α-突触核蛋白与14-3-3蛋白质具有物理和功能同源性

摘要

α-突触核蛋白是由α-、β-和γ-突触核蛋白组成的蛋白质家族的一部分(Jakes等人，1994年；克莱顿和乔治，1998年). α-突触核蛋白的生化性质类似于蛋白质伴侣，能够结合其他蛋白质。它是一种140个氨基酸的小蛋白质，有11个重复序列，重复7次(George等人，1995年). 在溶液中，α-突触核蛋白以随机开放的构象而非球状构象存在，这与伴侣的作用相一致(Weinreb等人，1996年).体外，11-mer重复序列已被证明能促进与合成酸性磷脂囊泡的结合(Davidson等人，1998年). α-突触核蛋白在多种常染色体细胞以及神经元中表达(Ueda等人，1993年). 在神经元中，突触前终末富含α-突触核蛋白，其分布在可溶性蛋白池和囊泡结合蛋白池之间。已知与α（和β）-突触核蛋白相互作用的唯一蛋白质是磷脂酶D2，该酶被抑制在体外通过α（和β）-突触核蛋白与aK（K）_我共10个米(Jenco等人，1998年).

最近的研究表明，α-突触核蛋白参与了许多神经退行性疾病的病理生理学。在帕金森氏病（PD）中，α-突触核蛋白在路易体中积聚。帕金森病和肌萎缩侧索硬化症的营养不良神经突起显示α-突触核蛋白的积聚，多系统萎缩中的胶质细胞也是如此(Spialantini等人，1998年；武田等人，1998年；Tu等人，1998年). α-突触核蛋白也在阿尔茨海默病的神经炎斑块中积累。许多研究表明，α-突触核蛋白对某些细胞具有毒性。α-突触核蛋白与神经元细胞SK-SY5Y孵育诱导凋亡(El-Agnaf等人，1998年a). 分子遗传学研究已确定α-突触核蛋白基因A53T和A30P中的两个不同点突变可能导致家族性PD(Polymeropoulos等人，1997年；Kruger等人，1998年). α-突触核蛋白与疾病之间的联系表明，α-突触核蛋白生物学的扰动可能对细胞有害。然而，目前对α-突触核蛋白生物学的了解还不足以理解α-突触核蛋白如何影响细胞活力。

14-3-3蛋白构成一个蛋白质伴侣家族，在大脑中特别丰富，如α-突触核蛋白。14-3-3蛋白家族由五种不同的亚型组成，在不同亚型之间以及不同物种的相似亚型之间具有广泛的序列同源性(Layfield等人，1996年；Broadie等人，1997年). 14-3-3蛋白在含有磷酸-氨基酸残基的位点与配体结合。14-3-3与磷酸化Raf-1的结合使其稳定在活性构象中(Tzivion等人，1998年). 14-3-3与蛋白激酶Cε（PKCε）的磷酸化表位结合，并以无法转移到膜的非活性构象稳定PKC(Meller等人，1996年；惠勒-琼斯等人，1996年；Matto-Yelin等人，1997年). 14-3-3还与磷酸化BAD结合，这似乎可以稳定BAD在细胞质定位中的维持(查等，1996).

我们现在报道，α-突触核蛋白与14-3-3蛋白共享同源区域，与14-3-3-蛋白结合，与143-3配体结合，并且在过度表达时具有毒性。

材料和方法

材料。α-突触核蛋白被克隆到巴姆HI（高）/不是pcDNA3的I站点。通过PCR将FLAG序列插入α-突触核蛋白ATG起始密码子后的α-突触素cDNA的5′端，并通过DNA测序证实。使用的抗体包括：多克隆抗α-突触核蛋白（SC1；1:2000；抗人α-突触核蛋白；残基116-131；序列MPVDPDNEAYEMPSEE）、单克隆抗α-synuclein-1（1:1000；肯塔基州列克星敦的转导实验室）、单抗FLAG（1:300；IBI/Kodak，纽黑文，CT）、多克隆抗BAD抗体（1:1000，转导实验室，单克隆抗PKC-III和多克隆pan-PKC（1:1000；Upstate Biotechnology，Lake Placid，NY）、多克隆14-3-3β和单克隆14-3-3-ε（1:100；转导实验室）。

细胞培养。细胞在高糖DMEM加10%FBS中生长，根据需要补充500μg/ml G418。G418用于选择。在Optimem中，转染使用了含有2μg/ml DNA和6μl/ml脂质体胺的脂质体胺（马里兰州盖瑟斯堡生命技术公司）。

免疫印迹法。用SDS裂解液（2%SDS，10 m）收集细胞米Tris，pH 7.4，2 m米β-磷酸甘油和1μ米AEBSF）。使用BCA分析测定蛋白质（Pierce，Rockford，IL），在14%聚丙烯酰胺凝胶上运行30μg/lane，并转移至硝化纤维素（200 mA，6小时）。然后将硝化纤维在5%牛奶-PBS中孵育1小时，洗涤，在一级（1°）抗体中孵育过夜，洗涤，在过氧化物酶偶联的二级抗体中孵育3小时，并用化学发光试剂（DuPont，Billerica，MA）显影。

免疫沉淀。用1%Triton X-100在PBS中提取匀浆，并加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂。使用含有1%Triton X-100–0.2%SDS加蛋白酶和磷酸酶抑制剂的提取缓冲液进行α-突触核蛋白的一些免疫沉淀。裂解产物被旋转（10000×克，15分钟），并用蛋白A Sepharose（新泽西州皮斯卡塔韦市法玛西亚）预处理上清液。然后添加琼脂糖偶联M2抗FLAG抗体（25μl）或1μl抗体，并在4°C下培养过夜。对于含有多克隆SC1、pan-PKC或14-3-3抗体的沉淀，免疫复合物通过与蛋白A Sepharose在4°C孵育2小时沉淀。固相底物结合后，样品在TBS–1%Triton X-100中洗涤五次并进行免疫印迹。

PKC测定和细胞分离。对于PKC分析，细胞在无血清条件下培养过夜，刺激、清洗并刮入500μl 4°C提取缓冲液[20m米Tris，pH 7.4，2 m米EDTA，5米米EGTA，0.25米蔗糖，5米米β-巯基乙醇、0.1%Triton X-100和20μg/ml蛋白酶抑制剂混合物（西格玛，密苏里州圣路易斯）]。然后对样品进行超声波处理，并以100000×克然后使用25μg蛋白质和PKC分析缓冲液[50 m米Tris-Hcl，pH 7.4，250μg/ml BSA，1 m米EGTA，10μ米PKC底物肽（Ac-myelin碱性蛋白_4–14；Life Technologies），100μg/ml磷脂酰胆碱/磷脂酰丝氨酸（80:20），50 m米ATP和1μCiγ-³²每管的P-ATP）。在不含Triton X-100的PKC分析缓冲液中采集细胞后进行细胞分离，对细胞裂解液进行超声波处理并在100000×克在4°C下保持1小时。

台盼蓝染色。如上所述，使用pGL3荧光素酶控制质粒、荧光素酶检测试剂盒（Promega）和三个重复点进行转染。为了获得台盼蓝的活性，对分析细胞进行胰蛋白酶化、纺丝，并在含有0.4%台盼兰的HBSS中提取。然后使用血细胞仪对细胞总数和蓝色染色细胞的数量进行计数。每个条件下使用三个不同的孔（三次电镀），每个孔中计算四个不同的字段。

DNA片段化。从100 mm培养皿中采集细胞，通过苯酚-氯仿萃取分离DNA，并在2%琼脂糖凝胶上使用Syber Green进行分析以进行可视化。

结果

α-突触核蛋白与14-3-3结合

为了探讨α-突触核蛋白是否可能作为蛋白质伴侣发挥作用，我们搜索了遗传数据库中α-突触核蛋白与其他蛋白质伴侣之间的同源性。使用Multalin算法，我们观察到突触核蛋白和14-3-3蛋白家族成员之间的序列同源区域（图。​（图1）1) (Corpet，1988年；Dubois等人，1997年). 该比对程序显示不同级别的同源性。精确同源性显示为白色字母在上黑色背景（图。​（图1），1)，以及具有类似化学性质的氨基酸之间的同源性，如Ile和Val，如所示黑色字母在上灰色背景（图。​（图1）。1). 在α-突触核蛋白的氨基酸8和61以及14-3-3的氨基酸45和102之间发现了两个序列同源性分别为43%和36%的区域（图。​（图11A类). 该区域包含14-3-3的结构域，这些结构域被PKC磷酸化并参与14-3-3二聚化(Dubois等人，1997年；Yaffe等人，1997年). 相反，14-3-3的C末端与磷酸化的Raf-1结合有关，与α-突触核蛋白没有同源性(Ichimura等人，1997年).

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图1。

A类，α-突触核蛋白和14-3-3蛋白家族的比对。使用Multalin程序进行校准(http://www.toulouse.ina.fr/multalin.html). 为了观察同源性，我们在执行比对算法时排除了14-3-3蛋白的前30个氨基酸。精确匹配显示为白色字母在上黑色背景，具有类似性质的蛋白质的匹配如下所示黑色字母在上灰色背景此外，我们注意到在黑色因为这两种氨基酸都可以被丝氨酸/苏氨酸激酶磷酸化。B类，α-突触核蛋白与14-3-3的结合。大鼠脑组织被分为细胞质(C类)和膜(M（M）)成分，在免疫沉淀缓冲液中提取，并如图所示进行处理。这个左边显示14-3-3β免疫沉淀物与抗α-突触核蛋白抗体的免疫印迹正确的显示了裂解物的免疫印迹。省略车道标记为Ø是指使用蛋白A而非1°抗体进行的免疫沉淀。C类、左边显示了α-突触核蛋白免疫沉淀物与抗14-3-3ε抗体的免疫印迹，并且正确的显示了裂解物的免疫印迹。省略车道标记为Ø是指使用蛋白A而非1°抗体进行的免疫沉淀。

由于α-突触核蛋白和14-3-3之间的同源性涵盖了一个已知的介导14-3-3蛋白二聚化的区域，因此我们研究了α-突触核蛋白是否与14-3-3相关。将大鼠脑匀浆分为膜组分和细胞质组分，并免疫沉淀14-3-3ε蛋白。使用抗α-突触核蛋白抗体对所得沉淀物进行免疫印迹。如图所示​图11B类α-突触核蛋白和14-3-3β共免疫沉淀。免疫沉淀物和裂解物暴露时间的比较表明，14-3-3浓缩的α-突触核蛋白的免疫沉淀约为40倍，因为暴露0.5秒后可以在免疫沉淀物质中观察到α-突触核蛋白，但需要在裂解物中观察到20秒的暴露（图。​（图11B类). α-突触核蛋白在从细胞质样品中获得的14-3-3ε免疫沉淀物中最丰富（图。​（图11B类). 通过免疫沉淀α-突触核蛋白和用抗14-3-3ε抗体探测所得免疫印迹，也可以观察到α-突触核蛋白和14-3-3之间的联系（图。​（图11C类). 我们使用了14-3-3ε亚型的抗体，因为可以获得单克隆小鼠抗体（可以与用于免疫沉淀的多克隆兔抗突触核蛋白抗体区分开来）。这些数据表明α-突触核蛋白与14-3-3相关。

α-突触核蛋白结合并抑制PKC

为了检验这种关联的重要性，我们检测了α-突触核蛋白是否与其他与14-3-3蛋白相关的蛋白质结合。我们首先研究了与PKC的绑定。在PKC分析缓冲液中均匀化大鼠脑组织，并用1μ米佛波醇12,13-肉豆蔻酸酯醋酸酯（PMA）。然后将匀浆分离成膜和细胞质成分，用pan-PKC抗体免疫沉淀PKC，并用单克隆抗α-突触核蛋白-1抗体检测沉淀。PKC免疫沉淀物中的α-突触核蛋白的存在很明显，α-突触核蛋白的免疫沉淀将PKC浓缩约五倍于暴露时间（免疫沉淀剂暴露4秒，裂解物暴露20秒）（图。​（图2）。2). 免疫沉淀α-突触核蛋白和用PKCα、β、γ、δ或ε特异性抗体进行检测也证明了α-突触核蛋白和PKC之间的联系（图。​（图2）。2). 与PKC的关联模式和关联量具有异构体特异性。根据免疫沉淀的强度，α-突触核蛋白似乎与PKC亚型关联的等级顺序如下：α=γ>ε>β=δ。α-突触核蛋白与PKCα的络合物在所有样品中都很明显，而与PKCγ、δ或ε的络合物仅在基础或刺激条件下的膜组分中存在，与PKCβ的络合物只在刺激后的膜组份中存在（数据未显示）。

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图2。

大鼠脑组织中α-突触核蛋白与PKC亚型的关联。左侧面板显示具有同种型特异性PKC抗体的α-突触核蛋白免疫沉淀的免疫印迹。右侧面板显示膜和细胞质组分中每个PKC亚型的免疫印迹。每次免疫沉淀前，用1μ米PMA加1米米钙²⁺在30°C下持续30分钟。然后将匀浆分离成膜和细胞质组分，在免疫沉淀缓冲液中吸收，并分离蛋白质，如图所示。细胞质，C类；膜，M（M）；省略，Ø这是一种使用蛋白A而非1°抗体进行的免疫沉淀。

α-突触核蛋白与PKC结合的能力表明它可能调节PKC。为了研究这个问题，我们产生了293株过度表达野生型或A53Tα-突触核蛋白的人类胚胎肾（HEK）细胞系，以及一株转染载体的对照系（图。​（图3三A类). 首先，我们检查了α-突触核蛋白和PKC的复合物是否可以免疫沉淀。裂解物由在基础条件或已知刺激PKC的条件下生长的细胞制备。然后，我们通过用抗α-突触核蛋白抗体沉淀并用抗PKCα探针探测来免疫沉淀α-突触素PKC复合物（图。​（图3三B类)或通过用抗泛PKC抗体沉淀并用抗α-突触核蛋白探测（图。​（图3三C类). 与脑组织一样，我们观察到这些细胞系中的α-突触核蛋白也与PKC结合。膜移位后，α-突触核蛋白与PKCα的关联最为明显（图。​（图3三B类). 接下来，我们确定α-synuclein的过度表达是否影响PKC活性。对照、野生型和A53T-α-synuclein 293 HEK细胞系用1μ米PMA 30分钟，并分析裂解产物中的PKC活性在体外尽管在对照细胞系中观察到强烈的刺激，尽管在PMA处理后每个细胞系中都观察到PKC的强烈易位，但过表达野生型或A53Tα-突触核蛋白的细胞系在PMA治疗后没有表现出PKC活性的任何增加（图。​（图3三D类,E类). 在稳定转染野生型或A53Tα-突触核蛋白的293 HEK细胞的不同单克隆系中观察到类似结果（数据未显示）。这些数据表明α-突触核蛋白与PKC结合并抑制PKC。大多数PKC亚型显示出与膜结合的α-突触核蛋白密切相关（图。​（图2，2,​,3三B类). 这表明膜结合α-突触核蛋白对PKC有较强的亲和力，这与膜结合α-synuclein具有更稳定的二级结构的观察结果一致(Davidson等人，1998年). 然而，α-突触核蛋白对PKC的抑制似乎并不影响PKC的膜移位。14-3-3也与PKC结合并抑制PKC，但在细胞质中如此。

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图3。

A类，用空载体稳定转染293株HEK细胞的免疫印迹(Vec公司)，野生型(重量)或使用α-synuclein抗体SC1的A53Tα-synuglein。对照293 HEK细胞内源性表达低水平的α-突触核蛋白(箭头)而转染细胞显示19kDaα-突触核蛋白表达增加。B类，α-突触核蛋白免疫沉淀物中PKCα的免疫印迹。用空载体稳定转染的293 HEK细胞系(Vec公司)，野生型(重量)或A53Tα-突触核蛋白在基础条件下生长或用20 n米缓激肽30分钟，用琼脂糖偶联的抗FLAG树脂对裂解产物进行免疫沉淀。用抗PKCⅢ型抗体对所得样品进行免疫印迹显示，只有在缓激肽处理的样品中，α-突触核蛋白与PKCα有协同作用(顶部面板). 这个底部面板显示相应的总细胞裂解物中PKCα的免疫印迹。C类，PKCα免疫沉淀物中α-突触核蛋白的免疫印迹。车道1，用1μ米PMA 30分钟，使用抗pan-PKC抗体免疫沉淀PKCα(车道2)（该抗体识别PKCα、β和γ；Upstate Biotechnology）并用抗α-突触核蛋白SC1抗体进行免疫印迹。2号车道显示省略了抗pan-PKC抗体的免疫沉淀。3号车道(赖氨酸)显示裂解物（30μg裂解物）的平行抗突触核蛋白免疫印迹。在没有PMA刺激的情况下，未观察到反应性。D类经PMA（1μ米，30分钟）*第页< 0.001.E类，用PMA（1μ米，30分钟）。所有细胞系（载体、野生型α-突触核蛋白和A53Tα-突触核蛋白）经PMA处理后均表现出PKCα的稳健易位。C类，细胞质；M（M），膜。

α-突触核蛋白与BAD和细胞外调节激酶结合

14-3-3也与BAD有关，BAD是一种调节细胞死亡的Bcl-2同源物(Yang等人，1995年). 为了检测α-突触核蛋白是否也与BAD相关，我们从大鼠皮层免疫沉淀α-突触核蛋白（图。​（图44B类). 在α-突触核蛋白免疫沉淀后，很容易检测到BAD，而在BAD免疫沉淀后很容易检测出α-突触核蛋白。BAD在α-synuclein免疫沉淀中的浓度大约是α-syn核心蛋白免疫沉淀的九倍（免疫沉淀暴露10秒，裂解物暴露1.5分钟）（图。​（图44A类). 我们还能够在细胞系中显示BAD和α-突触核蛋白之间的关联。BAD和α-突触核蛋白的共免疫沉淀在转染α-突触核蛋白的293 HEK细胞的裂解物中明显可见（图。​（图44B类). 我们还观察到，在稳定转染野生型或A53Tα-突触核蛋白的HeLa细胞中，BAD和α-突触素共同免疫沉淀（图。​（图44C类). 在这些免疫沉淀中，我们研究了免疫沉淀BAD的磷酸化状态，发现免疫沉淀α-突触核蛋白对BAD呈阳性，而对磷酸化-BAD呈阴性₁₁₂或磷酸化-BAD₁₃₆（图。​（图44C类). 最后，我们检查了α-突触核蛋白与BAD结合的调节，发现了与PKCα相反的模式。用卡巴胆碱或缓激肽刺激293 HEK细胞可减少α-突触核蛋白-BAD复合物的形成（图。​（图44B类). 在脑匀浆中用1μ米PMA降低了BAD与α-突触核蛋白的结合（图。​（图44A类). 因此，BAD和PKC与α-突触核蛋白的结合呈负相关。14-3-3和α-突触核蛋白与BAD的结合也呈负相关，因为14-3-3已被证明与磷酸-BAD结合，而α-突触核蛋白与去磷酸-BAD相结合(查等，1996).

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图4。

A类脑裂解物中α-突触核蛋白和BAD的免疫共沉淀。大鼠皮层的匀浆被分离成膜和细胞质成分，并在免疫沉淀缓冲液中提取。然后对BAD蛋白进行免疫沉淀，并用单克隆抗α-突触核蛋白对沉淀进行免疫印迹。细胞质，C类；膜，M（M）；省略，Ø这是一种使用蛋白A而非1°抗体进行的免疫沉淀。B类，293 HEK细胞中α-突触核蛋白与BAD的关联以及刺激PKC的药物的调节。用卡巴胆碱（1 m）处理293个HEK细胞（表达内源性α-突触核蛋白）米30分钟）或缓激肽（20 n米，30分钟）。然后用抗突触核蛋白SC1抗体从总细胞裂解物中免疫沉淀α-突触核素，并用抗BAD抗体探测所得免疫印迹。Ø代表在没有1°抗-α-突触核蛋白抗体的情况下进行的免疫沉淀。裂解产物的免疫印迹显示，每条通道中装载了等量的蛋白质（数据未显示）。C类、BAD的免疫印迹(箭头,顶部)或磷酸化-BAD₁₃₆(底部,箭头指向缺失带；1:200; 新英格兰生物实验室，马萨诸塞州贝弗利）从HeLa细胞裂解物中免疫沉淀FLAG标记的α-突触核蛋白。用琼脂糖偶联的抗FLAG树脂免疫沉淀α-突触核蛋白，并用抗BAD抗体检测免疫印迹(顶部)或抗磷酸-BAD₁₃₆抗体(底部). 磷酸化-BAD无特异性染色₁₃₆观察到。磷酸化-BAD中的带₁₃₆未转染FLAG标记的α-synuclein的对照细胞系中存在免疫印迹，因此这些条带代表非特异性结合。裂解产物的免疫印迹显示FLAG标记的野生型和A53Tα-突触核蛋白的表达相等（数据未显示）。

我们还检测了α-突触核蛋白与Raf-1和细胞外调节激酶（ERK）的结合，它们是ERK级联中的关键激酶。14-3-3已被证明与磷酸化的Raf-1蛋白结合。首先，我们从大鼠脑裂解物中免疫沉淀α-突触核蛋白，并用Raf-1抗体进行印迹。α-突触核蛋白未与Raf-1蛋白结合（免疫沉淀和裂解物暴露5秒）（图。​（图5）。5). 我们通过检测α-synuclein是否可能与ERK级联的另一个成员结合来进一步研究这个问题。接下来，我们用抗ERK 1 2抗体印迹α-突触核蛋白免疫沉淀物，并观察到较强的抗ERK反应性（图。​（图5）。5). 根据暴露时间，α-突触核蛋白浓缩ERK的免疫沉淀为20倍（0.5秒用于暴露免疫沉淀，10秒用于暴露裂解物）（图。​（图5）。5). 这表明α-突触核蛋白与ERK相关，也可能在调节ERK级联中发挥作用。由于14-3-3对Raf-1和磷酸化-BAD都是已知的，α-突触核蛋白不能结合Raf-1或磷酸化-BAD，这表明α-突触核蛋白与其蛋白质伙伴（PKC、BAD和ERK）的结合可以独立于α-突变体与14-3-3的结合而发生。

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图5。

α-突触核蛋白与ERK级联成员的关联。左侧面板显示α-突触核蛋白免疫沉淀物与Raf-1或ERK抗体的免疫印迹。与Raf-1无关联，而与ERK有强结合。右侧面板在膜和细胞质部分显示带有Raf-1和ERK抗体的免疫印迹。在每次免疫沉淀之前，用1μ米PMA加1米米钙²⁺然后将匀浆分馏成膜和细胞质组分，并在免疫沉淀缓冲液中提取，如图所示分离蛋白质。细胞质，C类；膜，M（M），并省略，Ø这是一种使用蛋白A而非1°抗体进行的免疫沉淀。

α-synuclein的过度表达是有毒的

α-突触核蛋白突变与家族性PD的相关性以及多种神经退行性疾病中α-突触核蛋白病理学的存在表明，α-突突核蛋白可能对细胞有害。我们观察到，α-突触核蛋白与已知影响细胞活力的蛋白质（如BAD）结合，这表明了可能是α-突触核蛋白毒性的生化机制。确定α-突触核蛋白是否确实有毒对神经病理学至关重要。细胞中α-突触核蛋白的表达尚未显示对细胞有毒。迄今为止针对这个问题进行的唯一一项研究表明，细胞外注射α-突触核蛋白聚集体是有毒的(El-Agnaf等人，1998年a). 本研究中使用的条件与生理条件不同，因为α-突触核蛋白是一种细胞内蛋白而不是细胞外蛋白。由于α-突触核蛋白与三种已知影响细胞活性的蛋白质BAD、PKC和ERK相互作用，我们试图直接探讨细胞内α-突触核蛋白的增加是否有毒。

我们首先研究了α-突触核蛋白水平的调节是否对细胞应激反应。为了研究α-突触核蛋白的调节，我们测量了293个HEK细胞在基础条件下和血清剥夺24或48小时后内源性表达的α-突触核蛋白的量。我们观察到血清剥夺24小时后α-突突核蛋白的表达增加（图。​（图66A类). α-突触核蛋白水平在48小时时也保持升高。因此，细胞应激可以增加α-突触核蛋白的表达。

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图6。

α-突触核蛋白的毒性。A类在无血清培养基中培养293 HEK细胞期间，α-突触核蛋白表达增加。这个左边显示α-突触核蛋白与SC1抗体的免疫印迹，并且正确的显示用抗肌动蛋白抗体（Sigma）重复的相同免疫印迹。B类，用反义α-突触核蛋白构建物转染293 HEK细胞(AS公司；2μg）降低细胞内内源性α-突触核蛋白的表达量(左边). 控件车道(Ctrl键)显示了在相同条件下同时转染空pcDNA3质粒的细胞的裂解物。然后用抗肌动蛋白抗体重新进行免疫印迹，显示每个蛋白中装载了等量的蛋白质车道(正确的).C类，瞬时转染293 HEK(左边)或SK-N-SH电池(中间的)通过pGL3荧光素酶质粒和载体，野生型、A53T或A30Pα-突触核蛋白构建物诱导荧光素素酶活性的剂量依赖性降低。相反，反义α-突触核蛋白转染增加了荧光素酶的表达(正确的). 对于反义实验正确的，转染细胞，然后剥夺血清24小时，然后测量荧光素酶活性。反义α-突触核蛋白转染细胞的毒性低于载体转染细胞*第页< 0.05; **第页<0.01；n个=每个点4。D类类似实验显示，剥夺血清0、24或48小时后，台盼蓝染色显示毒性呈剂量依赖性增加。β-半乳糖苷酶载体的平行实验显示293个HEK细胞的转染率为40%。基于转染后20%的细胞对台盼蓝呈阳性，我们估计转染1μg A53Tα-突触核蛋白可诱导293 HEK细胞约50%的细胞死亡+第页< 0.05; *第页< 0.01; **第页< 0.001.E类，α-突触核蛋白对DNA断裂的影响。对照细胞系在基础生长条件下未观察到碎片(Vec公司,车道1)，野生型α-突触核蛋白过表达(重量,车道2)，或A53Tα-突触核蛋白表达者(A53T型,车道3). 在无血清培养基中培养24小时后，对照细胞系中的寡聚DNA片段强烈(车道4)，在野生型α-突触核蛋白细胞系中为中度(车道5)，在A53Tα-突触核蛋白细胞系中缺失(车道6). 高度降解的DNA在车道6这表明坏死DNA增加。如果野生型α-synuclein增加了BAD毒性，但突变型α-sunuclein（A53T和A30P）不增加BAD毒性。293 HEK细胞与组成活性为1μg的pGL3荧光素酶质粒共转染，其中含有或不含100 ng BAD，以及含有或不含有500 ngα-突触核蛋白（野生型、A53T或A30P）。以β-半乳糖苷酶载体作为压舱物，使DNA量保持在2μg；该载体不影响荧光素酶活性*第页< 0.0001;n个= 4; 比较带有或不带有BAD的样本。A53T和A30P单独转染与第页< 0.0001;n个= 4.

为了检测α-突触核蛋白表达增加是否对细胞有害，我们分析了α-突触核蛋白或对照构建物瞬时转染后组成活性荧光素酶报告载体的表达。细胞凋亡或坏死会减少荧光素酶的表达量，因为细胞死亡期间蛋白质合成减少。293 HEK细胞或SK-N-SH细胞（一种人类神经母细胞瘤细胞系）瞬时转染含有载体、野生型、A53T或A30Pα-突触核蛋白的构建物，以及组成性表达荧光素酶的pGL3质粒。野生型、A53T和A30Pα-突触核蛋白的转染诱导293 HEK细胞和SK-N-SH细胞毒性的剂量依赖性增加（图。​（图66C类). 在每一个测试剂量下，A53Tα-突触核蛋白结构在两种细胞系中的毒性都高于野生型结构。与野生型相比，A30Pα-突触核蛋白的毒性更大，DNA含量高达500 ng，之后毒性达到稳定。

在单独的实验中，我们观察到反义α-突触核蛋白转染具有细胞保护作用（图。​（图66B类,C类). 用组成活性pGL3荧光素酶载体和反义α-突触核蛋白或空pcDNA3转染293 HEK细胞。带有抗α-突触核蛋白抗体的细胞的免疫印迹显示，反义结构降低了内源性α-突触核蛋白的表达（图。​（图66B类). α-突触核蛋白的反应性并没有完全消除，因为在瞬时转染中，一些细胞没有接受反义构建体。然后剥夺细胞血清24小时，并测量荧光素酶活性。血清剥夺导致转染pGL3和pcDNA3的对照细胞中荧光素酶活性降低25%（图。​（图66C类,右侧面板). 相反，转染pGL3和反义α-突触核蛋白的细胞在血清剥夺后，荧光素酶活性增加了26%（图。​（图66C类,右侧面板). 反义α-突触核蛋白结构对毒性的保护能力表明，α-突触核蛋白参与细胞死亡过程，减少α-突突核蛋白干扰细胞死亡过程。

我们用台盼蓝染色证实了α-突触核蛋白与毒性之间的联系。用空载体、野生型或A53Tα-突触核蛋白瞬时转染293 HEK细胞，随后将其进行0、24或48小时的血清饥饿处理。用台盼蓝染色法测定的死细胞百分比，在转染A53Tβ-突触核蛋白的细胞中，比野生型α-突触核蛋白或载体的细胞中大得多（图。​（图66D类). 由于台盼蓝法更能检测坏死而非凋亡，A53Tα-突触核蛋白诱导的细胞死亡增加表明A53Tα-突触核蛋白诱导的坏死多于凋亡。

为了进一步分析细胞死亡机制，我们检测了稳定转染载体、野生型或A53Tα-突触核蛋白的293株HEK细胞系的DNA片段。取293株HEK细胞血清12、18、24、36或48小时诱导凋亡，琼脂糖凝胶电泳分析DNA。24小时时观察到最大数量的DNA片段。然后使用表达载体、野生型或A53Tα-突触核蛋白的293 HEK细胞重复相同的实验。剥夺血清24小时后，片段DNA在剥夺血清的对照细胞系中呈阶梯状运行，这是细胞凋亡的特征，但在表达野生型α-突触核蛋白的细胞系中表现得不太明显，更为模糊（图。​（图66E类). 在A53Tα-突触核蛋白细胞系中，DNA高度降解，主要表现为染色前沿的涂片（图。​（图66E类). 这表明野生型α-突触核蛋白的过度表达允许一些细胞凋亡，但A53Tα-突触核蛋白的表达会加剧坏死。

最后，作为检测与BAD相互作用是否有助于过度表达野生型或突变型α-突触核蛋白诱导的细胞死亡机制的第一步，我们研究了α-突触核蛋白的过度表达是否影响BAD的毒性。293 HEK细胞与1μg组成性活性pGL3荧光素酶载体共转染，其中500 ng载体、野生型、A53T或A30Pα-突触素和100 ng BAD。荧光素酶活性的量量化了细胞活力。通过使用β-半乳糖苷酶压舱质粒，用于转染的质粒DNA总量保持不变，我们已经证明这不会影响荧光素酶的活性。野生型α-突触核蛋白的转染增加了BAD的毒性（图。​（图66如果). BAD单独转染产生56%(第页< 0.0001;n个=4）毒性，而BAD与野生型α-突触核蛋白共转染产生65%(第页< 0.0001;n个=4）毒性。相反，与BAD共同转染突变的α-突触核蛋白（A53T或A30P）与单独转染BAD相比，毒性没有增加（图。​（图66如果). 单独用BAD转染产生56%的毒性，而用BAD加A53T或A30Pα-突触核蛋白转染仅产生49%和51%的毒性(第页< 0.0001;n个=4）毒性。当与BAD共转染时，突变体α-突触核蛋白构建物无法增加毒性，这表明A53T和A30P突变体α-synucleins通过利用BAD的机制引起毒性，尽管还需要进行进一步的实验来证明这一点。

讨论

我们的数据表明，α-突触核蛋白与蛋白质伴侣14-3-3结合，并与14-3-3有一个小的同源区域。通过检测已知与14-3-3相关的蛋白质，我们能够识别出三组也与α-突触核蛋白相关的蛋白质。结合14-3-3和α-突触核蛋白的蛋白质包括五种不同的PKC、ERK和BAD亚型(Meller等人，1996年；Broadie等人，1997年). 免疫沉淀过程中α-突触核蛋白浓缩配体的能力似乎遵循14-3-3>ERK>BAD>PKC亚型的等级关联。基于这种秩序，α-突触核蛋白与14-3-3、ERK或BAD之间的关联可能比PKC更强。然而，过度表达的α-突触核蛋白抑制PKC活性的能力表明，这两种蛋白质之间存在显著的功能关联，并表明α-突触核蛋白在免疫沉淀过程中浓缩PKC的能力有限，这反映了技术问题而非功能问题。

α-突触核蛋白与14-3-3蛋白有一个同源区，与许多与14-3-3相同的蛋白结合，并修饰这些蛋白的活性。基于此，我们提出α-突触核蛋白的功能类似于14-3-3蛋白，可以被视为14-3-3超家族的一部分。有趣的是，α-突触核蛋白和14-3-3之间同源的相同氨基酸也存在于β-和γ-突触核蛋白中，这表明这两种蛋白质也可能是这个超家族的一部分。此外，β-和γ-突触核蛋白也可能与14-3-3、PKC、BAD和ERK结合，就像α-突触核素一样。14-3-3蛋白家族被认为是与激酶结合并稳定其活性的蛋白质伴侣(Tzivion等人，1998年). 对14-3-3作用机制的研究提出了α-突触核蛋白可能如何作用的潜在模型。在PKC的情况下，14-3-3与PKC上的磷酸化表位结合，并将蛋白质保持在一种不活跃的构象中，以防止其转移到膜上，尽管存在二酰甘油和钙(Aitken等人，1995年；Meller等人，1996年；Reurther和Pendergast，1996年；Matto-Yelin等人，1997年). 对于Raf-1来说，这种交互作用更为详细(Muslin等人，1996年；Yaffe等人，1997年). Ras-1被Ras激活后，二聚体14-3-3与Raf-1结合并稳定其构象，即使Ras解离后仍保持活性(Tzivion等人，1998年). 因此，14-3-3延长了Raf-1激活的持续时间。对于PKC和Raf-1，14-3-3的基本功能是将蛋白质稳定在特定构象中，既可以像Raf-1那样是活性的，也可以像PKC那样是非活性的。基于与14-3-3的功能和物理同源性，我们假设α-突触核蛋白具有类似的伴侣功能。以前的报道表明，α-突触核蛋白是一种伴侣蛋白，因为它在溶液中具有开放、非结构化的特征(Weinreb等人，1996年). 我们的数据现在为这个假设提供了生化支持。

因此，14-3-3可能是研究α-突触核蛋白的有用模型。然而，14-3-3和α-突触核蛋白的特异结合模式似乎有所不同。Raf-1是一种已知与14-3-3结合的蛋白质，但不与α-突触核蛋白结合(Tzivion等人，1998年). 此外，虽然14-3-3与磷酸化的BAD结合，但α-突触核蛋白与去磷酸化BAD结合(查等，1996). 如果α-突触核蛋白作为14-3-3复合物的一部分与蛋白质结合，我们预计α-突触核蛋白会与所有与14-3-3相关的蛋白质结合，但这不是我们观察到的。缺乏与Raf-1的结合和与去磷酸BAD的结合表明，α-突触核蛋白独立于14-3-3结合到蛋白质，而不是作为较大的14-3-3α-突触核复合物的一部分。Raf-1已被证明与14-3-3的C末端结合，这是蛋白质的一个区域，与α-突触核蛋白没有同源性(Tzivion等人，1998年). 因此，α-突触核蛋白不能与Raf-1结合，这与α-突触核蛋白与14-3-3的C末端结构域之间缺乏同源性一致。

基于α-突触核蛋白的蛋白结合模式，我们还能够确定α-突触核蛋白表达增加的功能后果。α-synuclein的过度表达抑制PKC活性。有趣的是，尽管抑制了PKC活性，但α-突触核蛋白并不抑制PKC膜移位。这表明α-突触核蛋白通过阻断PKC的催化位点发挥作用，但不能阻止与膜移位相关的构象变化。多项研究证明了PKC易位和PKC活化之间的分离(Lu等人，1994年；Mochly-Rosen和Kauvlar，1998年). α-突触核蛋白与PKC的相互作用提供了PKC易位和活化分离的机制。

我们研究的α-突触核蛋白表达的另一个功能后果是毒性。α-突触核蛋白抑制PKC和与BAD结合的能力提示我们，α-突触核蛋白的过度表达可能是有毒的。与这一假设一致，我们观察到，在促进细胞应激的条件下，α-突触核蛋白水平增加，α-联核蛋白的过度表达明显通过增加坏死而诱导毒性，而α-突触核蛋白的表达减少可防止毒性。由于α-突触核蛋白似乎与多种蛋白质相关，因此α-突触核蛋白的毒性机制可能是多因素的。然而，我们的初步数据表明，与A53T和A30Pα-突触核蛋白过度表达相关的额外毒性是由BAD的作用引起的。虽然突变的α-突触核蛋白构建物A53T及A30P单独转染时是有毒的，但与BAD共转染时，α-突变体形式的α-synuclein均未诱导显著毒性。突变的α-突触核蛋白不能增加与BAD共转染的细胞的毒性，这与两种蛋白质（突变的α-突触核蛋白和BAD）使用相同的毒性机制的假设一致，并且两种突变的α-突触核蛋白的额外毒性是由BAD的激活引起的，然而，等待证明抑制BAD活性可以防止与突变的α-突触核蛋白相关的额外毒性。

与突变的α-突触核蛋白不同，野生型α-突触核蛋白在对照细胞或BAD转染细胞中引起类似的毒性。这表明野生型α-突触核蛋白不激活BAD。野生型α-synuclein与BAD的结合与其明显无法影响BAD毒性形成对比。结合和活性之间的这种差异也见于14-3-3蛋白，该蛋白与BAD结合，但尚未显示影响BAD功能(查等，1996). 无法检测BAD的调节可能是因为蛋白质伴侣，如14-3-3，有时调节配体的贩运，而不是直接影响其活性。在这种情况下，尽管伴侣与其配体之间存在明显的相互作用，但活动测量无法检测到伴侣的调节(查等，1996). 由于α-突触核蛋白与14-3-3在物理和功能上的同源性，我们认为野生型α-突触核蛋白无法检测BAD的调节可能是由于其作为伴侣的功能。

α-突触核蛋白的非结构特征可能导致其在神经退行性疾病中聚集。一些研究指出，α-突触核蛋白有在溶液中聚集的倾向，A53Tα-突触核蛋白（而非A30Pα-突变体）聚集的倾向增加在体外(Conway等人，1998年；Hashimoto等人，1998年；Paik等人，1998年). A30Pα-突触核蛋白突变体可能与膜结合的趋势减弱，这也可能增加其聚集的趋势(El-Agnaf等人，1998年b；Jensen等人，1998年). 在帕金森病、阿尔茨海默病、多系统萎缩或肌萎缩性侧索硬化等神经退行性疾病中，α-突触核蛋白的聚集倾向可能是其在营养不良神经突中作为局灶性积聚的趋势的基础(Spialantini等人，1998年；武田等人，1998年).

α-突触核蛋白积累的意义尚不清楚，但我们的研究表明α-突触核蛋白可能有毒。我们的发现得到了最近一项研究的支持，该研究表明α-突触核蛋白与细胞孵育时有毒(El Agnaf等人，1998年a). α-突触核蛋白引起毒性的能力表明，α-突触素的积累可能导致突触丢失和细胞死亡，这是神经退行性疾病的基础。毒性机制尚不清楚。对于其他蛋白质聚集体，如Aβ，聚集的蛋白质通过与刺激自由基产生的蛋白质结合或通过结合金属并通过芬顿反应刺激自由基的产生来诱导自由基的生成(Behl等人，1994年；Yan等人，1996年；阿特伍德等人，1998年). 自由基的产生也被认为在PD中很重要，因为黑质的神经元含有多巴胺和铁，这两种物质都会产生自由基。此外，神经保护转录因子NF-κB在PD的黑质中被激活(Hunot等人，1997年). 在我们的研究中，我们观察到α-突触核蛋白与神经毒性蛋白BAD结合，细胞系中A53T和A30Pα-突触核蛋白诱导的细胞死亡似乎与BAD有关。BAD对中枢神经系统神经退行性变的可能作用有待研究。

脚注

参考文献