角伸出相对较短的距离（<6μm）(Papa等人，1995年). 近端树突段被认为是第一和第二分支点之间的树突段。远端树突节段包括最后一个分支点的远端树突段以及倒数第二个分支点和最后一个分枝点之间的长度。
图中Purkinje细胞树突树突的一部分的棒状照相机清晰重建A类此骨架图表示树枝状乔木的确切长度和复杂性。图示了远端树突节段上所有可见的树突棘(点，头棘；破折号，丝状棘）。比例尺，10μm。
脊椎分为两类：（1）有头的脊椎和（2）丝状无头脊椎（见图。用于示意图）。在培养的分离海马神经元中，描述了这两种不同脊柱类型的发生(Papa等人，1995年). 有头的脊椎包括没有明显颈部的短而粗的脊椎、颈部薄且头部圆而扁平的脊椎，以及颈部相对较厚的蘑菇状脊椎(彼得斯和凯泽曼·阿布拉姆霍夫，1970年)（参见图。). 丝状棘很薄，口径均匀，长度超过宽度。如图所示，在摄像机lucida的帮助下，脊柱按照骨骼化图纸上的指示进行分类.
TrkB信号干扰对Purkinje细胞树突棘的形态学影响。A类–C类，显示了带有头部的脊椎的最大和最小头部直径和颈部长度。在所有三个实验中，TrkB-IgG治疗导致颈部长度显著增加。D类，丝状棘的长度。示意图显示测量的参数(A类–D类)用于头棘（1）和丝足棘（2）。每根钢筋的树突棘数：A类–C类,实验1:控制,n个= 77;BDNF公司,n个= 56;TrkB公司-免疫球蛋白G,n个= 70;实验2:控制,n个= 86;BDNF公司,n个= 129;TrkB公司-免疫球蛋白G,n个= 78;实验3:控制,n个= 74;BDNF公司,n个= 116;TrkB公司-免疫球蛋白G,n个= 77.D类,实验1:控制,n个= 69;BDNF公司,n个= 63;TrkB公司-免疫球蛋白G,n个= 67;实验2:控制,n个= 54;BDNF公司,n个= 92;TrkB公司-免疫球蛋白G,n个= 70;实验3:控制,n个= 56;BDNF公司,n个= 53;TrkB公司-免疫球蛋白G,n个= 44.
脊椎密度（每10μm节段的数量）是通过将脊椎数量除以以微米为单位的节段长度并乘以10来计算的。此外，计算了每个树突状片段中丝状棘样棘的百分比（见图。). 对1530个树突状片段的脊椎数进行评估，并对相同的细胞进行树突状复杂性分析。
TrkB信号传导和浦肯野细胞脊柱密度。A类，脊椎密度。BDNF诱导的脊柱密度增加非常显著(第页< 0.001).B类，丝状棘的百分比。每个棒材分析的枝晶段数量：实验1:控制,n个= 145;BDNF公司,n个= 130;BDNF公司+TrkB公司-免疫球蛋白G,n个= 142;TrkB公司-免疫球蛋白G,n个= 114;实验2:控制,n个= 122;BDNF公司,n个= 129;BDNF公司+TrkB公司-免疫球蛋白G,n个= 126;TrkB公司-免疫球蛋白G,n个= 137;实验3:控制,n个= 126;BDNF公司,n个= 129;BDNF公司+TrkB公司-免疫球蛋白G,n个= 132;TrkB公司-免疫球蛋白G,n个= 98.
脊柱形态分析。每孔5个Purkinje细胞进一步用于脊柱形态分析。使用差示干涉对比度（DIC）光学显微镜和视频对比度增强方法获得单个树突棘的高对比度、高分辨率图像(Allen等人，1981年;肖顿，1988;Salmon等人，1989年;井上春树，1997)使用蔡司Axiovert 35倒置显微镜，带有卤素光源和100×平面的新氟油物镜（NA，1.3）、聚光器（NA 1.4）和系数为1.6×的滑块。插入视频变焦适配器（蔡司），并使用测微计校准系统。这些图像是由高分辨率相机（滨松C2400）拍摄的。然后使用MetaMorph软件（宾夕法尼亚州西切斯特Universal Imaging）处理优化的视频图像（图像平均值和背景减除）。
测定近端和远端树突节段上树突棘的形态特征。只有那些清晰可见、与相邻脊椎很好分离、并通过光学切片识别为从树突轴侧面出现的脊椎才被测量(Papa等人，1995年;井上春树，1997). 对于丝足类脊椎，使用Image-1程序在监视器屏幕上测量从基底到尖端的长度。对于带有头部的树突棘，测量颈部长度，并确定头部的最大和最小直径（见图。)，后者使用Image-1系统（通用成像）的卡尺功能。测量的脊椎数量为237（对照组）、301（BDNF治疗组）和225（TrkB-IgG治疗组）。
树突复杂性分析。树突状茎被定义为体表面树突状树的起源与第一个分支点之间的树突状节段，中间树突状段位于两个连续的分支点之间，末端树突状片段位于最后一个分支点与分支末端之间。使用计算机辅助图像分析系统（image-1；Universal Imaging）测量扫描相机清晰图像上单个树突段的长度。确定了以下树突形态参数：（1）组合树突长度，表示包括树干、中间和末端树突片段在内的所有树突片段的长度之和；（2） 树突状片段总数；（3） 分支终止提示的总数；（4） 树枝状茎的总数；（5）最大分支序。从胞体离心确定分支顺序；第一支序代表了体细胞茎枝晶的起源。第二个分支序代表干树突产生的分支点，从躯体远端移动，等等。从12个孔中选择108个Purkinje细胞，从每个实验的一个孔中选取9个细胞，进行树突复杂性分析（表).
表2。
| 治疗 | n个2-b类 | 组合树突长度（μM） | 树突段数量 | 分支终止端数量 | 茎枝数 | 最大分支顺序 |
|---|
| 控制 | 27 | 287.7 ± 175.92-c型 | 34.2 ± 17.8 | 20.7 ± 9.4 | 5.2 ± 1.9 | 5.7 ± 2.4 |
| BDNF公司 | 27 | 252.8 ± 108.6 | 29.7 ± 12.2 | 18.2 ± 6.3 | 4.8 ± 1.6 | 5.3 ± 1.7 |
| BDNF+TrkB-IgG | 27 | 248.9 ± 117.4 | 29.6 ± 13.4 | 18.6 ± 7.1 | 5.0 ± 1.3 | 5.5 ± 2.1 |
| TrkB-IgG | 27 | 276.1 ± 139.5 | 30.2 ± 14.9 | 18.4 ± 8.2 | 4.3 ± 1.6 | 6.0 ± 2.8 |
统计设计。采用SAS的一般线性模型程序，通过双向或三向方差分析分别分析了树突复杂性的五个参数、脊柱数目的两个参数和脊柱形态的四个参数R（右）系统（SAS Institute Inc.）。由于其中一些参数的平均值和标准偏差似乎因实验而异，因此我们进行了统计测试，以确定是否应在实验中合并数据。用SAS的说法，我们测试了实验的效果以及治疗和实验之间的相互作用。如果处理和实验之间的交互作用显著，则数据不会在实验之间汇集，而每个实验都是单独呈现的。如果治疗本身的效果显著，那么临时的按照Dunnett程序进行比较，并在同一试验中将治疗平均值与对照平均值进行比较。
对于树突复杂性，治疗和实验之间的统计交互作用对于任何树突参数都不显著，因此数据在三个实验中崩溃（表).
对于脊柱数目，治疗组与近端树突状节段和远端树突状段之间的相互作用在这两个参数中均不显著，因此这些树突状部分的数据崩溃了。然而，由于处理和实验之间的相互作用是显著的，因此对每个实验的数据分别进行了分析和呈现（见图。).
对于脊柱形态，在大多数实验中，治疗的主要效果对于所有四个参数都是显著的(F类(2,745)= 20.3,第页<0.001（最大封头直径）；F类(2,745)= 5.3,第页最小封头直径<0.01；F类(2,745)= 55.0,第页颈部长度<0.001；F类(2,550)= 31.2,第页<0.001，对于丝状棘的长度）。由于治疗组与近端和远端树突状节段之间的相互作用在这些参数中均不显著，因此树突状段之间的数据崩溃。然而，由于处理和实验之间的交互作用在所有四个参数中都是显著的，因此分别对每个实验的数据进行了分析（见图。).
