重组腺相关病毒介导的人酪氨酸羟化酶和人GTP-环水解酶I基因在帕金森病大鼠模型纹状体内转移的特征

摘要

中枢神经系统中用于治疗神经疾病的基因治疗概念基于以下事实从头开始正常静止基因的表达可以使基因产物在血脑屏障内局部持续传递(Gage等人，1987年). 提供治疗性蛋白质或氨基酸可能有助于治疗多种不同的中枢神经系统疾病。因此，帕金森病（PD）动物模型为基因治疗的发展提供了最具吸引力的靶点之一。这种对帕金森病动物模型的关注是帕金森病胎儿黑质组织移植广泛临床前研究和临床经验的自然延伸(比约克隆德，1991年;Freed等人，1992年;Spencer等人，1992年;Widner等人，1992年;Kordower等人，1995年). 移植胎儿腹侧中脑多巴胺（DA）神经元治疗PD已经证明：（1）现有的PD动物模型可能具有临床预测性，（2）导致更多DA直接传递到纹状体的手术干预可能具有临床相关性，以及（3）患者可以耐受所涉及的神经外科手术(比约克隆德，1991年;Freed等人，1992年;Spencer等人，1992年;Widner等人，1992年;Kordower等人，1995年). 因此，PD从基础研究到胎儿移植临床研究的过渡消除了一些与基因替代作为PD可行策略发展相关的技术不确定性。此外，重要的是，对于人类领域的基因治疗等新策略，有一种已知的PD治疗方法可能适合通过基因转移技术进行治疗，即全身性治疗我-多巴。

如果要开发PD的基因治疗，纹状体内基因转移必须被证明是安全的，以便能够提供治疗水平的我-DOPA，以显示持久的转基因表达，并最终允许控制我-多巴剂量。最近的研究表明，逆转录病毒转导的表达转基因hTH的原代成纤维细胞产生我-DOPA仅当外源性四氢生物蝶呤（BH₄)或BH中的速率限制酶₄合成途径GTP-环水解酶I（GTPCHI）共表达(Uchida等人，1992年;Bencsics等人，1996年;Leff等人，1998年). BH似乎₄黑质纹状体末端外的水平可能不足以支持在其他隔室表达的转基因TH的激活。因此，本研究检测了hGTPCHI与hTH的联合表达是否需要产生我-多巴。大量证据表明我-DOPA交付可能对PD有利(Chase等人，1989年;Chase等人，1993年;Schuh和Bennett，1993年;Obeso等人，1994年)而特定部位的纹状体内给药应避免纹状体外DA激动剂引起的任何副作用。在这里，我们描述了为满足基因治疗策略的大多数要求所做的努力我-使用重组腺相关病毒（rAAV）载体将多巴胺（DOPA）局部注射到DA基因缺失的大鼠纹状体。

野生型AAV（wt-AAV）是一种非致病性细小病毒，需要腺病毒（Ad）或单纯疱疹病毒（HSV）的辅助功能才能完成其生命周期并产生后代。如前所述，rAAV载体的构建需要去除除反向末端重复序列（ITRs）外的所有wt-AAV基因组，并用转基因取代缺失的基因通过一个描述良好的向量生成方案(Muzyczka，1992年). rAAV载体用于人类基因治疗的适用性和安全性源于其产生和感染特性的几个特征。必须至少发生两起不太可能发生的事件体内使rAAV具备复制能力并产生生产性感染(Muzyczka，1992年). 由于在rAAV病例中所有病毒基因都被删除，并且hTH和hGTPCHI是细胞质酶，因此感染细胞不应像其他病毒载体系统那样提供外来蛋白(Yang等人，1994年;Neve和Geller，1996年). 因此，感染后宿主免疫反应的可能性应该受到限制。此外，由于rAAV是一种DNA载体，它可以感染非分裂细胞并在其中表达，这是在中枢神经系统中使用的必要先决条件。最后，如果发生极不可能的wt病毒逆转体内注射rAAV后，虽然从未观察到CNS感染wt-AAV，但这种假设的wt-AAAV感染可能是无害的，因为已知wt-AV是致病性的。

本研究报告（1）rAAV介导的hTH和hGTPCHI表达足以使体内测量我-微透析DOPA；（2） 纹状体内rAAV转导后3周、6个月和1年，免疫细胞化学显示转基因表达；（3） 绝大多数（>90%）表达hTH的纹状体细胞也表达神经元标志物NeuN(Mullen等人，1992年)但很少表达胶质标志物胶质纤维酸性蛋白（GFAP，～1%）；（4）根据仅从Nissl染色切片上观察到的结果，对rAAV注射没有明显的宿主反应。

材料和方法

rAAV生产。MD-人碱性磷酸酶（hAP）的结构在别处描述(Samulski等人，1989年;Hofland等人，1997年). pMD-hTH和pMD-hGTPCHI由以下序列组成的盒构建：来自pBC12/CMV/IL-2的CMV即时早期启动子/增强子[核苷酸（nt）位置−670到+72；GenBank登录号X03922](卡伦，1986年); 人类β-珠蛋白外显子2的一个小区域和一个缩短的第二干预序列（nt位置62613–62772加上63088–63532；GenBank登录号。J02400型); β-珠蛋白外显子3、hTH或hGTPCHI cDNA以及牛生长激素基因的polyA信号序列。hTH（来自pRc/TH/317；加利福尼亚大学圣地亚哥分校M.Rosenberg的礼物）和GTPCHI（见下文）的cDNA是从MFG–S逆转录病毒载体获得的，这些载体包含与环境价值翻译起始点，插入β-珠蛋白序列第3外显子（位置63530）的MD盒中的一个位点，该位点被PCR修改为包括限制性位点PmlI，生态RI和Bgl公司二、。将整个MD表达盒插入p附属的201 (Samulski等人，1989年).

使用PCR扩增从“快速克隆”（CloneTech）肝脏cDNA文库中分离出编码人GTP环水解酶I活性异构体的全长cDNA。引物（GTPCHI 1.1，TCCATGGAGAAGGGCCCTGTGC，GenBank登录号。S44053型第65–86页；和GTPCHa2.2，CTGATCAAATCTGGCAGTACGGCAACC，GenBank登录号。S44049系列，对nt771–751加连接器序列的补充）基于已发布序列(Gutlich等人，1994年)，其中包括序列编码限制位点Nco公司N端编码端的I和密件抄送我和Bgl公司II位于编码蛋白C末端最近的末端；该序列包含50bp的3′非编码序列，即810bp。在克隆到载体pCRII（Invitrogen Corp.，San Diego，CA）后，在两条链中对其全部测序。pMD–hTH是用与pMD-hGTPCHI相同的盒构建的，除了编码人类TH2的cDNA(Samulski等人，1989年;沃尔夫等人，1989年)插入以代替hGTPCHI。

rAAV载体根据Snyder等人（1997年）和Mandel等人（1997）rAAV的纯度测定如下。rAAV矢量在CsCl梯度上以1.42 gm/ml的密度带状分布，这与wt-AAV的密度类似。根据两个标准，rAAV制剂对用于灭活剩余Ad的热处理是稳定的：（1）rAAV对DNaseI（50 U/ml，37°C下30分钟）的处理保持耐药性，以及（2）载体保持功能在体外和体内三十微升（～5×10⁹每个载体制剂的颗粒）在10%SDS-PAGE凝胶上分离，并用考马斯R250染色，以分析病毒粒子的蛋白质谱并确定是否存在细胞污染物。通过感染2×10来确定是否存在感染性Ad⁶293个细胞（这些细胞提供Ad5 dl312所需的Ad E1A基因产物）含有20μl rAAV制剂，并将细胞培养3天。未发现任何细胞病变效应。通过PCR检测确定是否存在wt-AAV污染。用DNaseI（100 U/ml，37℃下30分钟）处理rAAV库存（200μl）以降解任何未封装的DNA，用蛋白酶K（0.5 mg/ml，37℃条件下60分钟）处理以释放rAAV基因组，萃取两次酚，沉淀乙醇，溶解在30μl水中，3μl与阳性和阴性对照物一起进行PCR。产物在2%琼脂糖凝胶上分离，并用溴化乙锭染色；未检测到指示wt-AAV污染的条带(Snyder等人，1997年).

采用斑点试验测定总颗粒滴度(Snyder等人，1997年)如下所示。用DNaseI（50 U/ml，37°C下30分钟）处理rAAV库存，以降解任何未包裹的DNA，在0.5%十二烷基硫酸钠和10 m米EDTA释放rAAV基因组，提取苯酚，乙醇沉淀，在碱中变性，并应用于尼龙膜。以相应载体质粒的稀释液为标准，测定rAAV病毒拷贝数。将针对转基因的放射性探针杂交到膜上，将过滤器暴露在膜上，并切除过滤器的放射性区域并在闪烁计数器中计数。

通过感染1×10计算功能性rAAV滴度⁵HeLa或293细胞，在Ad存在下稀释rAAV存量(Ferrari等人，1996年). 细胞孵育48小时，固定并染色以检测转基因产物的存在。使用与人类蛋白交叉反应的大鼠TH单克隆抗体（Chemicon，Temecula，CA）进行免疫染色，然后使用生物素化山羊抗鼠抗体（Vector Laboratories，Burlingame，CA）和与HRP结合的链霉亲和素和生物素复合物（Vectors Laborators）进行免疫。使用二氨基联苯胺进行检测（Biogenix，San Ramon，CA）。对阳性细胞进行计数，并根据rAAV稀释液中的细胞计数计算滴度，其中感染率与稀释度呈线性关系。在功能载体滴度的估计中，没有考虑在48小时间隔期间持续的HeLa细胞分裂。两种滴度方法的比较显示，总颗粒与感染颗粒的比率为100到500倍。表中给出了本研究中使用的rAAV载体的粒子数和功能滴度的精确表征​表11.

实验对象。Fischer 344只雄性大鼠体重约220克，取自Harlan Sprague Dawley（印第安纳州印第安纳波利斯）随意食物和水在12小时的光/暗循环中，并按照国家卫生研究院发布的指南进行维护和处理。所有手术均在大鼠异氟烷气体麻醉下进行，采用无菌程序。将一只大鼠麻醉在“睡眠箱”中后，将其放置在一个小型动物立体定向装置中（加利福尼亚州图荣加市Kopf Instruments），使用不会破坏鼓膜的耳杆。

6-OHDA损伤。在任何载体注射之前，在异氟醚麻醉下，通过在两个不同的位置立体定向注射4μg/μl 6-OHDA HBr（以游离碱计算，溶于2 mg/ml抗坏血酸盐）对大鼠进行单侧6-OHDA损伤(施密特等人，1983年). 对本实验中使用的所有动物进行强效苯丙胺（2.0 mg/kg，损伤后1周；本实验中大鼠的平均总量=409±26/90 min）和脱吗啡诱导的旋转行为（0.1 mg/kg，注射6-OHDA后3周开始三次，每周一次；第三次试验中大鼠的平均总数=249±15/60 min）。在符合该筛选标准的动物中，这种病变可靠地导致纹状体中DA的消耗>98%（S.Leff和R.Mandel，未发表的观察结果）。

使用自动转速表评估旋转行为(Ungerstedt和Arbuthnott，1970年). 将大鼠置于仪器中，并让其习惯化5至10分钟。在习惯化期结束后，给每只大鼠注射适当的激动剂。净旋转是指从适当方向的旋转减去不适当方向的转动（顺时针方向为脱吗啡诱导的旋转行为，逆时针方向为苯丙胺诱导的旋转）。

脑内注射rAAV载体。将大鼠置于立体定向框架后，将PBS中的rAAV注射到纹状体[前后（AP）0.0 mm，外侧（LAT）3.0 mm，背腹（DV）−5.5，−4.5，−3.5 mm，切牙杆设置在耳内线下方−3.3 mm(Paxinos和Watson，1987年)]通过装有30号斜面皮下注射针的5μl Hamilton注射器，以1μl/min的速度注射1分钟。注射速度由输液泵（位于康涅狄格州斯坦福德的Razel Scientific Instruments）精确控制，该泵推动活塞，活塞反过来压下Hamilton针筒上的柱塞。在注射过程中，每20秒将针头向背部方向缓慢提升1毫米。注射停止一分钟后，针头再缩回1毫米，然后再留在原处4分钟，然后慢慢从大脑中抽出。将40只单侧6-OHDA损伤的动物分为四个独立的实验组，在预防注射苯丙胺和阿扑吗啡诱导的旋转行为方面进行统计学平衡。每组被随机分配接受如下1μl纹状体内载体注射之一：rAAV–MD–hTH；rAAV–MD–GTPCHI；rAAV–MD–hTH和rAAV-MD–GTPCHI的1:1混合物；以1μl PBS注射液作为对照条件。注射rAAV三周后，每组杀死2-6只动物，并对其大脑进行免疫细胞化学处理。纹状体内注射rAAV六个月后，每组剩下的4-10只动物被杀死，处理方法与之前的动物相同。

共48只单侧6-OHDA诱导的动物接受了4×1μl纹状体内注射[（1）AP+0.5 mm，LAT−3.0 mm，DV−5.5，−4.5，−3.5 mm；（2）AP 0.0 mm，LAT-2.7 mm，DV-5.5 mm，−3.5mm；（3）AP 0.0毫米，LAT−3.2毫米，DV−5.5、−4.5、−3.5毫米；（4） AP−0.7 mm、LAT−3.0 mm、DV−5.5、−4.5、−3.5 mm]，其中每个单独的喷射与上述单个喷射相同。32只受损大鼠被分为四个实验组，根据媒介感染前苯丙胺和脱吗啡诱导的旋转行为进行平衡。这些组被随机分配到以下载体注射方案之一：rAAV–MD–hTH；rAAV–MD–GTPCHI；rAAV–MD–hTH和rAAV-MD–GTPCHI的1:1混合物；和rAAV–MD–hAP控制感染。其余16只6-OHDA致敏大鼠被分为与上述相同的行为平衡组，但在接受以下载体注射的载体注射大鼠中，只有7只被用于本实验的细胞识别部分：rAAV–MD–hTH或rAAV-MD–h TH和rAAV？MD-hGTPCHI的1:1混合物。微透析实验和细胞鉴定实验中每个载体注射组的最终个体“n”号记录在结果部分各自的图表或表格中。

另一组三只单侧6-OHDA诱导的部分纹状体DA失神经大鼠（平均苯丙胺旋转=388±148；平均脱吗啡诱导旋转=114±48）接受2×1μl rAAV–MD–hTH注射(n个=3）如上所述，被允许在被杀前活1年。对他们的大脑进行TH免疫细胞化学处理。

微透析。本实验中使用的透析探针为同心型（直径0.5 mm；卡内基药物公司，CMA12），分子量截止值为20 kDa。所有微透析探针都有4mm的暴露透析膜。测试探针的回收率我-DOPA，平均值为19.9%，各组间无显著差异(F类_(4,27)= 0.6;第页> 0.6). 报告的HPLC测定我-DOPA和我-二羟基苯乙酸（DOPAC）值尚未校正回收率。

在异氟醚麻醉下，将探针植入大鼠体内，坐标如下：前缘+0.0 mm，前缘外侧−3.0 mm，硬脑膜腹侧−5.5 mm，切牙杆位于耳内线下方−3.3 mm。

微透析实验按所述进行(Leff等人，1998年). 第一个微透析实验旨在检测BH₄依赖我-rAAV感染的DA缺失纹状体产生DOPA。微透析方案包括五个连续的基线样品，其中林格溶液通过探针。从第六个采样周期开始，200μ米伯克希尔哈撒韦₄（Research Biochemicals，Natick MA）添加到林格溶液中，并通过探针灌注2.5小时（10个样品）；BH开始后1.25小时（五个样品）₄灌流，50 mg/kg中央我-每只动物腹腔注射芳香族氨基酸脱羧酶（AADC）抑制剂NSD-1015（RBI）；以及1.25小时后（五个样本），对BH进行探针内灌注₄停止使用，并用Ringer溶液替换45分钟（三个样品）。这些动物被允许醒来，然后放回它们的抱桶中过夜12-18小时。

微透析的第二天旨在确定我-rAAV–TH感染动物中检测到的多巴胺通过去极化依赖机制释放。第二次微透析与第一次相同，但第三次开始时为100 m米将KCl添加到林格溶液中（此外，为了尽可能保持溶液的渗透压稳定，从林格溶液中将所有NaCl去除），并在15分钟采样期结束时去除KCl。在第一次微透析过程中，在第六个样本开始时，BH₄添加到通过探针灌注的Ringer溶液中。45分钟后，另一个100米的样本米进行KCl去极化刺激，45分钟后实验结束。然后将这些动物全身注射NSD-1015，并在1.5–2.0小时后处死。除了本次微透析实验中的动物外，还将三只先前未成年的大鼠植入了上述单侧透析探针，并进行了一项实验，在采集了三个基线微透析样品后，将一个100 m的探针插入其中米进行KCl灌注，并对透析液进行DA分析，以证明KCl方案的疗效(Kalén等人，1988年;Mandel等人，1994年).

在处死动物时，将其大脑置于4°C PBS中数分钟，然后置于Kopf大鼠脑组织切片装置中，并在透析探针植入区域去除3mm冠状纹状体切片。然后从注射道的背侧和腹侧取组织穿孔（直径2×2mm）。

高效液相色谱法。的级别我-使用C-18，3×150 mm Hypersil ODS（Keystone Scientific）色谱柱和ESA Coulochem II电化学检测器，通过反相HPLC分析20μl样品中的DOPA、DA和DOPAC(Leff等人，1998年). 此HPLC分析优化用于检测我-多巴。在这种方法中，DA的峰值出现在DOPAC峰值之后。因此，不可能对所有样本从透析液中进行DA定量；然而，DOPAC测定是可靠的。因此，DOPAC数据作为DA存在的指标，因为纹状体DA的代谢导致DOPAC的形成。

免疫印迹法。在15 vol冰镇均质缓冲液中通过超声（Branson Sonifer 250；输出设置为2，20%占空比×5–10 sec）使脑穿孔（～10 mg湿重）均质，部分样品在2×Tris-glycine SDS样品缓冲液中以1:1稀释。如前所述进行免疫印迹(Leff等人，1998年)使用1:1000稀释的单克隆抗鼠TH抗体（MAB 318，Chemicon）。

抗人GTPCHI的抗血清。使用与KLH偶联的合成12氨基酸（GFPERDPPRPGP，aa 21–32）肽作为抗原，在兔子体内培养抗hGTPCHI抗体。注射方案、部位和佐剂如前所述(Hurn和Chantler，1980年;Sigel等人，1983年). 在第一次生产出血时观察到血清对免疫抗原和表达的hGTPCHI的反应，并通过超过94天的三次额外增强。使用蛋白A Sepharose亲和层析纯化IgG。使用rAAV–MD–hGTPCHI转导的HeLa细胞进行的免疫印迹实验证实了GTPCHI-抗体的特异性。rAAV–MD–hGTPCHI转导的HeLa细胞，但非转导的HeLa细胞或rAAV-MD–hTH2转导的HiLa细胞在hGTPCH单体的预测分子量（～29 kDa）处显示出正带。

组织学。每只动物均用戊巴比妥腹腔内深度麻醉，并用无菌PBS经主动脉灌注，然后灌注冰镇4%多聚甲醛（PFA）。将大脑从颅骨中取出，浸泡在4%PFA中24小时后固定，然后转移到30%蔗糖/PBS溶液中3-4天，直到大脑沉入容器底部。然后将大脑冷冻在干冰上，并在滑动切片机上切割40μm厚的冠状切片。切片收集在含有甘油基防冻液的连续微量滴定板中，并在进一步处理之前保持在−30°C。

按照上述一般程序进行免疫细胞化学(Sternberger等人，1970年). 在多次PBS冲洗并在3%过氧化氢中孵育后，将切片放置在一级抗体升高物种的3%正常血清中[即TH的正常马血清和GTPCHI（Vector Laboratories）的正常山羊血清中30分钟，以阻断非特异性抗原]。阻断步骤之后是一级抗体培养，这取决于一级抗体。使用单克隆抗TH抗体（在PBS中用1%NHS和0.1%Triton X-100以1:1000稀释液稀释）在室温下进行TH染色18小时。然后在PBS中清洗冠状切片，并将其安装在玻璃载玻片上。GTPCHI的免疫细胞化学染色与TH的免疫组织化学染色类似，但切片仅与GTPCHI-一级抗体（1:1000）短暂孵育（1-5分钟）。

为了研究表达TH的rAAV感染细胞的身份，将抗TH单克隆抗体与抗神经特异性核抗原NeuN单克隆抗体结合，对脑组织进行双重标记(Mullen等人，1992年)或GFAP（Chemicon）。游离冠状切片在室温下以1:1000的稀释度在抗TH抗体中孵育过夜。然后在室温下用1:100稀释的NeuN抗体进行隔夜培养，并根据以下方法使用酶联荧光（ELF）-AP免疫组织化学试剂盒（分子探针、尤金、OR）进行荧光检测Larison等人（1995年）.

细胞数的测定。细胞计数由观察者进行，观察者对实验组或任何受试者的生存时间都是盲的。在冠状面上进行组织切片，所有TH⁺两名独立观察者对特定纹状体切片中的细胞进行计数。细胞计数为TH⁺如果要计数的物体具有比周围背景更暗的染色质染色，并且可以清楚地识别为具有至少一个过程的细胞。因此，可能是细胞近端的小（<10μm）圆形深色“斑点”未被计算在内。计算细胞总数时，首先确定病变的最前面和最后面的范围，然后将含有TH表达细胞的切片数量乘以40μm，计算感染区域的总长度。计数的截面间距至少为480μm。TH的平均数量⁺然后使用以下方法校正每个截面的细胞阿伯克龙比（1946）然后将校正后的细胞数乘以感染部位的长度，计算出总细胞数。在揭示一只动物属于哪个实验组之前，对每只动物都遵循这种方法。因为细胞计数的计算不符合当前无偏见的体视学方法(Gundersen等人，1988a,b条)，这些计数并不代表实际的感染细胞数，但足以用于相对比较。

统计。因子方差分析用于确定显著差异的概率（a水平为第页< 0.05). 使用重复测量ANOVA进行统计分析微透析实验。简单主效果的分层方法事后（post-hoc）分析如下所述柯克（1968）被跟踪。如果遇到显著的时间样本×组交互作用，则在适当的情况下测试特定时间点的个别组差异。

结果

rAAV介导的hTH和hGTPCHI基因表达的持续性

为了确定rAAV交付后纹状体基因表达的持续性，注射rAAV–hTH和rAAV-hGTPCHI载体，并进行组织学分析（图。1-3). 两种hTH表达（图。​（图1，1,​,3三A–D)和hGTPCHI表达式（图。​（图22E、 F类)在rAAV注射后3周和6个月出现。rAAV–MD–hTH转导组织的TH染色的典型示例（图。​（图1），1)rAAV–MD–hGTPCHI转导的纹状体组织的GTPCH染色（图。​（图22E、 F类)和对照组织的TH染色[PBS注射（图。​（图22A、 B类)和rAAV–MD–hGTPCHI注射（图。​（图22C、 D类)]手术后3周，PBS注射和载体注射均出现最小的组织破坏。对hTH表达细胞和hGTPCHI表达细胞的形态学检查表明，这些细胞主要是神经元。

在单独的窗口中打开

图1。

rAAV感染3周后进行TH免疫细胞化学染色。低放大倍数A类和C类显示相对于整个纹状体大小的感染扩散。相对于右半球，左半球的TH染色明显，因为动物受到单侧6-OHDA损伤，以耗尽右半球的背景TH。B类和D类包含中存在的场的高倍放大A类和C类.放大面积B类和D类由箭头在里面A类和C类由于注射针在手术过程中拔出了3 mm，因此在所有示例中，转基因表达区域的背腹范围为3–4 mm。真实航向⁺划定感染区域的细胞的内侧-外侧范围约为0.7毫米，前后扩散1.2毫米。A类和B类和C类和D类包含感染后3周，分别用1μl rAAV–MD–hTH和rAAV-MD–h TH和r AAV–MD–hGTPCHI 1:1混合物感染TH缺失半球后的新纹状体视图。在B类在该区域的下部存在少量含铁血黄素，表明注射的精确区域显示该区域的组织几乎没有破坏。尽管在这些动物中只注射了一半的rAAV–MD–hTH载体（0.5μl），但TH染色的强度仍与未稀释的载体注射相当(A类和B类)（另请参见图。​图4）。4). 比例尺：A、 C类，2毫米；B、 D类, 100 μ米.

在单独的窗口中打开

图2。

注射3周后1μl PBS和rAAV–MD–hGTPCHI感染的纹状体TH免疫细胞化学染色(A–D)注射后3周对rAAV–hGTPCHI感染的纹状体进行GTPCH染色(E、 F类).A类图为一只动物的冠状脑切片的TH染色低倍视图，该动物在6-OHDA敏感纹状体中注射了1μl PBS。注射部位在背侧纹状体中清晰可见。B类显示PBS注射部位放大倍数较高，注射3周后仍含有残余含铁血黄素。C类包含3周前接受1μl rAAV–MD–hGTPCHI注射的动物纹状体的低倍TH染色。D类显示了同一区域的高倍放大。电子和F类显示组织学处理前3周接受rAAV–MD–hGTPCHI的动物的hGTPCH免疫细胞化学染色的低倍和高倍放大。GTPCHI抗体是针对人类蛋白而产生的，并且不会与完整半球中存在的大鼠GTPCHI发生交叉反应。图中显示的放大面积B、 D类、和F类由箭头在里面A类,C类、和电子.比例尺：A、 C、F，2毫米；B、 D、E, 100 μ米.

在单独的窗口中打开

图3。

载体注射6个月后，rAAV感染纹状体的TH染色。所示图与图相同​图1，1，其中面板位于正确的包含面板的rAAV感染区域内的场的更高放大倍数左边图中所示的组织学来自于在与图中所述相同的手术过程中准备的动物​图1。1.A类和C类包含单侧6-OHDA致敏大鼠在每只受损动物中注射1μl rAAV 6个月后冠状切片的低倍显微照片。低倍放大显示感染区域的范围。图中显示的放大区域B类和D类由箭头在里面A类和C类.A类和B类包含来自感染rAAV–MD–hTH的动物代表性样本的图片（对比图。​图1，1,A类和B类).C类和D类包含接受rAAV–MD–hGTPCHI和rAAV-MD–h TH 1:1混合物的动物示例。比例尺：A、 C类，2毫米；B、 D类, 100 μ米.

对存活3周的rAAV转基因动物的切片进行苏木精和伊红染色，并进行组织病理学检查（数据未显示）。虽然有明确证据表明大多数病例中存在含有含铁血黄素的针道，但附近的血管没有单核细胞浸润或袖套。

在3周处理的TH染色组织切片上进行细胞计数(n个=6）和6个月(n个=9）感染后，每个rAAV–hTH转基因动物的估计细胞数如图所示​图4。4细胞计数数据表明，在3周至6个月之间，表达hTH转基因的细胞数量下降了四倍(F类_(1,13)= 4.7;第页=0.05），与之前报道的使用CMV启动子的其他类型病毒载体的下降相似(郭等，1996;Neve和Geller，1996年). 然而，估计的TH⁺注射1μl载体6个月后，细胞数量仍保持在400–2000范围内，与TH数量相比，转基因表达仍相对显著⁺胎儿腹侧中脑移植环境中功能作用所必需的细胞(Brundin等人，1988年). 对接受PBS或rAAV–MD–hGTPCHI的动物的一些TH染色切片进行了检查，发现没有纹状体TH⁺受损侧的细胞（数据未显示）。

在单独的窗口中打开

图4。

纹状体TH⁺3周和6个月前感染rAAV–MD–hTH的动物的细胞计数。平均Abercrombie校正TH⁺用rAAV–MD–TH转导后3周处理的动物细胞计数（+SEM）表示为黑色条，rAAV转基因动物存活6个月的平均校正细胞数表示为露天酒吧. The星号表明TH数量显著减少⁺6个月时的细胞(第页= 0.05).

一组单独的部分6-OHDA诱导的rAAV–MD–hTH注射动物(n个=3）被允许存活1年。剩余TH⁺内侧纹状体的纤维清晰可见（图。​（图5），5)，表明这些动物纹状体DA耗竭的部分性质。TH免疫细胞化学染色在所有三只动物的纹状体细胞体中均有不同程度的表达。因为TH⁺正常情况下，大鼠纹状体中未发现神经元，存在TH⁺细胞体只能归因于rAAV注射1年后转基因的持续表达（图。​（图5）。5). 6个月时hTH表达的定量比较（图。​（图3）三)和1年（图。​（图5）5)因为这两个时间点是从单独实验中使用的动物身上获取的。此外，存活6个月的动物接受1μl载体，存活1年的动物接受2μl载体。

在单独的窗口中打开

图5。

载体注射1年后，对rAAV–MD–hTH感染的纹状体进行TH染色。此图的排列与图相同​图11和​和3，三，其中面板位于正确的包含面板的rAAV感染区域内的场的更高放大倍数左边.放大面积B类由指示箭头在里面A类图中显示的组织学来自一组单独的部分6-OHDA致敏大鼠，这些大鼠在1年前接受了rAAV–MD–hTH。在这些动物中观察到的转基因表达水平无法与图中所示的水平直接比较​图11和​和3三因为这里显示的动物没有接受相同的手术。比例尺：A类，2毫米；B类, 100 μ米.

rAAV介导基因表达的神经特异性

为了量化作为神经元的转基因表达细胞的比例，对rAAV–hTH转基因动物的纹状体切片进行双重染色程序，其中hTH用光镜色素（VIP，Vector Laboratories）和NeuN（神经元特异性标记物）进行免疫细胞化学检测，用ELF（一种荧光色素）进行免疫细胞化学检测。由于ELF色氨酸的极端强度，低水平可见光和荧光可以同时投射到切片中，从而识别双染色细胞进行计数（图。​（图6A）。6A） ●●●●。TH–NeuN双重染色研究的数据如表所示​表2。2这些数据表明，绝大多数（>90%）表达hTH转基因的纹状体细胞是神经元。

在单独的窗口中打开

图6。

rAAV介导的hTH表达的神经元特异性。A类包含从处理前3周接受rAAV–MD–hTH的动物身上采集的NeuN–TH双染色的两个相邻区域的蒙太奇。晕倒的人黄色的染色是ELF标记的神经元NeuN染色，颜色越深灰绿色染色(箭头)对应于TH⁺细胞。在这些字段中，所有TH⁺细胞用NeuN标记进行双重染色。B类显示了GFAP–TH双染色部分的两个相邻区域的蒙太奇的代表性部分。GFAP染色是黄色的纤维染色和TH染色细胞(箭头)颜色更深吗灰绿色.无TH⁺在这个例子中，细胞是双重染色的。

表2。

rAAV–MD–TH表达的神经元特异性

rAAV载体	神经元特异性			星形细胞特异性
	n个	真实航向+采样的单元格	NeuN公司+/第+双重染色（%）	n个	真实航向+采样的单元格	GFAP公司+/TH公司+双重染色（%）
MD–TH公司	三	414	92.5	4	786	1.3
MD–TH+MD–GTPCHI公司	三	1187	96.2	三	807	1.2

在单独的窗口中打开

至少100 TH⁺每只动物采集细胞样本。n个指TH来源的动物数量⁺对每个载体组的细胞进行采样。在桌子的左半部分，TH⁺采样的单元格表示TH的总数⁺对各组细胞进行NeuN免疫反应性评分。MD–TH+MD–GTPCHI组的细胞采样数较多是巧合，并不意味着TH较多⁺这些动物中的细胞比MD–TH组中的细胞多。TH的百分比⁺也是NeuN的细胞⁺第四列显示了每个取样组的情况。在桌子的右半部分，TH⁺采样的单元格表示TH的总数⁺各组细胞GFAP免疫反应评分。TH的百分比⁺也是GFAP的细胞⁺最后一列显示了每个采样组的情况。

为了研究TH免疫阳性但NeuN阴性的小百分比细胞的身份，使用了类似的光荧光双染色研究，其中GFAP是一种星形细胞标记物，替代了NeuN神经元标记物。图​图66B类显示了TH（可见光铬）–GFAP（荧光铬）双重染色纹状体切片的示例的显微照片。TH细胞计数数据⁺GFAP双重染色的细胞百分比如表所示​表2。2这些数据表明，表达hTH转基因的纹状体细胞中<1%是星形胶质细胞，并且考虑到使用该技术检测假阳性的可能性，这一小部分表达的星形胶质细胞不应被认为是显著的。

脱吗啡诱导的旋转行为

在开始微透析实验之前，对大鼠进行细胞特异性表达或我-通过微透析产生多巴胺接受感染后脱吗啡诱导的旋转行为治疗(n个=每组12个）（图。​（图7）。7). 尽管所有组（旋转前与旋转后）无吗啡诱导的旋转略有减少（-20%），F类_{(1, 44)}= 5.1;第页=0.03），在rAAV感染之前或之后，两组之间没有显著差异（组的主要作用，F类_{(3, 44)}= 0.1;第页>0.95），也没有任何单个组显示感染后旋转行为减少（X组感染前/感染后相互作用，F类_(3,44)= 1.1;第页= 0.35). 这些动物被用于细胞特异性的组织学分析（如上所述）或微透析实验（如下所述）。

在单独的窗口中打开

图7。

rAAV注射对脱吗啡诱导的旋转行为的影响。这些组沿着其接收到的rAAV构造的纵坐标进行识别。这个阴影条表示纹状体内载体注射（+SEM）前获得的数据，以及实心钢筋代表纹状体内载体感染3周后脱吗啡诱导的对侧旋转水平。注射rAAV前后两组间无显著差异（统计数据见结果）。每个小节代表12个观测值的平均值。

rAAV–MD–hTH介导我-DOPA生产

微透析实验结果如图所示​图88和​和9。9第一个实验（图。​（图8）8)调查AAV是否介导纹状体过度表达我-在存在或不存在外源性BH的情况下，可以在透析液中测量DOPA₄.提高测量任何转基因产品的概率我-DOPA，CNS AADC活动在BH中途被NSD-1015阻断₄灌输。该实验的数据表明，只有接受rAAV–MD–hTH和rAAV–MD–hGTPCHI载体1:1混合物的大鼠组产生了可测量的我-添加外源BH前的DOPA水平₄（最初1.25小时）（图。​（图88A类). BH开始后₄输液（200μ米)，rAAV–MD–hTH转导组开始产生可测量的我-DOPA水平。尽管在测量我-各组间DOPA水平(F类_(3,23)= 4.4;第页<0.01），这种影响完全归因于1:1 rAAV–MD–hTH和rAAV–MD–hGTPCHI混合物组显示出显著更大我-DOPA水平高于所有其他组（简单的主要影响，第页<0.05）。添加BH₄对透析液没有显著增强我-1:1 rAAV–MD–hTH和rAAV-MD–hGTPCHI混合物组的DOPA水平(F类_(1,23)= 1.6;第页>0.1），但阻断中枢神经系统AADC活性的NSD-1015的额外注射确实显著增强了该组的我-相对于先前样本的DOPA水平(F类_(1,23)= 7.4;第页= 0.01). 正如我-与rAAV-MD-hAP-和rAAV-MD-hGTPCHI注射对照组相比，注射1:1 rAAV-MD-hTH和rAAV MD-hGTPCH混合物的组显示DA代谢物DOPAC水平显著升高(F类_(1,23)= 13.9,第页< 0.001;F类_(1,23)= 11.4,第页分别=0.001）（图。​（图88B类). DOPAC的这些水平表明，动物的纹状体DA转换水平较高。正如预期的那样，注射NSD-1015显著阻断了1:1 rAAV–MD–hTH和rAAV-MD–hGTPCHI混合物注射组中测得的DOPAC（前九个样品与注射NSD-015后的九个样品的比较：F类_(1,23)= 13.1;第页< 0.001). 没有其他rAAV注射组在其透析液中显示显著的DOPAC水平(第页> 0.5). 然而，在除rAAV–MD–hTH和rAAV-hGTPCHI混合组之外的一些治疗组中，BH前的水平非常低₄DOPAC水平是可观察到的，但这些水平可能是6-OHDA损伤严重程度的指标，和转基因表达无关。

在单独的窗口中打开

图8。

我-在存在或不存在外源性BH的情况下，rAAV注射3周后DOPA的产生和DOPAC水平₄纹状体内微透析测定。图图例中显示了代表每个rAAV注射组的符号及其相应的“n”号A类和B类. The矩形在中的图形下A类和B类表示200μ的输液持续时间米伯克希尔哈撒韦₄在探针中。A类表示平均值我-从每个rAAV组采集的15分钟微透析液中测量DOPA水平（+SEM）。数据表示为纳克/毫克，如横坐标所示（用于比较：1 ng/ml=5.1μ米). 这个封闭支架（]）后跟单个星号表明整个曲线与rAAV–MD–hAP和rAAV-MD–h GTPCHI这两个对照组显著不同。这个封闭支架（]）然后是双星号表明整个曲线与所有其他组显著不同。B类包含DA代谢物DOPAC（+SEM）的平均水平，从中报告的相同透析液样品中测量A类.双星号表明所有其他组的统计显著性，而单个星号表明与rAAV–MD–hAP和rAAV-MD–h GTPCHI这两个对照组之间存在显著差异。 

在单独的窗口中打开

图9。

我-在存在或不存在外源性BH的情况下，rAAV注射3周后DOPA的产生和DOPAC水平₄纹状体内微透析测量：KCl输注对去极化的影响。代表每个rAAV注入组的符号及其相应的“n”编号如图图例所示A类和B类. The矩形在中的图形下A类和B类表示200μ的输液持续时间米伯克希尔哈撒韦₄在探针中。这个箭头指示15分钟样品，其中100米米在两种透析液中均添加KClA类和B类本实验使用的动物与图中使用的动物相同​图88并且发生在该实验之后24小时。A类表示平均值我-从每个rAAV组采集的15分钟微透析液中测量DOPA水平（+SEM）。添加BH之前₄，只有接受1:1 rAAV–MD–hTH和rAAV–MD–hGTPCHI混合物三元体内注射的组显示出显著的我-多巴。然而，与图​图8，8，两只接受纹状体内rAAV–MD–hTH治疗的动物确实表现出持续低水平的我-BH之前的DOPA₄输液（1-2纳克/毫升）。双星号表明所有其他组的统计显著性，而单个星号表明与rAAV–MD–hAP和rAAV-MD–h GTPCHI这两个对照组之间存在显著差异。

第二次微透析实验（图。​（图9），9)24小时后进行，旨在确定rAAV感染介导的纹状体我-DOPA水平会对透析探针（100 m）区域神经元去极化的刺激作出反应米KCl）。这些测量也是在存在或不存在外源BH的情况下进行的₄与第一次微透析实验类似，只有转染rAAV–MD–hTH和rAAV-MD–hGTPCHI 1:1混合物的大鼠组表现出可测量的我-BH输注前DOPA₄（图。​（图99A类). 接受rAAV混合物的三腔内注射的动物表现出明显更多的我-DOPA释放量高于所有其他实验组(F类_(1,21)= 9.9;第页= 0.005). 伯克希尔哈撒韦₄输液提高了我-从接受载体混合物的动物和接受rAAV–MD–hTH的六只大鼠中，有四只显示出持续可检测到DOPA我-BH后的DOPA水平₄灌输。100m输液米BH前KCl 15分钟₄输液（样品3）和BH后₄输液（样品10）对我-DOPA水平(第页> 0.05; 对波黑之前的情况进行了独立的比较₄样品和BH后₄样品）。图中的插图​图99A类显示了三只未经治疗的大鼠的平均DA（+SEM）测量值。实验开始后60分钟，100米米将KCl加入透析液中15分钟，然后取出。插图显示，本实验中使用的KCl方案确实会导致局部去极化，从而导致神经递质释放增加。这些数据清楚地表明米KCl仅在含高钾浓度的样品中诱导DA的显著释放。图​图99B类包含从图中报告的相同透析液样品测量的DOPAC（+SEM）平均水平​图99A类与所有其他rAAV注射组相比，注射rAAV–MD–hTH和rAAV-MD–hGTPCHI 1:1混合物的动物纹状体内显示纹状体DOPAC水平显著升高(F类_(1,21)= 24.1;第页< 0.001). 尽管来自rAAV–MD–hTH注射组的相同动物表现出可测量我-DOPA水平（图。​（图99A类)还显示了可测量的DOPAC水平，这些水平与rAAV–MD–hGTPCHI和rAAV-MD–hAP注射对照组没有显著差异(F类_(1,21)= 0.5;第页> 0.6). 增加100 m米KCl对任何载体注射组的DOPAC测量值均无影响，这反映在缺乏明显的时间进程主效应(F类_(13,273)= 1.4;第页>0.6）和非显著群体×时间进程交互作用(F类_(39,273)= 0.7;第页> 0.9).

图​图1010包含免疫印迹分析的典型示例（图。​（图10，10,底部)和我-DOPA组织水平（图。​（图10，10,顶部)在第二次微透析实验停止后立即服用NSD-1015 1.5小时后，从组织穿刺处获得。这些数据证实了微透析数据，即所有接受编码hTH的rAAV感染的动物（rAAV–MD–hTH和1:1 rAAV-MD–h TH+rAAV？MD–hGTPCHI组）在hTH预期大小上显示出阳性蛋白带，并且这些相同组的组织水平为我-混合矢量转导组显示最大的DOPA我-DOPA水平。

在单独的窗口中打开

图10。

我-从rAAV感染纹状体的穿孔处测得的DOPA水平和免疫印迹显示抗TH免疫反应。顶部，我-DOPA水平。透析实验中使用的动物（图。​（图9，9,​,10)10)停止采样后立即注射NSD-1015（50 mg/kg，i.p.）。90分钟至2小时后，从取出微透析探针后留下的尿道区域取出纹状体穿孔。这个单个星号表示我-从rAAV–MD–hTH组的打孔测量DOPA水平(n个=6）显著高于rAAV–MD–hGTPCHI组的测量值(n个=4）或rAAV–MD–hAP组(n个= 7;F类_(1,20)= 5.2;第页= 0.03). 这个双星号表示接受1:1 rAAV–MD–hTH和rAAV-MD–hGTPCHI混合物的组(n个=6）纹状体显著增高我-DOPA含量高于其他组(F类_(1,20)= 20.3;第页< 0.001).底部，rAAV感染纹状体穿孔匀浆的免疫印迹显示抗TH免疫反应。车道1(标准)显示了来自未受损大鼠纹状体的0.1μg蛋白质与通过逆转录病毒载体MFG–hTH2转导的1000只大鼠成纤维细胞的蛋白质混合(Leff等人，1998年). 内源性大鼠基因（rTH）和转导的人类cDNA（hTH）表达的蛋白质因在rTH中未发现的hTH2变异体中发现的四氨基酸插入而按大小区分。从感染AAV载体的受损纹状体的穿孔匀浆中提取的蛋白质（5μg）在车道上流动2通过7rTH的相对带强度显示6-OHDA损伤后残留的rTH。车道中存在相对丰富的hTH波段4–7，包括AAV–MD–hTH载体的感染。非特异性高分子量条带是由与二级抗体的交叉反应引起的，因为当不使用一级抗TH抗体时，这些条带也存在。分子量标记显示在正确的污点的侧面。

对与微透析研究中使用的动物同时制备的注射rAAV–MD–hAP的单独6-OHDA动物组进行hAP免疫组化检测，纹状体显示阳性染色，表明该组是一个合适的转导对照组。

讨论

目前的数据表明，在巨细胞病毒（CMV）启动子（MD）的控制下，rAAV介导的纹状体转基因表达至少可以持续1年。最近有报道称，一种编码人类TH的载体在直接注射rAAV后纹状体转基因表达长达4或7个月(Kaplitt等人，1994年;1996年期间和塞拉利昂). 这些研究人员还报告说，在这段时间内，基因表达似乎有所下降。此处提供的数据与先前的报告吻合良好。

本实验还量化了表达rAAV转基因的神经元相对于星形胶质细胞的相对丰度。结果表明，表达hTH转基因的纹状体细胞绝大多数是神经元（>90%vs<1%）。rAAV介导的纹状体转基因表达的神经元特异性先前已在表达细胞的形态学检查的基础上提出，但尚未定量(Kaplitt和During，1996年)，但已报道使用rAAV–CMV在星形胶质细胞中有更大比例的rAAV介导的转基因表达-lacZ公司(Blömer等人，1997年). 最近报道了重组复制缺陷型慢病毒在纹状体中表达转基因的类似神经元特异性(Naldini等人，1996年). 这种特异性的机制目前尚不清楚，但显然与转基因无关（hGTPCHI的表达似乎是神经元的形态学标准，与hTH相似）。这些数据表明，表达的神经元特异性或偏差可归因于rAAV感染或表达过程本身的某些性质，或两者兼有。

这里的微透析数据代表了首次使用rAAV报告纹状体测量的研究我-多巴胺合成正常生化途径中基因转基因表达产生的多巴胺。微透析数据我-DOPA和DOPAC产量如图所示​图88和​和9。9未显示DA数据，因为DA水平并非始终高于我们的检测限（1 ng/ml）。然而，由于DOPAC是DA的代谢物，透析液中纹状体DOPAC的存在强烈提示纹状体DA的存在。此外，注射NSD-1015后观察到的DOPAC下降清楚地表明，在动物体内我-合成了DOPA我-AADC将DOPA转换为DA。推测，在6-羟多巴胺敏感纹状体中没有多巴胺能终末的情况下，单胺氧化酶对多巴胺的快速转换导致细胞外多巴胺水平无法测量。

这里提供的数据清楚地表明，某种形式的BH₄为了让转基因TH合成，必须进行传递我-据报道，6-羟多巴胺敏感纹状体中的多巴胺。BH初级合成酶的共感染₄、GTPCHI或BH的外源性局部应用₄与hTH表达一起，足以测量纹状体我-多巴。这一发现与先前报道的经GTPCHI和TH逆转录的大鼠皮肤成纤维细胞微透析研究一致(Bencsics等人，1996年;Leff等人，1998年)或添加BH₄(Uchida等人，1992年). 由于并非所有纹状体神经元都同时感染了GTPCHI和TH体内这里的数据表明BH的跨细胞效应₄TH活性可能发生，即BH₄或者二氢生物蝶呤可能能够离开一个细胞，并在另一个细胞中可能通过二氢生物蝶呤还原酶再循环后发挥协同因子的作用。事实上，我们和其他人之前已经收集到在体外数据也表明BH的跨细胞效应₄TH活性可能发生(Anastasiadis等人，1994年;Leff等人，1998年).

BH的可能性₄通过跨细胞转运影响TH活性提出了纹状体BH是否足够的问题₄保留在PD患者中以使转基因TH表达成为治疗通过局部合成我-多巴。在完整的大鼠纹状体中，BH水平₄据报道为～1μ米(Levine等人，1979年)单侧6-OHDA损伤使TH活性降低93%，BH降低₄水平73%，表明大多数纹状体BH₄位于黑纹状体DA终端(Levine等人，1981年). 因此，即使所有BH₄残留在DA失神经纹状体中的黑质纹状体终末外的细胞室可用，<1μ米可用于hTH转导的细胞。因为K（K）_米BH的₄据报道，磷酸化TH的活化为10–30μ米(Levine等人，1981年)内源性BH水平低₄在受损的纹状体中，预计不会产生太多TH活性，因此我-多巴。实际上，在本研究中，BH的灌注₄通过微透析探针检测纹状体我-rAAV–MD–hTH注射组的多巴胺。伯克希尔哈撒韦₄输液可能导致局部浓度估计为40μ米伯克希尔哈撒韦₄(200 μ米×20%探针回收率），导致可测量但低水平的我-多巴生产。类似于6-OHDA损伤模型中的情况，BH₄已证明PD降低(Lovenberg等人，1979年;Nagatsu等人，1981年,1984;LeWitt等人，1984年). 考虑到BH₄存在于完整纹状体组织中的低水平我-TH合成多巴非常依赖BH₄辅因子，似乎GTPCHI必须是共表达或外源性BH₄必须与TH一起提供，用于生产我-在任何尝试中都要实现DOPA我-多巴基因治疗帕金森病。

根据这里提供的数据，表明绝大多数表达rAAV转基因的纹状体细胞是神经元，转基因产生的出口模式我-DOPA成为一个重要问题。在第二次微透析实验中（图。​（图6），6)，发出去极化刺激通过微透析探针检测纹状体我-多巴是通过一种电致依赖机制释放的。添加过量钾对我-DOPA或DOPAC，无论BH的状态如何₄因此，转基因产生的我-多巴胺通过与囊泡结合神经递质不同的机制从rAAV转导的纹状体神经元释放。因为我-多巴是一种氨基酸，是我-在这种情况下，DOPA是通过组成性中性氨基酸转运机制。因此，这些神经元的正常功能可能不会被从头开始合成我-多巴。

虽然目前的研究表明rAAV介导的纹状体我-6-OHDA致敏大鼠的多巴胺合成对行为无影响。在大鼠帕金森病单侧6-OHDA损伤模型中，脱氧吗啡诱导的旋转行为减少目前被用作多巴胺能张力增加的重要指标。对脱附吗啡诱导旋转行为范式变化的预期源于提出的减少脱附吗啉诱导旋转的生物学机制，即纹状体DA受体超敏反应的降低(Freed等人，1983年;Cenci等人，1992年). 此外，胎儿黑质移植文献中阿朴吗啡诱导的旋转减少与具有类似移植的PD患者的临床结果之间的一致性表明，该试验可能是临床预测性的(林德瓦尔和奥丁，1994年;林德瓦尔，1995年). 尽管在这个实验中BH₄-独立的，独立的我-注射后3-4周，在感染1:1 rAAV–MD–hTH和rAAV-MD–hGTPCHI混合物的所有动物中可靠地测量了DOPA水平，在任何一组中，无吗啡诱导的旋转没有显著减少。本实验中观察到的旋转行为缺乏影响有两个潜在原因。纹状体的水平我-感染细胞释放的多巴胺不足以降低这些动物的行为超敏性或慢性持续性我-DOPA不影响脱吗啡诱导的旋转行为。假设不足我-根据本文提供的数据，DOPA的产生是为了影响无吗啡诱导的旋转行为。

支持后一种可能性，即慢性我-在单侧6-OHDA损伤模型中，多巴不会减少阿扑吗啡诱导的旋转行为，其中一项研究我-使用大剂量全身给药长期给药4周我-DOPA报告增加或无变化的无吗啡诱导旋转我-DOPA剂量(格纳宁厄姆和罗伯逊，1993年). 另外两项研究考察了连续两次运动后对去吗啡肽诱导的旋转的影响我-DOPA通过渗透微型泵输送（19天）或每日注射（10天）(Engber等人，1989年;Asin等人，1995年). 在这两项研究中，慢性非吗啡肽诱导的旋转增加我-DOPA治疗，但这些研究也指出了对D-1和D-2激动剂诱导的旋转行为的不同影响。尽管如此，在任何慢性给药方案治疗后，无吗啡肽诱导的旋转行为均未见显著下降的报道我-DOPA管理。据观察，慢性我-DOPA在单侧6-OHDA诱导的DA失神经后可提高纹状体神经肽的表达水平(Engber等人，1991年). 因此，在未来的研究中，使用这种基因转移范式来产生纹状体我-多巴胺失神经后纹状体神经肽水平的测定可能提供脱吗啡诱导的旋转行为和转基因的功能效应之间的分离我-这些纹状体肽上的多巴胺将有助于解决这个问题。

我们调查结果的几个方面我-rAAV-TH转导后DOPA的产生与另一项涉及向6-OHDA致敏大鼠纹状体注射HSV-TH的研究不一致(During等人，1994年). 首先，这些作者报告了可测量的我-无外源性BH的HSV-TH感染后DOPA释放₄在HSV–TH研究中我-NSD-1015后透析样品中DOPA水平大约是纹状体联合注射rAAV hTH和hGTPCHI后本研究中获得的DOPA水平的两倍，尽管HSV研究中的感染效率（每纹状体5–200 TH-免疫阳性细胞）远低于250–9500（阿伯克龙比校正计数；感染rAAV–MD–TH后观察到原始计数增加2–10倍。两项研究都报告了使用具有完全6-OHDA损伤的动物，通过阿扑吗啡诱导的旋转进行检测。然而，在HSV研究中我-DOPA（>50 n米)在6-OHDA致敏的对照动物中获得，即使在NSD-1015治疗和应用外源性BH后，本研究中也不是这样₄.存在可测量的我-HSV-TH报告中对照组受损纹状体中的多巴胺引起了对这些动物中6-羟多巴胺损伤实际程度的担忧，这进一步使对其来源的解释复杂化我-HSV-TH感染纹状体的多巴胺(During等人，1994年).

我们的研究结果与HSV–TH研究的第二个主要差异是观察到HSV–TH感染动物中去极化诱导的DA释放(During等人，1994年). 在HSV–TH研究中，对照动物中存在去极化诱导的DA释放，这表明微透析探针附近存在残余的DA纤维，这使得对HSV–TH实验组中去极化诱导的DA释放的解释变得困难(During等人，1994年). 然而，如果HSV介导的TH基因表达是导致感染动物体内去极化依赖性DA释放增加的原因，那么这可能表明DA合成是转基因的结果我-DOPA的产生被囊泡化并以生理方式释放。然而，纹状体5-羟色胺能神经元，即6-OHDA损伤后残留AADC的一个隔室，也具有使DA囊泡化的细胞机制(Melamed等人，1979年,1980年,b条,1981;Hefti等人，1980年,1981;Mura等人，1995年)，探针区域内的数量似乎不足以支持报告的DA版本。

除了关于我-上述DOPA生成，与本文报道的结果相反，两组报告纹状体内注射Ad后，无吗啡肽诱导的旋转行为显著减少(Horelou等人，1994年)或HSV(During等人，1994年)编码6-OHDA致敏大鼠TH的载体。如上所述，纹状体我-DOPA的传递预计会导致脱吗啡诱导的旋转行为减少。此外，在纹状体内注射病毒的情况下，可能会对病毒感染或病毒蛋白的表达产生毒性反应(伊萨森，1995年;Neve和Geller，1996年)因为纹状体损伤（去除DA受体）已被证明可以减少脱吗啡素诱导的旋转，这与损伤量大致相关(巴克和邓内特，1994年)在基因治疗环境中，这种行为模式可能是一个不可靠的预测因素。因此，即使在基因治疗范式中使用适当的对照组，例如使用编码不相关转基因的相同载体，脱附吗啡诱导的旋转行为的减少可能表明TH表达组的毒性更大，而不是成功传递我-多巴(伊萨森，1995年). 该假设与可测量rAAV介导纹状体的动物的最小组织病理学观察结果一致，且无旋转下降我-在本实验中产生多巴。事实上，另外两个报告TH纹状体表达的积极行为效应的小组单独使用Ad(Horellou等人，1994年)和HSV载体(During等人，1994年)，有报道称两种载体系统会引起显著的神经毒性(伊萨森，1995年;Neve和Geller，1996年).

Ad载体研究没有测量纹状体我-多巴。因此，无法直接评估我-多巴胺或纹状体毒性引起了阿扑吗啡诱导的旋转行为的变化(Horellou等人，1994年). 此外，旋转行为减少的程度是高度可变的，实验性Ad感染组的旋转减少程度和LacZ公司控制大重叠(Horelou等人，1994年). 数据检查表明，尽管66%的Ad–TH注射大鼠在Ad感染1周后降低了其脱吗啡素诱导的旋转反应，但47%的Ad-lacZ公司动物也减少了它们的旋转行为(Horellou等人，1994年).

与纹状体PBS或HSV-LacZ公司注射(During等人，1994年). 如上所述，HSV-TH研究也报告了纹状体我-DOPA生产。然而，HSV报告中的旋转行为部分受到质疑(伊萨森，1995年). 一份针对HSV–TH研究的技术说明指出，使用与原始HSV报告中纹状体内注射相同的“……病毒库存、滴度和体积……”，观察到明显的纹状体损伤，这可能是第二个实验室观察到的HSV诱导的旋转减少的原因(伊萨森，1995年). 因此，来自另一个实验室的不同行为发现，再加上对上述6-OHDA范围的担忧，令人怀疑HSV数据是否与此处提供的数据不一致。

如前所述(Kaplitt和During，1996年;McCown等人，1996年)鉴于rAAV介导的纹状体转基因表达的寿命长，纹状体基因表达的神经元特异性，以及rAAV转为野生型并支持生产性和致病性感染的低风险性，rAAV是一种极有吸引力的脑内基因转移工具。因此，rAAV载体可能最终为开发需要以特定位点的方式持续传递基因产物的神经疾病治疗方法提供了机会。研究rAAV脑内感染的任何不良反应特征是一个重要问题，但迄今为止尚未得到充分研究。此前曾断言纹状体内注射rAAV“似乎是安全的”(Kaplitt等人，1994年;1996年期间和塞拉利昂;Kaplitt和During，1996年)但要真正得出这一结论，需要进行更详细的组织病理学检查。尽管本研究并非旨在检测毒性，但对尼塞尔染色切片进行了检测（数据未显示），以及没有明显的确定局部组织病理学。此外，如上所述，载体注射前后脱吗啡素诱导的旋转行为的稳定性有利于低毒性。在启动rAAV人体研究之前，必须确定注射参数、转基因表达和毒性之间的关系。然而，这里收集的数据和其他地方报告的数据(Kaplitt等人，1994年;Kaplitt和During，1996年)表明在中枢神经系统中使用rAAV进行人类基因治疗仍然是一种有希望的可能性。

脚注

参考文献