神经科学杂志。1999年6月15日；19(12): 4695–4704.
一种呋塞米敏感K+–氯−协同转运蛋白对抗细胞内氯离子−培养大鼠中脑神经元的积累与耗竭
收到日期：1999年1月20日；1999年3月11日修订；1999年3月16日接受。
摘要
GABA对突触后抑制的疗效A类哺乳动物大脑中的受体依赖于氯离子的维持−Cl超极化梯度−电流。我们利用了降低复杂性的优势−与其他神经元相比，培养神经元的调节可以被研究在体外哺乳动物大脑的准备工作。自发GABA的全细胞紧密记录A类受体介导的突触后电流提示外向的Cl−输运还原枝晶−]我如果细胞体被Cl负载−通过贴片吸管。我们测定了Cl的树突和体细胞逆转电位−聚焦应用GABA计算[Cl时产生的电流−]我[K变化期间+]o个和[Cl−]在贴片吸管中。[氯−]我和[K+]o个被一个对速尿敏感的K紧密结合+–氯−共同运输。热力学考虑排除了钠的重要贡献+–K（K）+–氯−净氯的共同运输者−运输。我们得出结论，在正常[K+]o个K系列+–氯−协同运输有助于维持[Cl−]我低水平，而在病理条件下，[K+]o个由于神经元过度活动而升高，协同转运蛋白积累氯−从而进一步增强神经元的兴奋性。
关键词：氯−体内平衡，K+–氯−共转运体，速尿，氯−耗尽，Cl−积累，唐南平衡，培养神经元
GABA是哺乳动物大脑中主要的抑制性递质。GABA的主导作用A类受体激活是由氯引起的超极化−通量进入电池（有关审查，请参阅Sivilotti和Nistri，1991年;凯拉，1994年;汤普森，1994). 然而，Cl的方向−通量取决于Cl−穿过膜的梯度。确实，GABAA类已经观察到受体介导的突触后超极化和/或去极化电位（综述见凯拉，1994年;汤普森，1994). 一些发现表明细胞内[Cl−]不同的神经元甚至不同的Cl之间−单个神经元不同区室的分布(Misgeld等人，1986年). 去极化GABAA类然而，这种反应可能是由碳酸氢盐流出与氯离子结合引起的−流入或组合Cl−和HCO三−流出，流出(Grover等人，1993年;凯拉，1994年;汤普森，1994;Staley等人，1995年;Perkins和Wong，1996年;Kaila等人，1997年). 能够预测Cl的方向−GABA期间的电流A类受体介导的抑制——了解氯离子的调节至关重要−提供跨膜梯度的体内平衡。
最近克隆的K+–氯−共转运体基因（KCC2）是神经元氯离子调节的理想候选基因−体内平衡(Payne等人，1996年). 与K的普遍存在形成对比+–氯−协同转运蛋白KCC1，K的表达+–氯−共转运蛋白KCC2仅在中枢神经系统中检测到，似乎是神经元特异性的。KCC2与KCC1的区别还在于，KCC2不参与细胞体积调节，也不被渗透变化激活。此外，KCC2对细胞外钾具有很高的亲和力+离子。KCC2的特性允许调节[Cl−]我保持Cl−超极化GABA能抑制梯度。热力学因素预测电中性K+–氯−协同转运蛋白KCC2在生理离子条件下接近平衡。取决于[Cl−]我和[K+]o个(佩恩，1997年)，运输将挤压或积聚Cl−.
特定Cl的功能作用−神经元Cl的转运系统−在使用脑片等整体制剂的研究中，很难建立监管。一个复杂的因素是HCO的存在三−阴离子。HCO公司三−GABA的通透性A类通道(鲍曼，1988年;Fatima-Shad和Barry，1993年)阻碍了对实际[Cl的结论−]我如果它们是根据GABA的反转电位计算的A类受体介导的阴离子电流。此外，HCO三−/氯离子−交换器(Raley-Susman等人，1993年)很可能会干扰(切斯勒，1990年)以及[HCO操作导致的pH值变化三−]o个强烈影响神经元兴奋性(Jarolimek等人，1989年;Chesler和Kaila，1992年).
研究氯的功能作用−我们使用神经元培养物测量氯离子的转运体−标称HCO下的反转电位三−-自由条件。我们使用贴片吸管来操作[Cl−]我和测试[Cl−]我通过改变[K+]o个.K+–氯−协同转运蛋白KCC2对速尿敏感(佩恩，1997年)，所以我们使用速尿来测试氯离子向内或向外的方向−培养神经元的转运。我们发现具有神经特异性K的转运+–氯−共同运输者KCC2可以完全解释氯离子−培养中脑神经元的调节。
材料和方法
细胞培养。怀孕的Wistar大鼠通过乙醚吸入麻醉，然后斩首处死。胚胎被取出，放置在无菌、冰镇Gey的缓冲盐溶液中，盐溶液中含有（单位：m米)：氯化钠137、氯化钾5、硫酸镁40.3，NaH2人事军官41，氯化钙21.5，氯化钠三2.7千赫2人事军官40.2，氯化镁21，葡萄糖5，pH 7.4，立即断头。将来自14天大胚胎的腹侧中脑组织切片机械分离，并将其铺在来自同一区域的神经胶质细胞的原代培养物上。细胞培养条件如前所述(Bijak等人，1991年;Jarolimek和Misgeld，1992年). 本研究中使用的细胞培养时间为4-8周。免疫细胞化学研究表明，这种培养液含有约5%的多巴胺能神经元和<5%的5-羟色胺能神经元(Rohrbacher等人，1995年)除约70%的GABA能神经元外（我们未发表的结果）。可归因于谷氨酸受体激活的EPSP在观察到的突触后活动中占很大比例(Bijak等人，1991年)表明大多数非GABA能神经元具有谷氨酸能神经递质表型。
电生理记录。在室温（22–25°C）下，使用接线灯放大器在全细胞电压灯配置下进行记录（L/M-EPC 7，List，Darmstadt，Germany）。细胞外溶液和贴片吸管溶液的成分如表所示.无CO2或O2添加，并将所有溶液的pH值调整为7.3。使用葡萄糖醛酸盐是因为阴离子通过GABA的渗透性A类通道应较小，因为其构造受限且笨重。5-N个-将（2,6-二甲基-苯基氨甲酰甲基）-三乙基溴化铵（QX314）添加到细胞内溶液中以阻断钠+和K+电流(康纳斯和普林斯，1982年;Nathan等人，1990年;科林和惠尔，1994年). 英国广播公司−之所以使用盐，是因为在最初的实验中，溴的动作电位阻滞更快，更完整−与Cl相比−盐。英国−渗透性与Cl相似−在GABAA类通道(鲍曼，1988年); 因此，用于计算的渗透离子浓度是Cl的总和−和Br−浓度。该方法的可靠性通过替换5 m米[氯−]o个增加5米米[英国−]o个获得相同的[Br−]在细胞外溶液和贴片吸管中。这种变化对GABA诱导电流的反转电位没有可测量的影响(n个= 4). 我们没有更换K+按C+因为Cs+可能会干扰假定的K+–氯−与K竞争的共同运输商+用于内部结合部位和/或改变运输车的驱动力。然而，将CsCl添加到细胞外溶液中以减少泄漏电导。在初步实验中，我们测试了细胞外Cs+影响了K+–氯−共同运输人。速尿（0.1 m米)改变了树枝状反转电位(E类GABA公司)GABA诱导电流(我GABA公司)2 m处正向米【K】+]o个在10米处为负向米【K】+]o个和低[Cl−]pip（点阵）（见结果）。都不是树枝状E类GABA公司当我们添加5m时，速尿引起的位移也没有改变米铯+(n个=5），表明Cs+不是转运蛋白的底物，也不竞争K的细胞外结合位点+因此，细胞外溶液始终含有5 m米铯+以在我们测量GABA电流的反向电位时降低泄漏电导。胚胎中脑培养中的自发突触活动包括被AMPA型谷氨酸拮抗剂6,7-二硝基喹啉-2,3-二酮（DNQX）阻断的EPSC和对GABA拮抗剂敏感的IPSCA类荷包牡丹碱或苦味素受体(Bijak等人，1991年;Jarolimek和Misgeld，1991年). 阻止励磁，DNQX（20μ米)和NMDA受体型拮抗剂数字图书馆-2-氨基-4-甲基-5-磷酸-3-戊烯酸（1μ米)存在于所有细胞外记录溶液中。
表1。
| 胞外溶液 | 移液管解决方案 |
|---|
| 2公里+ | 5公里+ | 8公里+ | 10公里+ | 4.5米米[答：−] | 15米米[答：−] |
|---|
| 氯化钠 | 156 | 153 | 150 | 148 | | 3.5 |
| CsCl公司 | 1 (5)1个 | 1 | 1 | 5 |
| KCl公司 | 2 | 5 | 8 | 10 | | 5 |
| 葡萄糖醛酸钾 | | | | | 140 | 130 |
| 氯化钙2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 0.25 | 0.25 |
| 氯化镁2 | 1 | 1 | 1 | 1 | | 0.5 |
| 镁-ATP | | | | | 2 | 2 |
| 葡萄糖 | 15 | 15 | 15 | 15 | 10 | 10 |
| HEPES公司 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| EGTA公司 | | | | | 5 | 5 |
| QX 314-Br公司− | | | | | 4 | 5 |
贴片吸管由硼硅酸盐玻璃（德国马尔斯菲尔德希尔根堡）制成，其对镀液的电阻范围为2至4 MΩ。通过10 mV阶跃超极化引起的电容电流的振幅估计接入电阻。接入电阻在5至12 MΩ之间变化，并在记录期间进行常规检查。在实验过程中，没有使用串联电阻或慢电容补偿，因为在膜电位改变后，电流测量时间大于15秒。鉴于所记录电流的小振幅（<200 pA），串联电阻误差<2.5 mV。根据巴里和林奇（1991）计算得出15米和4.5米的电压分别为15.8和17.5毫伏米[答：−]pip（点阵）分别是。当根据下列步骤进行测量时Neher（1992），数值分别为14.0和15.5 mV，与计算值吻合良好。因为有人建议使用计算值而不是测量值(巴里和林奇，1991年)，本文中报告的所有电位都已根据计算的液结电位进行了校正。
在建立全细胞构型后>5分钟开始记录，以留出足够的时间使QX314生效，并使阴离子平衡。5分钟后，树突或体细胞无进一步变化E类GABA公司观察到。GABA（1米米)通过压力喷射（1–20 kPa，20–40 msec）每15秒从开口小于1μm的吸管中施加。我GABA公司在河豚毒素（0.3μ米)以避免重叠我GABA公司和动作电位依赖的IPSC以及快速Na的激活+记录单元中的电流。所有无机盐均为分析级（默克、达姆施塔特、德国）。除DNQX和河豚毒素（RBI，德国科隆）外，其他药物均来自Sigma（德国代森霍芬）。
通过多管灌注系统施加细胞外溶液，该系统位于距离记录细胞体约250μm的位置(Bijak等人，1991年;Jarolimek和Misgeld，1992年).
数据分析。使用四极贝塞尔滤波器以1.3–3 kHz对记录进行过滤，使用pClamp（Axon Instruments，Foster City，CA）硬件和软件采集和分析，并额外存储在DAT记录器上。用我们实验室编写的程序分析了自发IPSC（sIPSC）的时间进程和振幅(Jarolimek和Misgeld，1997年;Rohrbacher等人，1997年). 反向电势我GABA公司通过电流-电压关系的线性回归确定。在保持电位下记录电流(V（V）H（H）)在的两侧E类GABA公司。在新的V（V）H（H），对连续三次应用产生的电流振幅进行平均。尽管细胞外溶液在神经元周围快速交换（～0.5秒），但在开始应用后>1分钟确定效果，以达到稳态条件。理论[Cl−]我用能斯特方程计算神经元的E类GABA公司值和[Cl−]o个表中给出的值.未针对Br的存在对计算值进行校正−在移液管和神经元中。K的驱动力+–氯−根据计算出的[Cl，根据能斯特方程估算协同转运−]我和[K+]o个来自表数据报告为平均值±SEM。
结果
氯−胞体和树突之间的梯度
当在15 m的条件下进行紧密全细胞记录时米贴片吸管中的渗透性阴离子（[A−]pip（点阵）)，2米米【K】+]o个以及药物阻断离子型谷氨酸受体，sIPCS在规定的保持电位下没有逆转(V（V）H（H）). 相反，在V（V）H（H）在反转电位附近的范围内(E类氯=−61 mV（根据能斯特方程确定），51个细胞中的46个细胞同时出现向内和向外的sIPCS（图。A类). 所有sIPCS均被荷包牡丹碱阻断(n个=5），表明它们是由GABA介导的A类受体（图。B类). 向内和向外的sIPCS似乎分离（图。A1类)或作为被外向电流限制的内向电流序列（图。A2级). 如图所示A3号另一种模式由聚集的向内sIPCS组成，伴随着向外sIPCS的连续阻塞，反之亦然。我们分析了单个细胞中明显分离的向内和向外sIPSC的时间进程V（V）H（H）向内和向外IPSC的振幅在相似的范围内（图。C、 D类). 时间进程有明显的差异。向外sIPCS的上升时间和衰减时间常数始终比向内sIPCS慢（上升时间分别为1.9±0.1毫秒和5.3±0.4毫秒；向内和向外sIPSC的衰减时间常数分别为16.2±1.3毫秒和38.6±4.8毫秒；n个=5个单元格）。根据这些观察结果，我们假设向外的sIPCS是在树突状隔室中生成的，而向内的sIPSC是在体附近生成的。如果突触前GABA能神经元与躯体软骨表面的所有部分形成突触，则该网络的突触前神经元将产生内向和向外的IPSC。突触前神经元接触躯体附近或顶部树突中的限制区域，会产生连续的阻塞或簇状向内或向外的IPSC，这些IPSC与它们的放电模式一致，无论是连续的还是突发的。进一步假设在培养物中给定的记录条件下（见讨论），体细胞和树突没有明显偏离等电位，我们必须假设[Cl−]我树突状细胞低于体细胞。
GABA能网络神经元通过GABA在单个目标神经元内生成内向和外向IPSCA类受体。A1类，自发IPSC是在V（V）H（H）−63 mV。向内和向外sIPCS孤立发生(1)，或外向sIPCS抑制了内向电流(2). 注意1和2之间的校准差异。A3号在另一个细胞中，向内的sIPCS发生在被“沉默”期打断的簇中，而向外的sIPSC则持续发生(V（V）H（H）−71毫伏）。B类、GABAA类拮抗剂荷包牡丹碱(比克（bic）)可逆地阻止所有向内和向外的sIPCS。a、 b条，顶部轨迹的扩展段（如有指示）。C、 D类、向内和向外sIPCS的时间进程不同。向内(第1页)和向外(C1类)分离过程中出现的sIPCS可以用一个指数函数拟合(实线;V（V）H（H）−63毫伏）。对于所示的sIPCS，衰减时间常数为26.2毫秒（振幅系数39.4）和6.0毫秒（振幅因数−33.1）。为了进行分析，只接受在上升或下降阶段没有变化的sIPCS。所有向内的上升时间（10–90%）直方图(D2类)和向外(指挥与控制)sIPCS显示向外sIPCS的上升时间较慢。类似地，衰减时间常数的直方图(C3类,第3天)显示向外sIPCS的衰减速度要慢得多(C3类). 对于直方图，分析了31个向外和45个向内的IPSC（在1分钟内取样）。该图中的所有记录都是在离子型谷氨酸受体拮抗剂和2μ米【K】+]o个（【A】−]pip（点阵）15米米).
检查[Cl中的室间差异−]我我们应用了GABA（1米米)病灶位于体细胞和树突状区域（图。). 为sIPCS和GABA激发电流提供可比较的起源条件(我GABA公司)，应用程序进行了调整，以便我GABA公司在sIPCS的振幅范围内。当在反转电势周围的电压范围内进行测试时(E类GABA公司±25 mV），树突和体细胞I的斜率电导GABA公司是线性的（图。). 然而，树突的斜率电导小于体细胞应用，通常必须增加局部应用的压力或应用时间才能获得可测量的树突我GABA公司如果在体细胞附近或树突附近施用GABA，差异可能是由于受体密度和/或面对施用吸管的表面大小不同所致。正如对向内和向外sIPCS、树突状细胞的观察所预期的那样我GABA公司（距体部>100μm处）在V（V）H（H）在哪个躯体我GABA公司同一细胞向内（图。). 在单个牢房里，E类GABA公司差异高达25 mV（平均12.9±2.3 mV；n个=9）体细胞和树突之间（表).
树状和体细胞GABA应用产生Cl−具有不同反转电位的电流。在同一个细胞中，局部应用GABA（1 m米)枝晶(▪) 或胞体（●）具有不同的逆转电位。中单元格的应用程序站点插入(秒，体细胞；d日，树枝状）。记录条件为2 m米【K】+]o个和15米米[答：−]pip（点阵）.信件在记录上述样本电流的电流-电压关系上标记点。符号表示三次连续应用的平均值。注意GABA在树突中诱发外向电流，在体细胞中诱发内向电流的电压范围。
表2。
的摘要E类GABA公司在各种[K下测量+]o个和[A−]pip（点阵）
| 枝晶岩 | 索玛 |
|---|
| 控制 | 速尿（0.1 m米) | 控制 | 速尿（0.1 m米) |
|---|
| [答：−]pip（点阵）（15米米) | 2米米【K】+]o个 |
| −75.7 ± 1.8 (20) | −65.0 ± 1.5 (12) | −59.8 ± 1.1 (16) | −57.5 ± 1.1 (9) |
| 10毫米[K+]o个 |
| −63.0 ± 0.9 (6) | −59.9 ± 0.6 (6) | −56.5 ± 0.3 (4) | −56.3 ± 0.3 (3) |
| [答：−]pip（点阵）（4.5米米) | 2毫米[K+]o个 |
| −97.7 ± 1.8 (9) | −90.3 ± 2.5 (6) | −83.4 ± 0.9 (13) | −79.2 ± 1.0 (9) |
| 10毫米[K+]o个 |
| −72.5 ± 2.1 (9) | −76.8 ± 1.4 (8) | −73.7 ± 0.9 (6) | −76.7 ± 1.0 (7) |
生长激素Cl的依赖性−速尿敏感输运的梯度
无机物计算[A−]我从E类GABA公司上述报告的数值表明树枝状[A−]我低于体细胞[A−]我如果是树枝状[Cl−]我被呋塞米敏感的转运降低，应该可以减少体树突[Cl−]速尿梯度。因此，我们测试了速尿对sIPCS和我GABA公司.速尿改变了sIPCS的驱动力。在V（V）H（H）接近预期E类IPSC公司向内的sIPCS振幅增加，向外的sIPSC振幅减少或相反（图。A类). 最长1分钟后达到新的表观稳定状态，速尿的作用在类似时间内完全可逆。在低至10μ米（图。B类;n个=5个细胞中的4个），并以浓度依赖的方式增加(n个= 9). 我们在所有进一步实验中使用的最大浓度为0.1 m米避免速尿的非特异性作用(卡班奇克和格雷格，1992年). 量化速尿对E类GABA公司，电流-电压关系我GABA公司在有无速尿（0.1 m）的情况下测定米). 在一系列实验中(n个=15），应用吸管的位置由sIPCS的电流方向引导。首先，范围V（V）H（H）确定了可测量的向内和向外sIPCS。此后，aV（V）H（H）在该范围的阳性侧，选择主要记录可能在树突状隔室中生成的向外sIPCS（图。A1类). 在这种情况下，选择应用移液管的位置，以便我GABA公司是向内的。在大多数情况下，腔室从体细胞到达距离体细胞贴片吸管100μm的地方，以获得平滑变细的树突（图。,插入). 距胞体约200μm处，电流方向为我GABA公司sIPCS同意（图。A2级). 速尿只略微增加了体细胞的振幅我GABA公司（图。A1类)，而树枝状我GABA公司符号颠倒（图。A2级). 如图所示B类，树枝状结构的一种新稳态我GABA公司速尿的作用是完全可逆的。数据表明E类GABA公司速尿作用于树突，但不作用于胞体。
速尿改变了sIPCS的逆转电位。A类，自发性IPSC在V（V）H（H）−61 mV的速尿(愤怒; 0.1米米)增加向内sIPCS的频率和振幅（记录在2 m米【K】+]o个，15米米[答：−]pip（点阵）)而向外sIPCS消失。速尿效应在10秒后就开始了，这种效应是可逆的。信件标记在较低记录道中以较高扫描速度显示的时间点。B类，在与A类,V（V）H（H）已设置为记录向外的sIPCS。应用浓度增加的速尿首先降低向外sIPCS的振幅，然后逆转sIPCS信号。
速尿影响树突状细胞的逆转电位我GABA公司比躯体更强烈我GABA公司.A类，GABA的压力喷射（▴）（到躯体的距离见圆括号)在靠近躯体的地方产生内向电流(A1类)而是树突中的外向电流(A2级). 在控制记录条件下（15 m米[答：−]pip（点阵）; 2米米【K】+]o个; V（V）H（H）−66 mV），在V（V）H（H）其中向外sIPCS占主导地位。在河豚毒素存在的情况下(TTX公司)为了消除sIPSCs，呋塞米逆转了树突的电流方向我GABA公司(A2级)而体细胞的振幅我GABA公司只是略有增加(A1类). 这两种效应都是完全可逆的。为了在sIPCS存在时获得清晰的信号，使用了略大于TTX所需的喷射压力。B类，呋塞米诱导位移的时间过程的图表记录E类GABA公司。在与中相同的单元格中A类，树枝状我GABA公司在使用速尿时，在TTX反向电流方向测量。这种效果在冲刷时很容易逆转。
在另一组实验中，速尿（0.1 m米)-诱发的E类GABA公司对树突（距体细胞约200μm）和体细胞进行定量我GABA公司如图所示A类，速尿移位树突和体细胞E类GABA公司正向，但没有降低斜率电导。这表明速尿改变了[A−]我但对GABA没有阻断作用A类受体。速尿（0.1 m米)移位体细胞E类GABA公司小于树枝状E类GABA公司（4.2±1.0毫伏对11.8±1.4毫伏；n个=8）（图。B类)结果，速尿降低了体脂无机物[A−]梯度。这些发现表明，在15 m米[答：−]pip（点阵）和2米米【K】+]o个体无机物−]我主要由A统治−从贴片吸管扩散到细胞体的细胞质中。树枝状无机物[A−]相对于体细胞[A−]我通过对速尿敏感的Cl的操作−对外运输。
速尿降低了我GABA公司树突和胞体之间。A类，体细胞的电流-电压关系(A1类)和树枝状(A2级)我GABA公司可以通过线性回归线（15 m米[答：−]pip（点阵）和2米米【K】+]o个). 速尿将电流-电压关系转换为更正值，而斜率电导不变。洗脱后的效果是可逆的。E类GABA公司在没有速尿的情况下，树突状细胞更为阴性我GABA公司而非躯体我GABA公司在速尿中，树突和体细胞之间的差异E类GABA公司很小，表明E类GABA公司树突比体细胞更明显。B类,条形图汇总平均值E类GABA公司（和SEM）。体细胞的数量是9个我GABA公司树枝状的六个我GABA公司.
Cl方向的依赖性−[K上的运输+]o个和[Cl−]我
我们研究中使用的速尿浓度抑制K+–氯−异源表达系统中的协同转运蛋白（KCC2）。浓度为[Cl时−]我（4–10米米)和[K+]o个（2–10米米)这可能发生在哺乳动物的大脑中，KCC2在其热力学平衡附近运行。Cl的方向−运输取决于[Cl−]我和[K+]o个(佩恩，1997年). 我们测试了这些特征是否也适用于氯离子的调节−神经元内的稳态。
我GABA公司15米处米[答：−]pip（点阵）
增加[K+]o个从2米到10米米移位枝晶E类GABA公司到正值（表). 只有在[K激发的向内电流之后，才能获得明显的新稳态+]o个达到峰值（图。A1类). 在2米和10米处测量时米【K】+]o个在相同的细胞中，树突状细胞的转移E类GABA公司安装至16.5±3.3 mV(n个= 3). 10 m内米【K】+]o个，速尿（0.1米米)移位枝晶E类GABA公司至更大的正值（3.3±0.7 mV；n个=4），但位移始终小于2m处的位移米【K】+]o个（11.8±1.4毫伏；n个=8）（图。A2–A4). 该结果对应于K的驱动力的预期减少+–氯−高[K时的协同转运+]o个.假设体无机物[A−]由[A主导−]pip（点阵），标高[K+]o个不应导致身体的巨大变化E类GABA公司如预期，增加[K+]o个从2米到10米米几乎没有变化的躯体E类GABA公司（1.0±0.5毫伏；n个=3）在相同细胞中测试时，速尿对体细胞无影响E类GABA公司在10米处米【K】+]o个（表). 因此，在10 m内米【K】+]o个和速尿，无机[A几乎没有任何生长发育梯度−].
速尿敏感K+–氯−协同转运器挤压或累积Cl−取决于[K+]o个和[Cl−]我.A类、树突的转移E类GABA公司速尿诱导的2米范围更大米【K】+]o个比10米米【K】+]o个当[A−]pip（点阵）很高（15米米).A1类，提升[K+]o个从2米到10米米转移E类GABA公司树枝状的我GABA公司（▴标记GABA的应用）到正值，导致电流方向反转(V（V）H（H）如下图表记录所示）。洗脱速尿对我GABA公司10米米【K】+]o个(A2级)但在2米范围内有很强的效果米【K】+]o个.A4（A4），电池的电流-电压关系如所示A1–A3为了清楚起见，将控制和恢复数据合并。箭头指示枝晶转变的方向E类GABA公司.B类，在另一个记录为低[A的单元格中−]pip（点阵）（4.5米米)，速尿在2 m处诱发了一个小的正位移米【K】+]o个而是树突的微小负移E类GABA公司在10米处米【K】+]o个.
我GABA公司4.5米处米[答：−]pip（点阵）
在上述实验中，使用贴片吸管向体细胞室中注入适量无机[A−]. 评估[Cl的作用−]我，我们降低了[A−]pip（点阵）（4.5米米). 4.5米米[答：−]pip（点阵），树枝状我GABA公司比15米时更消极米[答：−]pip（点阵）（表). 根据K的较小驱动力+–氯−4.5 m处的联合运输车米[答：−]pip（点阵）和2米米【K】+]o个、速尿（0.1 m米)-诱导枝晶移动E类GABA公司较小（7.0±0.9 mV；n个=6）（图。B类). 增加[K+]o个从2米到10米米强位移枝晶E类GABA公司至正值（27.8±2.8 mV；n个= 6). 10米处米【K】+]o个，速尿诱导树突的小位移E类GABA公司; 然而，它们的方向与2米内的偏移方向相反米【K】+]o个（−5.0±0.7毫伏；n个=7）（图。B类). 这些数据表明，在低[A−]pip（点阵）Cl的方向−通过升高[K，树突中的转运被逆转+]o个.在2米处米【K】+]o个，[A−]pip（点阵）和对速尿敏感的Cl−向外的转运决定的树突[Cl−]我，而在10 m处米【K】+]o个，树枝状[Cl−]我受吉布斯-唐南平衡和呋喃磺胺敏感向内的运输。
我们接下来测试了[K+]o个体细胞的变化E类GABA公司低[A−]pip（点阵）.在2米处米【K】+]o个，体细胞E类GABA公司比树突状细胞阳性E类GABA公司（表). 然而，海拔[K+]o个速尿（0.1 m）的应用米)与树突状细胞的作用类似E类GABA公司（表). 2米处米【K】+]o个，速尿移位体细胞E类GABA公司至更多正值（4.2±0.5 mV；n个= 8). 升降[K+]o个从2米到10米米移位体细胞E类GABA公司同一方向（7.0±0.1 mV；n个=4）并逆转了体细胞的移位E类GABA公司速尿（−3.4±0.6 mV；n个= 6). 10 m内米【K】+]o个因此，无机[A没有生长发育梯度−]我存在于存在或不存在速尿的情况下。
sIPCS系统
最后，我们测试了向内和向外的sIPSC是否被[Cl改变−]我，[K+]o个和速尿我GABA公司.在2米处米【K】+]o个和低[A−]pip（点阵），在不同的V（V）H（H）无法通过线性回归拟合，因为sIPCS在E类IPSC公司(n个=4）（图。A类). 增加[K+]o个从2米到5米米而从同一个单元进行的记录允许通过一阶回归拟合电流-电压关系，因为sIPSC在定义的V（V）H（H）（图。B类). 在5米处米【K】+]o个，[Cl的比率−]o个/[氯−]我近似等于[K+]我/【K】+]o个; 因此，电中性点K没有驱动力+–氯−共转运的存在导致了体细胞的崩溃[a−]梯度。此外，在反转电位附近测得的向内IPSC的时间进程在5m内变慢米【K】+]o个比200万明显向内的IPSC米【K】+]o个在同一个单元中（上升时间1.48±0.04 msec vs 1.00±0.04 ms；衰减时间常数16.5±0.1 msec对5 m内59个向内sIPCS的7.1±0.3 msec米【K】+]o个2米内有37个向内的sIPCS米【K】+]o个在V（V）H（H）分别为−77和−87毫伏）。正如K的热力学性质所预期的那样+–氯−协同转运，增加[K+]o个至8米米4.5米处米[答：−]pip（点阵）改变了氯离子的传输方向−运输。在这些条件下，速尿降低了向内sIPCS的振幅，增加了向外sIPSC的振幅(n个=3）（图。). 这些变化与速尿在15m处引起的变化相反米[答：−]pip（点阵）和低[K+]o个（图。A类).
接近K的热力学平衡+–氯−协同转运，GABA能网络神经元在靶神经元的胞体和树突处产生具有相同逆转电位的sIPSCs。A类，在一个单元格中（4.5 m米[答：−]pip（点阵）)，向内和向外sIPCS发生在V（V）H（H）−80至−90 mV。sIPCS的电流-电压关系分别由向内或向外电流的采样峰值确定(A1类).A2级，轨迹显示了两个向内和向外sIPCS的代表性示例V（V）H（H）值之间相差5 mV。地下一层，在与中相同的单元格中A类，所有sIPCS峰值的电流-电压关系可以用线性回归线很好地拟合(第页=0.96）在5 m处米【K】+]o个图中显示了平均值和SE条，除非SE条保持在符号大小范围内。每次采样的最小至最大sIPSC数V（V）H（H）范围为48至132。
在高[K的条件下+]o个和低[A−]pip（点阵），速尿移位E类IPSC公司设置为更负的值。A类，速尿降低向内sIPCS的振幅（记录为4.5m米[答：−]pip（点阵）和8米米【K】+]o个).B类，在与A类但在更积极的方面V（V）H（H），速尿增加外向sIPCS的振幅。信件在图表图上标记在较低记录道中以较高扫描速度显示的线段。
讨论
我们的数据表明，速尿敏感的转运可以积累或挤出氯−长期培养的胚胎中脑神经元。就速尿敏感性和[Cl变化而言−]我和[K+]o个，共转运体表现出神经元K的功能特征+–氯−人胚胎肾细胞系中表达的协同转运蛋白亚型（KCC2）(佩恩，1997年). 由于电中性K的特性+–氯−联合运输商，[K+]o个确定Cl的驱动力−穿过GABA的通量A类受体通道，从而调节突触抑制。
a[Cl的还原−]我通过速尿或[K测定树突和胞体之间的梯度+]o个
我们观察到GABA驱动力的显著差异A类细胞体和树突之间的电流。荷包牡丹碱敏感性sIPCS和局部GABA应用均显示了梯度。在V（V）H（H）接近氯的预期平衡电位−、GABAA类电流在胞体附近向内，在树突部分向外。速尿减少了驱动力中的躯体发炎差异，导致E类GABA公司树突状电流比体细胞电流更明显。如果[K+]o个增加或[A−]pip（点阵）减少了。
树枝状[Cl−]我在我们的实验条件下（图。A类)可以从Gibbs–Donnan平衡和电中性K的热力学分布来解释+–氯−共同运输（图。B类). K（K）+和Cl−可以预计在神经元膜上几乎达到平衡。[氯−]我等于[K+]o个近似地满足了Donnan关系以及电中性原则。[氯−]我实际增加到[Cl以上−]我根据Donnan关系预测或将浓度降低到该浓度以下−]pip（点阵）分别是。体附近，[Cl−]pip（点阵）测定[Cl−]我比树突中更紧密。取决于[K+]o个，树枝状[Cl−]我较低（图。Aa–Ac公司)或更高（图。广告)比体细胞[Cl−]我，表示Cl−跨导电路径的运动超过Cl−从贴片吸管扩散。电子中性K+–氯−根据能量分布，共转运体对电导路径有贡献（图。B类)枝晶[Cl的转变揭示了这一点−]我因施用速尿而产生。当[K+]o个低[Cl−]pip（点阵）高（图。Aa公司)，K的驱动力+–氯−共转运体足够大，可以产生明显的体脂蛋白梯度。体树突梯度是由贴片移液管中的溶液建立的，该溶液用作Cl−源和K+–氯−共同运输者，抵消了氯离子−负载。Cl的发展−梯度使我们能够研究Cl−但实验并没有确定在何种条件下完整神经元中可能存在这种梯度。
氯−培养神经元的稳态可以用电中性钾的作用来解释+–氯−共同转运和吉布斯-多南平衡。A类，[氯−]我计算依据为E类GABA公司表中列出贴片吸管中无机阴离子的浓度如图所示。箭头表示[A的变化−]我根据中的变化计算E类GABA公司体细胞或树突我GABA公司由速尿诱导。信件对应于K的驱动力+–氯−根据中所示的能量分布推导出的协同传输B类.B类，K的驱动力图+–氯−作为[K的函数的协同转运+]o个对于不同的[Cl−]我（取自E类GABA公司计算中的枝晶A类). 计算如材料和方法中所述。正值表示向外运输。
[氯−]我从体细胞计算E类GABA公司总是略高于[Cl−]pip（点阵）小偏差可能是由阴离子携带的注入电流引起的，因为我们设置V（V）H（H）膜电位为负值。支持这一建议的是，[Cl的相对增加−]我高于[Cl−]pip（点阵）与[Cl相比更大−]pip（点阵）4.5米米与[Cl相比−]pip（点阵）共15米米主要阴离子葡萄糖醛酸盐的低流动性促进了[Cl的增加−]我高于[Cl−]pip（点阵）.其他可能的因素，如内源性CO的产生2或Br的使用−是不太可能的贡献者。细胞内外的pH值相等可能会阻止HCO的积聚三−梯度，以及去除Br的梯度−对E类GABA公司（见材料和方法）。
观察到的快速和慢速sIPCS可能代表不完美空间钳的伪影。GABA也有类似的发现A类海马脑片CA1神经元的反应(皮尔斯，1993年). 在那项研究中，提出的论点表明，太空灯伪影并没有解释神经元不同位置产生的突触电流的不同时间进程。相比之下我GABA公司在TTX、QX314和Cs存在下记录到的具有高输入电阻（≥1 GΩ）和短树突（≤300μm）的培养神经元中+应该少受几何因素的阻碍(缪勒和卢克斯，1993年;Draguhn等人，1997年). 此外，当[K+]o个增加了（图。)表明向内sIPCS的时间进程被叠加的向外小sIPCS缩短，与体脂蛋白[Cl−]我存在梯度。
神经特异性K+–氯−共转运体被速尿（K我25 μ米) (佩恩，1997年). 速尿已被用于确定K+–氯−突触抑制中的共转运体(Misgeld等人，1986年;汤普森，1994). 然而，速尿有各种缺点。在非神经元制剂中，浓度>0.1 m的速尿米不仅抑制阳离子-阴离子协同转运蛋白，还抑制其他转运蛋白和氯离子−通道(卡班奇克和格雷格，1992年). 在这里，我们可以观察到浓度低于0.1米的速尿的即时效果米据报道，速尿可阻断GABAA类由包括α在内的亚单位组成的通道4和α6(Wafford等人，1996年). 这些亚单位在中脑区域并不常见(Wisden等人，1992年). 在本研究和之前的研究中(Jarolimek等人，1996年)在中脑培养中，我们是否获得了速尿降低GABA的证据A类电流。取决于V（V）H（H）神经元暴露于速尿后，IPSC振幅增加，GABA电流-电压关系斜率增加A类水流保持不变。如前一研究所示(Jarolimek等人，1996年)，与E类GABA公司可以观察到甘氨酸电流。
速尿阻断Na+–K（K）+–氯−协同转运器比它更有效地阻止K+–氯−共同运输人(卡班奇克和格雷格，1992年). 因此，此处所述的速尿效应不允许在两种转运蛋白之间进行区分。然而，我们的数据排除了Na的重要贡献+–K（K）+–氯−网络中的协同运输者−培养中脑神经元的转运。因为Na的巨大向内驱动力+，净Cl的驱动力−运输（图。交流，直流)在[K附近不会倒车+]o个和[Cl−]我根据K的驱动力预测+–氯−协同运输器（图。Bc、d).
神经元Cl的调节−速尿敏感K的稳态+–氯−共同运输人
电中性K+–氯−在正常内外离子浓度条件下，协同转运器接近平衡运行(Jensen等人，1993年;佩恩，1997年). 如果[K+]o个保持在较高水平（图。广告)、K+–氯−协同转运器积累Cl−在牢房里。生理条件下，Cl−随之而来的钾的去除会减少累积+从细胞外空间(佩恩，1997年). 然而，在癫痫样活动期间，[K+]o个被发现仍处于高位（10–12米米) (海涅曼和卢克斯，1977年)，结果是K+–氯−运输实际上累积了氯离子−从而加剧癫痫样活动。因此，在这种实验条件下，速尿可能具有一定的抗癫痫效力(Hochman等人，1995年). 相反，在神经细胞培养中，我们观察到速尿诱导的爆发活动(Jarolimek等人，1996年). 在这些实验中，[K+]o个保持恒定在5米米在离子型谷氨酸受体拮抗剂存在的情况下，我们观察到频繁的sIPSC，这表明大多数细胞的膜电位接近放电阈值，例如−60 mV左右−]我约5.6米米5米米【K】+]o个（[氯−]o个=169米米; 【K】+]我假设为150 m米). 然而，有一个电动势(E类M（M）−E类氯)驱动Cl−进入牢房。突触抑制的超极化梯度将由外向的K维持+–氯−共同运输。[Cl的上限−]我是20米米如果K+–氯−共转运蛋白被速尿阻断。因此，在速尿中，GABA的抑制效力A类突触后电位降低或消失。
脚注
这项工作得到了Deutsche Forschungsgemeinschaft（致英国）Sonderforschungsbereich 317/B13的支持。我们感谢F.Kuenzi博士和K.Wafford博士对这份手稿的评论，以及C.Heuser博士的出色技术援助。
通信地址：Ulrich Misgeld博士，I.生理研究所，海德堡大学，Im Neuenheimer Feld 326，D-69120 Heidelberg，Germany。
Jarolimek博士目前的地址：默克夏普与多姆研究实验室，英国埃塞克斯CM 20 2QR哈洛特灵公园神经科学研究中心。
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