神经科学杂志。1998年5月1日；18(9): 3206–3212.
老年齿状回的经验诱导神经发生
,1 ,1,2和1
格德·坎佩曼
1索尔克生物研究所，遗传学实验室，加利福尼亚州拉霍亚92037，和
H.乔治·库恩
1加利福尼亚州拉霍亚遗传实验室索尔克生物研究所，邮编：92037
2德国雷根斯堡大学神经病学系，D-93053
弗雷德·盖奇
1加利福尼亚州拉霍亚遗传实验室索尔克生物研究所，邮编：92037
1加利福尼亚州拉霍亚遗传实验室索尔克生物研究所，邮编：92037
2德国雷根斯堡大学神经病学系，D-93053
1997年12月3日收到；1998年2月10日修订；1998年2月17日接受。
摘要
我们在这里证明，在生理条件下，衰老小鼠的齿状回继续发生神经发生，生活在丰富的环境中可以刺激神经发生。通过三通道免疫荧光染色的共焦显微镜观察增殖标记物溴脱氧尿苷（BrdU）以及神经元和胶质细胞标记物的神经发生。采用无偏体视学计数技术进行量化。随着年龄的增长，神经发生减少。通过将成年和老年小鼠从标准住房转换为丰富的环境，刺激其68天的社交互动、探索和身体活动，从而提高标记细胞的存活率。表型分析表明，在丰富的活动物中，分化为神经元的细胞相对较多，导致20个月大的小鼠BrdU标记神经元净增加三倍（105对32个细胞），8个月大小鼠增加两倍以上（684对285个细胞）与生活在标准实验室条件下的室友相比。BrdU阳性星形胶质细胞和未显示神经元或神经胶质标记物共标记的BrdU阴性细胞的相应绝对数量未受到影响。对表型相对分布的影响可以解释为对神经元具有选择性的生存促进效应。祖细胞的增殖似乎不受环境刺激的影响。
关键词：衰老、大脑、小鼠、海马体、神经发生、干细胞、祖细胞、丰富的环境、可塑性、体视学
成年哺乳动物海马结构的齿状回中不断产生新的神经元。在2个月大时，成年C57BL/6小鼠的齿状回平均每天每1700个现有颗粒细胞产生大约一个新的颗粒细胞神经元(Kempermann等人，1997年a). 然而，这些新细胞的功能意义尚不明确。
老化的海马结构受到许多结构和功能变化的影响，包括CA区和海马门神经元的丢失(West等人，1994年)，突触密度降低(Saito等人，1994年)以及生长因子和类固醇受体表达减少(Bhatnagar等人，1997年). 齿状回的神经发生贯穿大鼠一生(阿尔特曼和达斯，1965年;卡普兰和贝尔，1984年;Cameron等人，1993年;Kuhn等人，1996年)但随着年龄的增长而减少(Kuhn等人，1996年). 齿状回中剩余的神经发生在多大程度上受到调节并产生功能性后果尚不清楚。
我们使用了丰富环境的实验范式(Rosenzweig等人，1962年;罗森茨威格和贝内特，1996年)证明齿状回神经元数量的经验诱导可塑性(Kempermann等人，1997年b). 这一发现将成人齿状回的神经发生置于功能背景下，并提出了在老年大脑中是否可能存在使用依赖性神经可塑性的问题。
在本研究中，我们研究了生活在丰富环境中对6个月龄和18个月龄C57BL/6小鼠齿状回神经发生的影响。研究中的四组小鼠被称为Ctr-6，6个月大的对照；Ctr-18，18个月龄对照；Enr-6，6个月龄；Enr-18，18个月大。实验结束时，这些动物分别为8个月大和20个月大。考虑到雌性C57BL/6小鼠的平均寿命为26个月，这些年龄代表中年和衰老(Kunster和Leuenberger，1975年)小鼠更年期为～13个月龄(银牌，1995年). 在持续40或68天的实验期之前，所有动物都被安置在标准实验室条件下。通过（1）在增殖细胞DNA中掺入溴脱氧尿苷（BrdU）并免疫组织化学检测BrdU，（2）用免疫荧光三重标记BrdU、神经元和胶质标记物，以及共焦激光显微镜检查存活的BrdU阳性细胞的表型，来检测神经发生，以及（3）获得绝对细胞数的无偏体视学计数技术。此外，对这些动物进行了水迷宫测试，以检验空间学习作为海马功能的一种测量方法。
材料和方法
住房条件。50只雌性C57BL/6小鼠，其中一半6个月大，另一半18个月大。每个年龄组有12只动物被关在四个标准笼子里；每个年龄组13人被安置在一个丰富的环境中。丰富的生活条件如图所示与我们之前研究中的设置没有不同(Kempermann等人，1997年b). 每个年龄组都有单独的笼子和丰富的环境。实验的时间进程如图所示。动物在各自的实验条件下生活了40天。在过去的12天里，他们接受了BrdU注射（见下文）。在第41天，每组五只动物被过量麻醉剂杀死，并经心灌注4%的冷多聚甲醛米PBS公司。其余动物在各自的实验条件下继续生活28天。在此期间，对它们进行水迷宫任务测试（见下文），并在第68天进行灌注。
A类，一个用于丰富环境的笼子；B类，一个相同规模的标准笼子（取出食物和水的托盘）。丰富包括社交互动（大笼子里有13只老鼠，标准笼子里只有3只），用玩具和一组可重新排列的隧道等物体刺激探索行为，以及C类，在车轮上进行体力活动。除了标准的食物和水随意，营养丰富的老鼠偶尔会得到一些食物，包括奶酪、饼干和水果。
实验设计适用于两个年龄组中的每一个（实验开始时为6个月或18个月）。每天注射BrdU的12天周期以注射器为标志。WMZ公司，水迷宫任务的行为测试。
BrdU注射。将BrdU（Sigma，St.Louis，MO）溶解在0.9%NaCl中，并在22μm处过滤无菌。小鼠接受单剂量50μg/gm体重，浓度为10 mg/ml，每天一次腹腔注射，连续12天（图。).
水迷宫测试。每组7只小鼠在10天内每天进行两次试验。平台隐藏在不透明水的表面下。这两个起点每天都在改变。每次试验要么持续到老鼠找到平台，要么持续最长60秒。所有老鼠都可以在平台上休息10秒。到达平台的时间（潜伏期）、游泳路径长度和游泳速度的分析都是由视频跟踪系统（圣地亚哥仪器）半自动记录的。在第11天，在移除平台的情况下进行了一项探针试验，但各组之间没有差异。
免疫组织化学。如前所述，进行BrdU免疫组织化学和BrdU、NeuN和S100β免疫荧光三重标记(库恩等人，1997年). 所有染色均在40μm自由浮动切片上进行，这些切片通过DNA变性进行BrdU免疫组化预处理。使用的抗体为小鼠抗BrdU抗体（印第安纳波利斯Boehringer Mannheim），1:400；大鼠抗BrdU腹水（精确；用于三重标记），1:100；兔抗S100β（Swant），1:2500；和鼠抗NeuN抗体（由犹他州盐湖城犹他大学R.J.Mullen善意提供），1:20。为了确定BrdU阳性细胞的数量，使用过氧化物酶法对BrdU进行染色（ABC系统，使用生物素化马抗鼠抗体和二氨基苯甲醚作为染色原；加利福尼亚州伯林盖姆Vector Laboratories）。使用的荧光二级抗体为6μl/ml的抗小鼠FITC、抗大鼠Texas Red和抗兔CY-5（宾夕法尼亚州西格罗夫Jackson ImmunoResearch）。
表型分析。最后一次注射BrdU后存活4周的动物切片按上述方法进行三重标记，并通过共焦显微镜进行分析（蔡司，Bio-Rad，里士满，加利福尼亚州）。共分析了每只动物50个BrdU阳性细胞，以确定神经元表型中BrdU和NeuN的共表达，以及胶质表型中S100β的共表达。为了对齿状回口轮回延展进行这一数量的分析，需要在Ctr-6和Enr-6中进行12组40μm切片中的1组，以及在Ctr-18和Enr-18中进行6组切片中的一组。显微镜分析得出BrdU-阳性细胞与（1）NeuN、（2）S100β或（3）NeuN-和S100β均不存在的比率。将这些比率与存活的BrdU标记细胞的总数相乘，以估计在最后一次BrdU注射后的4周内既没有获得表型的BrdU阳性神经元、BrdU阳性星形胶质细胞和BrdU阳性细胞的总数。
刻板印象。利用无偏体视学（光学离散器；Gundersen等人，1988年). 最近的一篇评论似乎表明，与传统的所谓直观计数技术相比，当这些技术与适当的校正程序相结合时，光学除法器方法几乎没有什么好处(吉列里和赫鲁普，1997年). 尽管离散法不是无假设的，因此在非常严格的意义上也不是绝对的或客观的，但它有以下优点：（1）考虑了结构体积；（2） 程序可以在很大程度上计算机化；（3）结果高度可靠，在技术上尽可能绝对或客观(Gundersen等人，1988年;Coggeshall和Lekan，1996年). “绝对”或“全部”这两个词在这里是用在实际意义上的，而不是理论或哲学意义上的。
使用半自动立体系统（StereoInvestigator，MicroBrightfield，Inc.）和60×SPlan apo油物镜（1.4数值孔径），在矩阵间距为200μm的一侧对15μm的无偏计数框进行系统采样。颗粒细胞用Hoechst 33342染色（分子探针，尤金，OR；0.5 mg/ml Tris缓冲盐水15分钟）；那些与最高焦点（排除）平面相交的和那些与无偏采样帧排除边界相交的被排除在计数之外。根据光学分光器原理，对通过40μm轴向距离符合计数标准的细胞进行计数。颗粒细胞层参考体积是通过将每个截面的追踪颗粒细胞面积乘以取样截面之间的距离来确定的。每个分隔器体积的平均颗粒细胞数乘以参考体积，以估计总颗粒细胞数。由于很少见到BrdU阳性细胞，因此在整个颗粒细胞层范围内对这些细胞进行了详尽的采样，修改了光学分离程序，仅排除顶部焦平面，并省略了无偏差样品框架的排除和包含边界。然后将得到的BrdU阳性细胞数量与颗粒细胞层的截面体积相关联，并乘以参考体积，以估计BrdU阴性细胞的总数。
统计分析。所有统计分析均使用Statview 4.01 for Macintosh进行。对于所有形态数据的比较，先进行因子方差分析，然后进行Fisher’s事后（post-hoc）适当时进行测试。假设显著性水平为5%。为了评估存活的BrdU阳性细胞的百分比，将注射后4周的BrdU-阳性细胞数的个体值除以注射后1天的BrdA-阳性细胞的平均数。采用重复测量的方差分析法对各年龄组的水迷宫数据进行分析，然后采用Fisher’s事后（post-hoc）测试。每天两次试验的平均值被视为连续几天进行总体分析的重复测量值。
结果
神经发生，定义为新神经细胞的诞生，由一系列不同的发育步骤组成，其中三个步骤可以单独检查：增殖、存活和分化。
在最后一次注射BrdU后的第1天，通过对分裂细胞进行BrdU标记和使用抗BrdU抗体进行连续免疫组化分析，研究颗粒下区祖细胞的增殖。此时，我们没有发现生活在丰富的环境中对齿状回细胞增殖有任何显著影响（图。A类). 然而，海马前体细胞的增殖随着年龄的增长而减少，因为衰老小鼠（Ctr-18）的BrdU阳性细胞明显少于中年小鼠（Crr-6）(第页< 0.0001).
A类，在最后一次注射BrdU后1天，每个齿状回中BrdU阳性细胞的总数，以估计正在进行的增殖(阴影条)4周后评估BrdU阳性细胞的存活率(开放式酒吧).B类,C类，存活BrdU阳性细胞的百分比（与B类)分化为神经元(实心钢筋)或胶质细胞(阴影条)表型或无分化(开放式酒吧).D类，在注射BrdU的12天内产生的BrdU标记神经元的总数（根据表型比率乘以4周时BrdU阳性细胞的数量得出的值）。注意，由于BrdU阳性细胞的数量受到细胞周期参数的影响，因此不可能对增殖的神经元祖细胞群体的大小做出绝对的陈述*第页< 0.05; **第页< 0.005. 有关统计分析的详细信息，请参阅材料和方法。
通过在最后一次注射BrdU后4周对BrdU阳性细胞进行染色，并将标记细胞的数量与最后一次注入后1天获得的数量进行比较，可以解决分裂祖细胞后代的存活问题（图。A类). 我们发现，4周后存活的BrdU阳性细胞总数在老年时显著减少（Ctr-6 vs Ctr-18；第页= 0.0081). 在6个月大时，生活在丰富的环境中，存活的标记细胞数量增加了68%(第页=0.0025），在18个月大的小鼠中增加32%(第页> 0.05; 图。A类). 当存活细胞的数量表示为最后一次注射后1天的细胞数量的比率时，发现单独的年龄没有显著的存活促进作用。注射后第1天，在Ctr-6中平均42.7±1.8%的标记细胞在4周后被检测到，而在Ctr-18中发现60.7±7.3%的标记细胞(第页= 0.1540; 所有数值均为±SEM）。
最后一次注射后4周，通过共聚焦显微镜和免疫荧光三重标记BrdU、神经元标记物NeuN确定存活BrdU阳性细胞分化的表型，检查存活BrdU-阳性细胞的分化情况(Mullen等人，1992年)和胶质标记物S100β(Boyes等人，1986年)（图。). 在Enr-18中，神经元（NeuN-阳性细胞）占存活BrdU-阳性细胞的28.6±8.6%，而在Ctr-18中为12.6±7.3%(第页= 0.0002); 我们在Enr-6中发现58.0±6.8%的神经元，而在Ctr-6中发现40.8±4.7%的神经元(第页< 0.0001; 图。B、 C类).
BrdU阳性细胞免疫荧光三重标记的共聚焦显微镜分析(红色)1天(A类)和4周(B–D类)在最后一次注射BrdU后。A类、BrdU阳性细胞沿齿状回箭头状颗粒细胞层与肺门区CA4交界处的分布概况（与阴影柱在图中。A类). 此外，肝门本身和分子层中有一些增殖细胞。四组之间没有发现质量差异。注射后四周，检测BrdU标记细胞的表型(B–D类). 标记为NeuN(绿色)神经元和S100β(蓝色)用于星形胶质细胞。B类，两个BrdU标记的神经元(橙色=红色+绿色)Enr-6动物中的一个BrdU阳性细胞既不是NeuN也不是S100β阳性。C类，BrdU标记的神经元，具有Enr-18动物颗粒细胞的典型染色质模式。D类，一个BrdU标记的星形细胞(粉红色=红色+蓝色，左侧)和一个BrdU标记神经元(橙色，右侧). 比例尺（英寸A类):A类，200微米；B类,C类，12微米；D类，20微米。
在注射BrdU的12天内，Enr-18小鼠每个齿状回平均产生105±18个BrdU标记神经元，而Ctr-18小鼠仅产生32±7个（增加了三倍；第页=0.0035）（图。D类). 相比之下，Enr-6产生684±104个BrdU标记神经元，而Ctr-6平均产生285±22个（增加了两倍；第页= 0.0109). 这种影响在6个月时的绝对值更大，但在18个月时相对值更大。
在最后一次注射BrdU后4周，星形胶质细胞（S100β阳性细胞）占Ctr-6中存活BrdU阳性细胞的19.7±3.2%，Enr-6中的15.5±1.7%，Ctr-18中的32.9±2.0%和Enr-18中的26.6±1.8%。Ctr-6和Enr-6之间没有显著差异(第页=0.1864）以及Ctr-18和Enr-18(第页= 0.0553). 按绝对值计算，Ctr-6中有133±20个BrdU标记的星形胶质细胞，Enr-6中有185±38个，Ctr-18中有92±13个，Enr-6中有99±16个。同样，Ctr-6和Enr-6之间没有显著差异(第页=0.1516）和Ctr-18和Enr-18(第页=0.8389）。
未与S100β的NeuN共定位的BrdU阳性细胞在Ctr-6中占39.4±2.4%（绝对数，275±23），在Enr-6中占26.5±2.8%（299±49），在Ctr-18中占56.0±1.6%（154±20），在恩r-18中占44.8±9.3%（160±22）。统计分析表明，这两个年龄组的相对值存在显著差异(第页=0.0027，Ctr-6 vs Enr-6；第页Ctr=0.0079。18 vs Enr-18），但不是绝对数(第页=0.6099和第页分别为0.8965）。
通过无偏体视学技术评估富集诱导的神经发生对颗粒细胞总数的影响（表). 然而，在对两个大小迥异的细胞群体进行比较时，每组内颗粒细胞总数的个体间差异超过了12天注射期间出生的神经元总数（Enr-6中小于4000）。因此，我们没有发现四组之间的颗粒细胞总数有任何差异；颗粒层中的平均神经元密度或颗粒层的体积均无差异。
表1。
| 中心-6 | Enr-6公司 | 中心-18 | Enr-18公司 |
|---|
| 颗粒细胞层体积（mm三) | 0.356 ± 0.009 | 0.373 ± 0.008 | 0.336 ± 0.010 | 0.365 ± 0.013 |
| 神经元密度 | 9.91 ± 0.37 | 9.47 ± 0.23 | 9.55 ± 0.40 | 9.21 ± 0.16 |
| 颗粒细胞的绝对数量 | 3.90 × 105± 0.13 × 105 | 3.91 × 105± 0.08 × 105 | 3.57 × 105± 0.18 × 105 | 3.74 × 105 ± 0.16 × 105 |
据报道，老老鼠在水迷宫任务中学习(Gower和Lamberty，1993年). 我们研究中对水迷宫测试的总体分析显示，当比较Enr-18和Ctr-18时，到达平台的时间明显缩短(第页= 0.0422; 图。A类)Enr-6与Ctr-6(第页= 0.0248). 尽管我们发现Enr-18和Ctr-18的游泳速度都有显著提高(第页= 0.0307; 图。B类)Enr-6与Ctr-6(第页=0.0040），营养丰富的动物与对照组的游泳路径长度没有差异。
18月龄小鼠水迷宫测试数据。6个月大的动物的性能曲线看起来类似。对到达平台的时间进行的总体分析显示，对照组和富集活小鼠之间存在显著差异。游泳路径的曲线平行A类在外观上，但在总体分析中，各组之间没有发现显著差异。尽管经验导致功能改善，但与神经发生的因果关系仍有待确定。
讨论
神经发生意味着新神经元的诞生，但通常用于限制细胞增殖产生新神经元的意义，尽管使用了更广泛的定义(Shepherd，1994年;Caveness等人，1995年). 成年海马结构含有多能干细胞，可分化为神经元和胶质细胞在体外(Palmer等人，1997年). 将神经发生的定义建立在一个也可能导致神经胶质瘤的过程上是不明确的。与胚胎发育期间神经源性事件的精确时空分布相反(Caveness等人，1995年)，成年神经发生区域包含所有发育阶段的细胞。因此，用增殖来定义成人大脑中的神经发生不如发育期间精确。将注射BrdU后第1天和第4周的数据进行比较，结果显示增殖量并不代表新神经元产生的净量(Kempermann等人，1997年a). 因此，我们使用更广泛的神经发生定义，包括增殖、存活和分化。
衰老齿状回的神经发生
老年小鼠的海马结构中存在神经发生。在所有四组中，增殖细胞（图。A类)位于颗粒下区，分化细胞向颗粒细胞层迁移。注射BrdU后4周，BrdU标记的细胞表达神经元标记物NeuN（图。B–D类).
随着年龄的增长，神经发生的减少证实了以前大鼠的结果(Kuhn等人，1996年). 我们发现两个年龄组之间的颗粒细胞总数没有显著差异，这表明在老年期，神经发生不再以可检测的速度产生影响颗粒细胞总数的颗粒细胞。与我们之前研究的数据相比，在2到6个月期间，颗粒细胞总数增加了约40000个细胞(Kempermann等人，1997年a). 已描述大鼠的类似增长(拜耳等人，1982年).
虽然注射后4周内BrdU阳性细胞的减少可能归因于程序性细胞死亡的消除，但对凋亡在成人神经发生调控中的作用知之甚少。颗粒下区有凋亡细胞核(Bengzon等人，1997年). 定量地说，BrdU阳性细胞的丢失可能反映了对凋亡的高估，因为BrdU本身可能会损坏一些标记细胞。
BrdU掺入法测定出生日期的细胞受细胞周期参数的影响(蔡等人，1997年). 因为BrdU的生物利用度约为2小时(高桥等人，1992年)，只有在短时间内处于S期的细胞才含有BrdU。S期延长会增加细胞在每次注射过程中被标记的可能性；然而，在注射期间，可能发生较少的细胞周期。当BrdU从血液中清除后，BrdU阳性细胞再次分裂，将BrdU传递给其子细胞。在12天内注射12次BrdU的理由是为了将BrdU停用后分裂的影响降至最低，标记更多的细胞，并补偿持续分裂造成的稀释效应。
经验诱导的神经发生调节
环境富集范式(Rosenzweig等人，1962年)已应用于研究环境对成人大脑细胞增殖的影响(阿尔特曼和达斯，1964年). 我们最近发现，用丰富的环境刺激小鼠会增加齿状回的神经发生(Kempermann等人，1997年b).
我们目前的结果表明，成年神经发生的经验依赖性调节发生在衰老的齿状回中。与年轻小鼠一样，BrdU标记细胞的存活率也得到了提高。潜在机制可能在于与凋亡级联反应的相互作用。
此外，我们发现，在两个年龄组的丰富活动物中，相对较多的BrdU阳性细胞被双重标记为神经元标记物NeuN，这种作用在3个月大的小鼠中不明显(Kempermann等人，1997年b). 这可以解释为对致力于神经元谱系的细胞的生存促进作用。BrdU标记的星形胶质细胞和BrdU阳性细胞的绝对数量（未双重标记NeuN或S100β）均不受环境刺激的影响，这一发现支持了这一假设。
另一个有待检验的假设是，环境刺激可能通过直接或间接影响细胞命运决定机制，对分裂的祖细胞后代的分化产生影响。
微环境条件及其经验依赖性改变有助于退出细胞周期的细胞存活并导致这些细胞分化，尚待确定。虽然老年动物的经验并没有显著刺激胶质生成，但环境对星形胶质细胞的影响仍有可能促成整体效应。
对照组和强化活小鼠之间的增殖没有差异，这不能得出关于祖细胞数量的结论。原则上，我们对增殖的研究结果与富集活小鼠中具有较短细胞周期的较小增殖群体或具有较长细胞周期的较大群体相一致。理论上，神经发生增加可能会耗尽颗粒下区的祖细胞数量，而经验依赖性的新神经元需求可以通过缩短细胞周期来弥补这一点。最终的结果是，注射BrdU后4周，在富含BrdU的活小鼠中出现了更多的BrdU标记神经元，这与这些因素无关。未来的实验必须研究细胞周期动力学本身是如何受到老化和环境刺激的影响的。
经验依赖性监管是否意味着职能作用？
在我们的研究中，空间学习对行为改善的贡献程度尚不明确。然而，即使在标准条件下生活6个月或18个月，受丰富环境刺激68天的老年小鼠在水迷宫中表现出更好的表现。这种行为效应并不证明与形态学结果有因果关系，但神经发生是在功能效应的背景下发生的。
尽管结果可能表明，新神经元是为了海马功能而招募的，但还需要进一步研究，以确定成年期出生的神经元如何以及在多大程度上与海马回路功能整合。在解剖学上，新神经元像其他颗粒细胞一样将轴突延伸到CA3(斯坦菲尔德和特里斯，1988年;Parent等人，1997年).
山鸡的研究结果支持了对成年神经发生的功能性解释，其中成年齿状回的神经发生与鸟类覆盖更大领土的季节有关，并且必须记住许多食物储存地点(巴纳和诺特博姆，1996年).
然而，在衰老的齿状回中可以生成的神经元总数很少，因此确定这些细胞是否有助于此处观察到的体验相关功能效应非常重要。生活在一个丰富的环境中可以诱导各种其他海马参数(琼斯和史密斯，1980年). 其中一些变化，例如突触特性的可塑性(Greenough等人，1978年)，突触密度(Saito等人，1994年)和树枝状树状化(Greenough和Volkmar，1973年)发生于老年人，可能会对功能产生影响。然而，事实上，衰老的大脑为齿状回中神经元的产生维持着一个复杂的调节装置，这表明这种可塑性具有功能优势。我们的数据支持将成人神经发生置于海马功能背景下的理论，并为旧大脑的可塑性潜力提供了新的线索。
脚注
这项研究得到了美国国家神经疾病和中风研究所、美国国家老龄化研究所、美国瘫痪协会和国际脊柱研究信托基金的资助。G.K.得到了德国Forschungsgemeinschaft的支持，而H.G.K.则得到了遗传病基金会的支持。我们感谢D.A.Peterson在体视学问题上的帮助，感谢T.D.Palmer、P.J.Horner、J.Winkler和M.L.Gage对这份手稿的评论。我们还感谢A.Smith、T.Slimp、K.Suter及其来自Salk研究所动物研究机构的同事对这些实验的支持。
信件应寄给加利福尼亚州拉霍亚市北托雷松树路10010号遗传学实验室索尔克生物研究所的Fred H.Gage博士，邮编92037。
参考文献
1Altman J，Das GD.富集环境对成年大鼠脑内胶质细胞增殖率影响的放射自显影检查。自然。1964;204:1161–1163.[公共医学][谷歌学者] 2Altman J，Das GD.大鼠出生后神经发生的放射自显影和组织学证据。《计算机神经学杂志》。1965;124:319–335.[公共医学][谷歌学者] 三。Barna A，Nottebohm F.年轻和成年山鸡海马神经元的招募和替换：海马学习理论的补充。美国国家科学院程序。1996;93:714–718. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 4Bartlett PF、Kilpatrick TJ、Richards LJ、Talman PS、Murphy M.生长因子对神经系统早期发育的调节。药物治疗学。1994;64:371–393.[公共医学][谷歌学者] 5Bayer SA、Yackel JW、Puri PS。幼年和成年大鼠齿状回颗粒层中的神经元显著增加。科学。1982;216:890–892.[公共医学][谷歌学者] 6Bengzon J、Kokaia Z、Elmér E、Nanobashvili A、KokaiaM、Lindvall O。单一和间歇性边缘惊厥后齿状回神经元的凋亡和增殖。美国国家科学院程序。1997;94:10432–10437. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 7Bhatnagar M、Cintra A、Chadi G、Lindberg J、Oitzl M、De Kloet ER、Möller A、Agnatis LF、Fuxe K。衰老过程中棕色挪威大鼠海马的神经化学变化。神经生物老化。1997;18:319–327.[公共医学][谷歌学者] 8Boyes BE，Kim SU，Lee V，Sung SC。S-100b和胶质纤维酸性蛋白在大鼠脑内的免疫组织化学共定位。神经科学。1986;17:857–865.[公共医学][谷歌学者] 9Cai L，Hayes NL，Nowakowski RS。发育中小鼠皮层细胞周期长度的局部均匀性。神经科学杂志。1997;17:2079–2087. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 10Cameron HA，Woolley CS，McEwen BS，Gould E.成年大鼠齿状回新生神经元和胶质细胞的分化。神经科学。1993;56:337–344.[公共医学][谷歌学者] 11Caviness VS，Takahashi T，Nowakowski RS。数量、时间和新皮质神经发生：一般发育和进化模型。《神经科学趋势》。1995;18:379–383.[公共医学][谷歌学者] 12Coggeshall RE，Lekan HA。确定细胞和突触数量的方法：一个需要更统一标准进行审查的案例。《计算机神经学杂志》。1996;364:6–15.[公共医学][谷歌学者] 13.Gould E.肾上腺类固醇和兴奋性输入对神经元出生和存活的影响。Ann NY科学院。1994;743:73–93.[公共医学][谷歌学者] 14Gould E，Cameron HA，Daniels DC，Woolley CS，McEwen BS。肾上腺激素抑制成年大鼠齿状回的细胞分裂。神经科学杂志。1992;12:3642–3650. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 15Gould E、McEwen BS、Tanapat P、Galea LAM、Fuchs E。成年树鼩齿状回的神经发生受心理社会应激和NMDA受体激活的调节。神经科学杂志。1997;17:2492–2498. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 16Gower AJ，Lamberty Y。老年小鼠作为认知能力下降的模型，特别强调对NMRI小鼠的研究。行为大脑研究。1993;57:163–173.[公共医学][谷歌学者] 17Greenough WT，Volkmar FR.在复杂环境中饲养的大鼠枕皮质树突分支的模式。实验神经。1973;40:491–504.[公共医学][谷歌学者] 18Greenough WT，West RW，DeVoogd TJ。突触后板穿孔：大鼠的年龄和经验变化。科学。1978;202:1096–1098.[公共医学][谷歌学者] 19Guillery RW，Herrup K.无桥体定量：选择切片组织中物体计数的方法。《计算机神经学杂志》。1997;386:2–7.[公共医学][谷歌学者] 20Gundersen HJ、Bagger P、Bendtsen TF、Evans SM、Korbo L、Marcussen N、Möller A、Nielsen K、Nyengard JR、Pakkenberg B、Sörensen FB、Versterby A、West MJ。新的体视学工具：分离因子、分馏因子、成核因子和点采样截距及其在病理研究和诊断中的应用。病理微生物免疫扫描学报。1988;96:857–881.[公共医学][谷歌学者] 21Jones DG，Smith BJ。海马体及其对不同环境的反应。神经生物学进展。1980;15:19–69.[公共医学][谷歌学者] 22Kaplan MS，Bell DH。9日龄和11个月龄啮齿动物海马中的有丝分裂神经母细胞。神经科学杂志。1984;4:1429–1441. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 23Kempermann G、Kuhn HG、Gage FH。遗传对成年小鼠齿状回神经发生的影响。美国国家科学院程序。1997年a；94:10409–10414. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 24Kempermann G、Kuhn HG、Gage FH。生活在丰富环境中的成年小鼠海马神经元更多。自然。1997年b；386:493–495.[公共医学][谷歌学者] 25Kuhn HG、Dickinson-Anson H、Gage FH。成年大鼠齿状回的神经发生：与年龄相关的神经祖细胞增殖减少。神经科学杂志。1996;16:2027–2033. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 26Kuhn HG、Winkler J、Kempermann G、Thal LJ、Gage FH。表皮生长因子和成纤维细胞生长因子-2对成年大鼠脑内神经祖细胞有不同的影响。神经科学杂志。1997;17:5820–5829. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 27Kunster I、Leuenberger HGW。C57BL/6小鼠的老年数据。存活曲线的性别差异。《老人杂志》。1975;30:157–162.[公共医学][谷歌学者] 28Meaney MJ、Aitken DH、van Berkel C、Bhatnagar S、Sapolsky RM。新生儿处理对与海马相关的年龄相关损伤的影响。科学。1988;239:766–768.[公共医学][谷歌学者] 29Mullen RJ、Buck CR、Smith AM.NeuN，脊椎动物中的神经元特异性核蛋白。发展。1992;116:201–211.[公共医学][谷歌学者] 30Palmer TD、Ray J、Gage FH。FGF-2反应性神经元祖细胞位于成年啮齿动物大脑的增殖区和静止区。分子细胞神经科学。1995;6:474–486.[公共医学][谷歌学者] 31Palmer TD、Takahashi J、Gage FH。成年大鼠海马含有前体神经干细胞。分子细胞神经科学。1997;8:389–404.[公共医学][谷歌学者] 32父母JM、Yu TW、Leibowitz RT、Geschwind DH、Sloviter RS、Lowenstein DH。癫痫发作增加了齿状颗粒细胞的神经发生，并有助于成年大鼠海马异常的网络重组。神经科学杂志。1997;17:3727–3738. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 33.Ray J，Raymon香港，Gage FH。胚胎和成人中枢神经系统前体细胞和成神经细胞的产生和培养。方法酶制剂。1995;254:20–37.[公共医学][谷歌学者] 34Reynolds BA，Weiss S.从成年哺乳动物中枢神经系统的分离细胞中生成神经元和星形胶质细胞。科学。1992;255:1707–1710.[公共医学][谷歌学者] 35Rosenzweig MR，Bennett EL。可塑性心理生物学：训练和经验对大脑和行为的影响。行为大脑研究。1996;78:57–65.[公共医学][谷歌学者] 36Rosenzweig MR、Krech D、Bennett EL、Diamond MC。环境复杂性和训练对大脑化学和解剖学的影响。《复合生理心理学杂志》。1962;55:429–437.[公共医学][谷歌学者] 37.Saito S、Kobayashi S、Ohashi Y、Igarashi M、Komiya Y、Ando S。突触素含量显示，老年大脑中的突触密度降低，并通过在丰富的环境中饲养来预防。神经科学研究杂志。1994;39:57–62.[公共医学][谷歌学者] 38Shepherd总经理。神经生物学。牛津大学UP；纽约：1994年。[谷歌学者] 39.银色LM。小鼠遗传学。牛津大学UP；纽约：1995年。[谷歌学者] 40Stanfield BB，Trice JE。成年大鼠齿状回中生成的颗粒细胞延伸轴突投射的证据。实验脑研究。1988;72:399–406.[公共医学][谷歌学者] 41Takahashi T，Nowakowski RS，Caviness VS.BUdR作为小鼠脑室区细胞动力学行为定量研究的S期标记物。神经细胞学杂志。1992;21:185–197.[公共医学][谷歌学者] 42Vescovi AL、Reynolds BA、Fraser DD、Weiss S.bFGF调节单能（神经元）和双能（神经元/星形胶质细胞）EGF生成的CNS祖细胞的增殖命运。神经元。1993;11:951–966.[公共医学][谷歌学者] 43West MJ、Coleman PD、Flood DG、Troncoso JC。正常衰老和阿尔茨海默病中海马神经元缺失模式的差异。柳叶刀。1994;344:769–772.[公共医学][谷歌学者] 
