神经科学杂志。1999年2月1日；19(3): 928–939.
介导对β-淀粉样蛋白和朊蛋白的淀粉样蛋白片段的神经毒性反应的微胶质细胞信号转导途径的鉴定
1俄亥俄州克利夫兰凯斯西储大学医学院神经科学系阿尔茨海默病研究实验室，邮编：44106-4928
收稿日期：1998年8月3日；1998年9月21日修订；1998年11月18日接受。
摘要
阿尔茨海默病和朊病毒病患者大脑中的微胶质细胞与淀粉样纤维的相互作用导致这些细胞的炎症激活。我们观察到原代小胶质细胞培养物和THP-1单核细胞系受到纤维β-淀粉样蛋白和朊蛋白肽的刺激，以激活相同的酪氨酸激酶依赖的炎症信号转导级联。酪氨酸激酶Lyn和Syk被纤维肽激活，并启动信号级联，导致细胞内钙的瞬时释放，从而激活经典PKC和最近描述的钙敏感酪氨酸激酶PYK2。MAP激酶ERK1和ERK2的激活是随后的下游信号事件。我们证明，PYK2位于Lyn、Syk和PKC的下游。PKC是ERK激活所必需的中间产物。重要的是，β淀粉样蛋白和朊蛋白纤维引发的信号反应导致产生神经毒性产物。我们已经在组织培养模型中证明，β-淀粉样蛋白和朊蛋白刺激的小胶质细胞或THP-1单核细胞的条件培养液对小鼠皮层神经元具有神经毒性。这种毒性可以通过用特异性酶抑制剂治疗THP-1细胞来改善，这些酶抑制剂针对与炎症反应相关的信号转导通路的各种成分。
关键词：阿尔茨海默病、β淀粉样蛋白、朊病毒、小胶质细胞、THP-1单核细胞、信号转导、酪氨酸激酶、炎症、神经毒性
神经退行性疾病的一个子集与纤维蛋白的异常胞外沉积有关，这些纤维蛋白统称为“淀粉样蛋白”。淀粉样蛋白是由结构无关的蛋白质以疾病特有的方式生成的(基西列夫斯基，1997年).
阿尔茨海默病（AD）是一种神经退行性疾病，其特征是脑内β淀粉样纤维进行性沉积，形成老年斑(布拉克和布拉克，1997年). 淀粉样物质由β淀粉样肽（βA）组成，βA是从淀粉样前体蛋白中水解而来的(Kang等人，1987年;Haas等人，1992年;古和斯奎佐，1994年;Turner等人，1996年). 斑块与反应性小胶质细胞、星形胶质细胞以及营养不良的神经突有关(Itagaki等人，1989年;Miyazono等人，1991年;Cotman等人，1996年).
朊病毒疾病是一种神经退行性疾病，其特征是朊病毒蛋白（PrP）的病理形式的积累供应链) (普鲁辛纳，1982年;Kretzschmar等人，1986年;Borchert等人，1992年;Stahl等人，1993年). PrP公司供应链其特点是具有传染性、对蛋白水解的部分抵抗力、在脑内细胞外聚集并作为淀粉样斑块沉积在朊病毒疾病子集中的能力(Prusiner等人，1984年;Oesch等人，1985年). 斑块的形成与反应性星形胶质细胞和小胶质细胞的出现以及空泡细胞的丢失有关(Miyazono等人，1991年;Guiroy等人，1994年;Jeffrey等人，1994年;Williams等人，1994年,1997;Muhleisen等人，1995年;Betmouni等人，1996年;Brown和Kretzschmar，1997年;Kretzschmar等人，1997年).
这两种类型的淀粉样纤维沉积与反应性胶质细胞，特别是小胶质细胞有着不变的联系。有大量证据表明，这两种疾病中都存在小胶质细胞衍生的炎症成分。与淀粉样斑块相关的小胶质细胞表现出多种细胞表面标记物的高表达，表明其处于反应状态(McGeer等人，1993年;McGeer和McGeer，1995年). 多种急性期炎症前蛋白也与淀粉样斑块相关(McGeer和Rogers，1992年;McGeer和McGeer，1995年). 此外，几个在体外研究已经证明纤维βA和PrP肽能够诱导小胶质细胞分泌细胞因子和神经毒性活性氧(Forloni等人，1993年;Brown等人，1996年;Ii等人，1996年;Klegeris和McGeer，1997年;Klegeris等人，1997年;Kretzschmar等人，1997年;洛顿，1997;McDonald等人，1997年). 因此，小胶质细胞与淀粉样斑块的持续接触可能有助于在患病大脑中引发局部炎症反应。
我们已经在小胶质细胞系细胞中发现了一种基于酪氨酸激酶的信号级联，该信号级联通过细胞暴露于βa和PrP纤维而激活，并直接负责激活细胞产生神经毒性因子。这些细胞内信号通路与这些细胞对经典炎症刺激的反应是共同的(Ghazizadeh等人，1994年,1995;Marcilla等人，1995年;克劳利等人，1997年;Vonakis等人，1997年). 我们证明，激活途径中酶的特异性抑制可以防止反应性、神经毒性表型的获得，并提供了新的干预策略。
材料和方法
材料。抗磷酸酪氨酸抗体4G10来自Upstate Biotechnology（Lake Placid，NY）。抗帕西林和抗PYK2抗体从圣克鲁斯生物技术公司（加州圣克鲁斯）获得。抗磷酸ERK和抗ERK抗体分别从Promega（威斯康星州麦迪逊）和Santa Cruz Biotechnology购买。抗MAP2抗体来自Sigma（密苏里州圣路易斯）。抗FcγR（右）二抗体（单克隆抗体IV.3）来自Medarex（新泽西州安奈代尔）。山羊抗鼠F（ab）2来自Cappel（宾夕法尼亚州西切斯特）。亲和纯化的辣根过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠和山羊抗兔抗体购自Boehringer Mannheim（印第安纳州印第安纳波利斯）。与人类β淀粉样蛋白的25–35和1–40氨基酸以及人类朊蛋白的106–126氨基酸相对应的肽购自Bachem（宾夕法尼亚州费城）。在Gliatech（俄亥俄州克利夫兰）合成了杂乱β-淀粉样蛋白25-35肽。搅乱的朊病毒肽是Gianluigi Forloni博士（意大利米兰）慷慨赠送的礼物。β-淀粉样肽在无菌dH中重新悬浮20和朊病毒肽溶解在无菌200 m米磷酸钠缓冲液，pH 7.0。通过在无菌蒸馏水中重组冻干肽，然后在37°C下培养1周，制备纤维β淀粉样蛋白1-40。乙酰化低密度脂蛋白（LDL）是Frederick DeBeer博士（肯塔基大学）赠送的一份礼物。脂多糖（LPS），硝基蓝四氮唑，12-o个-十四烷基佛波醇13-醋酸盐（TPA）、糖化BSA、丹曲烯、维拉帕米、硝苯地平和伴刀豆球蛋白A（Con A）购自Sigma。Piceatannol购自Boehringer Mannheim。Go6976从LC实验室购买。2,5-二-第三种-丁基对苯二酚（DTBHQ）、thapsigargin、BAPTA和PP1购自Calbiochem（加州拉霍亚）。
组织培养。THP-1细胞在添加10%热灭活胎牛血清（FCS）、5×10−5米2-巯基乙醇，5 m米HEPES和5%CO中2μg/ml庆大霉素2如前所述，小胶质细胞培养物来自出生后第1-2天的小鼠大脑(McDonald等人，1997年). 从胚胎第17天（E17）小鼠（C57Bl/6J）的皮层培养神经元。分离无脑膜皮质，并用0.25%胰蛋白酶和1m消化米37°C下EDTA 15分钟。用含有20%热灭活FCS的DMEM灭活胰蛋白酶。用B27补充剂将皮层转移到神经基底层培养基上，研磨并镀在聚乙烯上-我-赖氨酸（0.05 mg/ml）包被组织培养孔。神经元生长在神经基底层培养基（4.0×104神经元/孔），补充B27 5–7天在体外使用前。神经基底细胞培养基的使用提供了高度纯化的神经元培养物，以减少培养物中污染胶质细胞的混淆(Brewer等人，1993年).
细胞刺激。首先去除THP-1细胞和小胶质细胞各自的培养基，并在37°C下用HBSS替换30分钟，然后进行刺激。在悬浮液中刺激细胞（5–10×106细胞/200μl HBSS）。为了确定特异性酶抑制对THP-1细胞的βA和PrP刺激的影响，我们在没有或有药物的情况下预培养细胞45分钟。为了调节培养基，我们将THP-1细胞镀到结合肽（48pmole/mm）上2)至48孔组织培养皿，如前所述(拉格纳和莱蒙，1987年;McDonald等人，1997年). 简单地说，用硝化纤维素覆盖组织培养孔，并将肽添加到涂层孔中，然后让其干燥。然后在dH中用无菌3%BSA培养这些微孔2O静置1小时，以阻止细胞与硝化纤维素的相互作用。去除BSA，添加THP-1细胞（1.8×104细胞）到含有结合肽的孔中，在0.25 ml神经基底细胞培养基中，在有或无药物的情况下放置48小时。收集培养基，然后将其添加到神经元培养物中72小时。小胶质细胞介导的神经元毒性实验涉及小胶质细胞（1.8×104细胞）直接添加到神经元培养物（4.0×104细胞）在1μ米βA 25-35。神经元被固定并用抗MAP2（1:500）抗体染色。所有条件重复进行，总共重复四次。在井上放置一个计数网格，以计算每种情况下八个相同区域的神经元数量。计算每个条件下每个场的平均神经元数，以评估神经元存活率。
蛋白质印迹和免疫沉淀。细胞在200μl冰镇放射免疫沉淀分析（RIPA）缓冲液（1%Triton，0.1%SDS，0.5%脱氧胆酸盐，20 m）中溶解米Tris，pH 7.4，150 m米氯化钠，10米米氟化钠，1米米纳三VO（旁白）4，1米米EDTA，1米米EGTA和0.2米PMSF），在10000×克在4°C下保持10分钟。蛋白质浓度通过以下方法进行定量布拉德福德（1976）蛋白质通过7.5%SDS-PAGE进行解析，并在4°C下过夜用一级抗体[4G10（1:2000）；抗磷酸-ERK（1:20000）；抗ERK（1:2000。抗体结合是通过增强化学发光检测的（皮尔斯，罗克福德，伊利诺伊州）。为了重现斑点，我们使用0.2N NaOH在25°C下剧烈摇晃10分钟，将其剥离(Suck和Krupinska，1996年). 免疫沉淀是通过将细胞裂解液与一级抗体（1μg抗体/mg蛋白裂解液）和蛋白A琼脂糖在4°C下孵育2小时来进行的。免疫沉淀物在RIPA缓冲液中洗涤三次，然后用7.5%SDS-PAGE溶解，并按所述进行蛋白质印迹。
呼吸爆发。通过测量硝基蓝四氮唑（NBT）的还原度来测定细胞内超氧化物的生成(皮克，1986年;McDonald等人，1997年). 简单地说，THP-1细胞（2.0×106每种条件下的细胞）从培养基中取出，并允许其在37°C的HBSS中孵育30分钟，无论是否使用药物（5μ米PP1，50牛顿米thapsigargin或2μ米Go6976）或车辆（DMSO）。从HBSS中取出细胞，在含有1μg/ml NBT的HBSS中重新悬浮，并培养30分钟。然后通过离心收集细胞，并在RIPA缓冲液中进行超声处理，以收集NBT沉淀物。通过550 nm处吸光度的变化测量NBT的减少。检测重复进行。
胞浆游离钙测量。[加利福尼亚州2+]在THP-1细胞中使用荧光指示剂fura-2在恒温控制光度计中进行测量，磁力搅拌如下所述El-Moatassim和Dubyak（1992年）钙浓度根据以下方法计算Di Virgilio等人（1988年）.
结果
βA和PrP纤维激活小胶质细胞和THP-1单核细胞中类似的酪氨酸激酶信号通路
原代小鼠小胶质细胞和THP-1细胞暴露于原纤维PrP 106–126和βA 25–35激活了两种THP-1细胞中基于酪氨酸激酶的细胞内信号级联反应（图。A类)和小胶质细胞（图。B类). 全长βA 1-40和1-42肽启动细胞内信号事件，生物活性域映射到残基25-35（图。A类) (McDonald等人，1997年). 同样，我们使用了包含残基106–126的人类朊蛋白的生物活性结构域。该域对于PrP的转换至关重要c（c）至PrP供应链形成淀粉样纤维在体外(Gasset等人，1992年;Selvaggini等人，1993年; Tagliavanni等人，1993年；Chen等人，1995年). 细胞刺激特定于肽的纤维构象，因为打乱的非纤维形式的PrP 106–126和βA 25–35没有引起蛋白酪氨酸磷酸化水平的任何增加（图。A类). 这种反应不是由晚期糖基化终产物受体（RAGE）或清道夫受体介导的，因为这些受体的配体（分别为糖基化BSA和乙酰化LDL）不会改变蛋白质酪氨酸磷酸化水平（图。A类). βA和PrP肽诱导的蛋白酪氨酸磷酸化模式在性质上相似；然而，各个蛋白质的相对磷酸酪氨酸含量在实验之间有所不同（图。C). 纤维刺激蛋白酪氨酸磷酸化导致许多蛋白质磷酸化，这些蛋白质在经典免疫受体（如Fc）激活后也磷酸化γR（右）二（图。C). THP-1细胞通常通过直接向溶液中的细胞中添加纤维性PrP 106–126和βA 25–35来刺激。然而，当THP-1细胞直接被镀到与组织培养孔结合的纤维肽上时，也观察到蛋白酪氨酸磷酸化的刺激（数据未显示）(McDonald等人，1997年,1998).
βA和PrP公司纤维特异性激活小胶质细胞和THP-1单核细胞中的酪氨酸激酶信号通路。A类，用PrP公司,βA，已加扰βA(ScrβA) 25–35 (40 μ米; 2分钟），加扰PrP公司(Scr优先级) 106–126 (80 μ米; 5分钟），20μg/ml糖化BSA+20μg/ml乳铁蛋白(年龄)（2分钟；37°C），或20μg/ml乙酰化LDL(Ac低密度脂蛋白)（2分钟；37°C）。B类用纤维肽溶液刺激小鼠原代小胶质细胞，比较其蛋白磷酸酪氨酸水平PrP公司106–126或βA25–35或60μg/ml伴刀豆球蛋白A(ConA公司)作为阳性对照。C，比较用全长纤维刺激THP-1细胞时蛋白酪氨酸磷酸化的变化βA 1-40肽，βA 25-35肽或阳性对照Fc交联γR（右）二[25μg/ml抗FcγR（右）二抗体（Ab）+100μg/ml gαM Fab2（用Ab在冰上15分钟+用Fab在37°C下2分钟2)]和Con A.细胞裂解物的等分样品通过SDS-PAGE进行解析，使用抗磷酸酪氨酸抗体4G10进行蛋白质印迹，并通过化学发光进行可视化。
THP-1细胞和原代小鼠小胶质细胞持续暴露于βA 25-35（图。B类,E类）和PrP 106–126（图。C,F类48小时后，纤维导致磷酸酪氨酸免疫反应增强。这些在体外研究结果证实，持续暴露于纤维肽的细胞会引起酪氨酸激酶信号事件的长时间激活，并在功能上模拟体内显示高水平磷酸酪氨酸的AD脑中斑块相关小胶质细胞的反应(Wood和Zinsmeister，1991年).
βA和PrP原纤维刺激THP-1细胞和小胶质细胞导致磷酸酪氨酸染色增加。原代小鼠小胶质细胞(D–F型)和THP-1细胞(A–C)被镀在无涂层的盘子上(A类,D类)或涂有βA 25–35的盘子(B类,E类)或PrP 106–126(C,F类)细胞在4%多聚甲醛中固定，并用抗磷酸酪氨酸抗体4G10染色。以3,3′-二氨基联苯胺四氯化氢为显色剂观察免疫反应性。
酪氨酸激酶Lyn和Syk调节MAP激酶激活
Lyn和Syk是调节单核细胞系细胞对免疫刺激的信号反应的主要催化成分(Ghazizadeh等人，1994年,1995;Marcilla等人，1995年;克劳利等人，1997年;Vonakis等人，1997年). 为了测试Lyn和Syk是否参与βA或PrP刺激的信号激活途径中的近端元件，我们用src家族激酶的特异性抑制剂PP1处理细胞，以阻断Lyn活性(Hanke等人，1996年)或使用Syk选择性抑制剂piceatannol(Oliver等人，1994年)并评估其对下游信号元件激活的影响。用PP1和吡卡坦诺预处理THP-1细胞抑制ERK激活，以响应纤维性PrP 106–126和βA 25–35（图。B–D类). 作为对照，在阻断Lyn和Syk激活后，还监测了纤维刺激的蛋白酪氨酸磷酸化增加。Lyn活性的抑制阻止了蛋白酪氨酸磷酸化中纤维活化的增加（图。E类,F类). 抑制Syk激活只会使蛋白质酪氨酸磷酸化的变化部分减少（图。G公司)与Syk被招募到受体复合物中以激活Lyn下游的方案一致。
βA和PrP公司THP-1细胞的原纤维刺激需要激活酪氨酸激酶Lyn和Syk来激活MAP激酶。THP-1细胞在二甲基亚砜载体中孵育(c（c）)，1或5μ米PP1项目或50μg/ml皮卡坦诺（45分钟；每个37°C），然后在PrP公司106–126 (80 μ米; 5分钟）或βA25–35 (40 μ米; 2分钟）或Fc交联γR（右）二[25μg/ml抗FcγR（右）二抗体+100μg/ml gαM Fab2（冰上15分钟，Ab+37°C下2分钟，Fab2)]或Con A（60μg/ml；5分钟）作为阳性对照。细胞裂解物的等分样品通过SDS-PAGE、蛋白质印迹和化学发光进行分析。针对ERK1和ERK2活化、磷酸化形式的抗体(磷酸化细胞外信号调节激酶)用于监测ERK激活。为了使蛋白质负荷正常化，我们剥离了斑点，并用抗ERK抗体重制了它们(ERK公司). 用PrP公司,βA或Con A，如上所述。A类，在用PrP公司106–126或βA25–35.B–D类用50μg/ml苦皮藤醇预处理THP-1细胞，检测ERK磷酸化和活化(B类)或5μ米PP1项目(C,D类)在刺激之前PrP公司106–126和βA25–35.E类,F类，当THP-1细胞用1或5μ米PP1项目用刺激前βA25–35 (E类)和PrP公司106–126 (F类).G公司，当THP-1细胞在用βA25–35或PrP公司106–126.
βA和PrP原纤维刺激THP-1细胞引起从细胞内储备释放的细胞内钙水平的短暂增加
单核细胞免疫受体信号通路的激活可能涉及细胞内钙水平的增加(Odin等人，1991年;廖等，1992;Rankin等人，1993年;Shen等人，1994年). 此外，有人认为βA和PrP原纤维与细胞膜相互作用，改变特定的钙通道活性(Korotzer等人，1995年;Florio等人，1996年;弗雷泽等人，1997年;Herms等人，1997年;Lin等人，1997年).
我们测试了THP-1细胞的纤维刺激是否改变了细胞内钙水平。用βA25-35或PrP106-126原纤维刺激的Fura-2负载的THP-1细胞显示出细胞内钙水平的短暂增加（图。A类,C). 由于细胞外钙的消除不影响纤维刺激的细胞内钙水平的增加，因此钙从细胞内储存中释放出来（图。B类,D类). UTP不能引起钙内流，这证实了细胞外钙的消耗（数据未显示）。
βA和PrP公司THP-1细胞的纤维刺激导致细胞内钙的释放。THP-1细胞用0.5 m预加载45 min米监测fura-2AM和细胞内钙的基础水平3分钟。A–D，在时间0时，用40μ米β-淀粉样蛋白(A类)或80μ米PrP公司106–126 (C) (3.75 × 106细胞/条件）在含钙或无钙的平衡盐溶液中持续约5分钟。去除细胞外钙对βA25–35- (B类)和PrP公司106–126诱导(D类)比较细胞内钙水平的变化。数据是两个独立实验的代表。E、 可编程逻辑控制器γ1从THP-1细胞的裂解物中免疫沉淀PrP公司106–126 (80 μ米; 5分钟）或βA25–35 (40 μ米; 2分钟）或Fc交联γR（右）二作为阳性对照[25μg/ml抗FcγR（右）二抗体+100μg/ml gαM Fab2（冰上15分钟，Ab+37°C下2分钟，Fab2)]. 通过一次免疫沉淀验证抗体特异性(IP（IP）)在没有免疫沉淀抗体的情况下(有孔小珠). 使用抗磷酸酪氨酸抗体4G10对免疫沉淀的蛋白质进行蛋白质印迹。剥离印迹，并用免疫沉淀抗体重新标记，以使蛋白质负荷正常化。
单核细胞免疫受体信号通路，如Fc下游γR（右）二通过激活磷脂酶C增加细胞内钙水平γ1（可编程逻辑控制器γ1) (Odin等人，1991年;廖等，1992;Rankin等人，1993年;Shen等人，1994年). 重要的是，THP-1细胞的βA和PrP原纤维刺激并不涉及PLC的激活γ1以及后续IP三-介导细胞内钙释放。βA和PrP原纤维刺激均未导致PLC的酪氨酸磷酸化和活化γ1，清楚地证明这些刺激使用的途径与Fc使用的途径在机械上不同γR（右）二刺激（图。E类).
细胞内钙水平调节蛋白质子集的蛋白质酪氨酸磷酸化
为了建立细胞内钙水平增加和酪氨酸激酶信号级联激活之间的联系，我们在控制胞外和胞内钙水平后评估了纤维刺激THP-1细胞裂解物中的蛋白酪氨酸磷酸化水平。首先，我们证实，在用PrP 106–126和βA 25–35刺激期间，酪氨酸激酶依赖性信号通路的激活不需要细胞外钙内流，因为在无钙介质中刺激THP-1细胞对βA和PrP诱导的蛋白酪氨酸磷酸化变化几乎没有影响（图。A类).
在THP-1细胞的βA和PrP原纤维刺激过程中，细胞内钙的释放是特异性酪氨酸激酶激活所必需的。通过SDS-PAGE解析等分的细胞裂解物，使用抗磷酸酪氨酸抗体4G10进行蛋白质印迹，并通过化学发光进行可视化。A类，用PrP公司106–126 (80 μ米; 5分钟），带βA25–35 (40 μ米; 2分钟），或以Con A（60μg/ml；5分钟）作为含钙HBSS的阳性对照(+钙)或无钙HBSS，含1m米EDTA和1米米EGTA公司(−钙).B类,C，然后比较THP-1细胞在二甲基亚砜车辆(c（c）), 10 μ米DTBHQ公司(B类), 10 μ米丹曲林(B类), 25 μ米BAPTA公司(C)，或50 n米萨普西加金(C)（45分钟；每个37°C）PrP公司106–126 (80 μ米; 5分钟）或βA25–35 (40 μ米; 2分钟）或Fc交联γR（右）二作为阳性对照[25μg/ml抗FcγR（右）二抗体+100μg/ml gαM Fab2（冰上15分钟，Ab+37°C下2分钟，Fab2)].D类，当THP-1细胞用二甲基亚砜车辆或50 n米thapsigargin持续10分钟。
由于有证据表明βA和PrP肽与细胞膜相互作用并影响L型钙通道活性，我们验证了通过L型通道的钙内流并没有导致蛋白质酪氨酸磷酸化水平的变化(Korotzer等人，1995年;Florio等人，1996年;弗雷泽等人，1997年;Herms等人，1997年;Lin等人，1997年). 用特异性L型钙通道拮抗剂维拉帕米和硝苯地平预处理细胞对βA和PrP纤维刺激后增加的蛋白酪氨酸磷酸化没有影响（数据未显示）(Carafoli，1987年;Palade等人，1989年). 这些数据证实，细胞外钙内流与βA和PrP原纤维刺激的酪氨酸激酶激活无关。
我们通过耗尽细胞内钙储备和监测对纤维诱导的蛋白酪氨酸磷酸化变化的影响，测试了激活一部分酪氨酸激酶活性以响应纤维肽是否需要增加细胞内钙水平。用βA 25–35或PrP 106–126刺激的THP-1细胞裂解物的Western blot分析显示，在用钙ATP酶抑制剂DTBHQ和thapsigargin预处理后，几种蛋白质的酪氨酸磷酸化降低（图。B类,C) (Charles等人，1993年;Khan等人，1995年). 当用赖氨酸受体抑制剂丹曲林和细胞内钙螯合剂BAPTA预处理细胞时，观察到类似的减少（图。B类,C) (Charles等人，1993年;Bissonnette等人，1994年). 这些数据证实，βA和PrP原纤维刺激所刺激的蛋白酪氨酸激酶活性的增加在一定程度上是由细胞内钙的变化介导的。为了进一步解决这一问题，我们用他昔加林处理THP-1细胞，诱导细胞内储存的钙暂时释放。短时间的thapsigargin治疗导致蛋白酪氨酸磷酸化增加，表明细胞内钙水平调节THP-1细胞中酪氨酸激酶的一个子集活性（图。D类)
MAP激酶对βA和PrP原纤维刺激的反应需要细胞内钙
纤维刺激的细胞内钙水平升高的发现促使我们研究这是否是导致MAP激酶激活的信号通路中的一个强制性中间步骤。DTBHQ和丹曲烯对细胞内钙储存的消耗阻止了PrP 106–126-和βA 25–35诱导的ERK激活（图。). 这些数据表明，细胞内钙离子浓度的升高是MAP激酶下游激活所必需的。
βA和PrP公司THP-1细胞MAP激酶活性的原纤维刺激需要细胞内钙释放。THP-1细胞在二甲基亚砜载体中培养(c（c）), 10 μ米DTBHQ公司，或10μ米丹曲林（45分钟；每个37°C），然后在PrP公司106–126 (80 μ米; 5分钟）或βA25–35 (40 μ米; 2分钟）或Fc交联γR（右）二作为阳性对照[25μg/ml抗FcγR（右）二抗体+100μg/ml gαM Fab2（冰上15分钟，Ab+37°C下2分钟，Fab2)]. 用SDS-PAGE溶解细胞裂解物的等分样品，并用针对ERK1和ERK2活化磷酸化形式的抗体进行蛋白质印迹(磷酸化细胞外信号调节激酶). 去除印迹并用抗ERK抗体重新制备(ERK公司)使蛋白质负荷正常化。
在βA和PrP纤维刺激的THP-1细胞中，蛋白酪氨酸磷酸化和ERK激活需要PKC活性
经典的PKC亚型是钙信号的效应子，该家族成员已被证明参与免疫受体信号传导(Shen等人，1994年;卡里米和伦纳茨，1995年). 我们通过用钙/磷脂依赖性PKC的特异性抑制剂Go6976预处理THP-1细胞来检测PKC是否参与纤维刺激的信号事件(Martiny-Baron等人，1993年). PKC抑制导致THP-1细胞的βa 25–35和PrP 106–126处理诱导的蛋白酪氨酸磷酸化降低（图。A类). 另一种PKC抑制剂，氯化白屈菜红碱也获得了类似的结果（数据未显示）(赫伯特，1990年). 这些发现证实了PKC活性是激活一组酪氨酸激酶所必需的。进行对照研究，以验证PKC活性通过用佛波酯（TPA）处理细胞，导致蛋白酪氨酸磷酸化水平增加，从而导致这些细胞中酪氨酸激酶活化（图。B类).
βA和PrP公司刺激THP-1细胞需要激活PKC来激活下游酪氨酸激酶和ERK。THP-1细胞在DMSO公司或乙醇车辆(c（c）)或2μ米去6976（45分钟；37°C）PrP公司106–126 (80 μ米; 5分钟）或βA25–35 (40 μ米; 2分钟）或Fc交联γR（右）二[25μg/ml抗FcγR（右）二抗体+100μg/ml gαM Fab2（冰上15分钟，Ab+37°C下2分钟，Fab2)]或Con A（60μg/ml；5分钟）作为阳性对照。细胞裂解液的等分样品通过SDS-PAGE、Western blotted进行解析，并通过化学发光进行可视化。A类，使用抗磷酸酪氨酸抗体4G10比较THP-1细胞在2μ米去6976在刺激之前PrP公司106–126和βA25–35.B类，当THP-1细胞在乙醇载体中孵育时，还监测了蛋白酪氨酸磷酸化的变化（0米TPA公司)或增加佛波酯的浓度TPA公司使用针对ERK1和ERK2活化、磷酸化形式的抗体对细胞裂解物进行蛋白质印迹。去除印迹并用抗ERK抗体重新配制，以使蛋白质负荷正常化。C–E类用2μ米去6976在刺激之前βA25–35 (C),PrP公司106–126 (E类)，或100 n米TPA公司(D类).
用Go6976预处理THP-1细胞阻止了PrP 106–126和βA 25–35对ERK的激活（图。C,E类). 对照实验证实，Go6976预处理也阻止了TPA诱导的THP-1细胞ERK的激活（图。D类). 这些数据表明，PKC可以驱动ERK激活所需的酪氨酸激酶依赖性通路，以响应纤维刺激。
钙敏感酪氨酸激酶PYK2被THP-1细胞的βA和PrP原纤维刺激激活
最近描述的一种钙敏感酪氨酸激酶，PYK2，在细胞内钙水平升高后被激活(Lev等人，1995年;Li等人，1998年). PYK2的钙依赖性调节是间接的，通过尚未确定的元素进行调节。用βA或PrP原纤维处理THP-1细胞可刺激PYK2酪氨酸磷酸化（图。A类)，这反映了这种酶的酶激活(Lev等人，1995年). 用Lyn和PKC抑制剂（分别为PP1和Go6976）预处理细胞，阻止PYK2磷酸化（图。A类). 此外，通过DTBHQ处理细胞抑制细胞内钙释放也阻止了纤维介导的PYK2激活（图。B类).
钙敏感酪氨酸激酶PYK2公司在以下时间后激活βA和PrP公司THP-1细胞的纤维刺激。THP-1细胞在DMSO公司车辆(c（c）)，50牛顿米萨普西加金，10μ米DTBHQ公司, 5 μ米PP1项目，或2μ米去6976（45分钟；每个37°C）PrP公司106–126 (80 μ米; 5分钟）或βA25–35 (40 μ米; 2分钟）或Fc交联γR（右）二[25μg/ml抗FcγR（右）二抗体+100μg/ml gαM Fab2（冰上15分钟，Ab+37°C下2分钟，Fab2)]或Con A（60μg/ml；5分钟）作为阳性对照。酪氨酸激酶PYK2公司从THP-1细胞裂解物中免疫沉淀细胞骨架蛋白paxillin，并通过SDS-PAGE进行解析。用抗磷酸酪氨酸抗体4G10对免疫沉淀蛋白进行Western blot。剥离印迹并用免疫沉淀抗体进行重制，以使蛋白质负荷正常化。A类,B类,D类,E类，中的更改PYK2公司(A类,B类)和帕罗西汀(D类,E类)用10μ米DTBHQ公司, 5 μ米PP1项目，或2μ米去6976在刺激之前PrP公司106–126和βA25–35.C,F类，中的更改PYK2公司(C)和帕罗西汀(F类)用2μ米去6976100n刺激前米TPA公司.
作为在该途径中定位PYK2的另一种方法，我们使用TPA直接刺激PKC活性，以表明PYK1随后被激活（图。C). TPA驱动的PYK2磷酸化被特异性PKC抑制剂Go6976抑制。这些观察结果表明，PYK2磷酸化是这些细胞中钙释放和PKC激活的结果。
我们进行了另一项研究，以验证PYK2被βA和PrP纤维刺激途径激活。细胞骨架蛋白paxillin是PYK2的已知底物，在PYK1激活后被磷酸化(Hiregowdara等人，1997年;Li和Earp，1997年;Ostergaard等人，1998年). PrP 106–126和βA 25–35均刺激了paxillin磷酸化的增加，而用DTBHQ、PP1和Go6976预处理细胞可抑制paxillin-磷酸化（图。D类,E类). TPA刺激PKC活性和随后的PYK2活化也导致帕西林的酪氨酸磷酸化（图。F类).
这些数据支持以下结论：βA和PrP途径中的PYK2激活是Lyn和Syk激活、细胞内钙释放和PKC激活的结果，并且位于信号转导途径中这些元素的下游（见图。).
纤维激活小胶质细胞的机制βA和PrP公司神经毒性肽。显示了一个详细说明所定义的基于酪氨酸激酶的信号通路的示意图βA和PrP公司纤维激活小胶质细胞和单核细胞，诱导产生神经毒性因子。指出了信号通路中的一些点，在这些点上，特定的酶抑制可以减轻神经毒性产物的产生。IL1号机组-β、 白细胞介素-1β；TNF公司α、 肿瘤坏死因子α；Y（Y）酪氨酸磷酸化。
不同的信号通路导致βA和PrP纤维刺激呼吸爆发和超氧阴离子生成
巨噬细胞通过激活呼吸爆发对免疫刺激作出反应，从而产生细胞内超氧阴离子(Chanock等人，1994年;Rosen等人，1995年). 这些活性氧物种的胞外扩散对周围细胞起到毒素的作用。我们观察到，βA和PrP原纤维在THP-1细胞中诱导呼吸爆发，测量为细胞内超氧化物阴离子对NBT的减少（图。) (皮克，1986年). 用Lyn、PKC或细胞内钙释放抑制剂（分别为PP1、Go6976或thapsigargin）预处理细胞，不能抑制纤维刺激的呼吸爆发。这些数据表明NADPH氧化酶的激活是通过信号通路进行的，信号通路与ERK激活和细胞因子合成刺激所需的信号通路在机械上不同(Tannenbaum和Hamilton，1989年;伍德，1994年;Schmid-Alliana等人，1998年).
βA和PrP公司纤维刺激THP-1细胞的呼吸爆发。THP-1细胞在二甲基亚砜载体中培养(控制)，50牛顿米萨普西加金(解冻), 5 μ米PP1项目，或2μ米去6976（30分钟；每个37°C）PrP公司106–126 (40 μ米)或βA25–35 (40 μ米). 在含有1μg/ml NBT的HBSS中刺激细胞30分钟。收集细胞并在RIPA缓冲液中进行超声处理。通过550 nm处吸光度的变化测量超氧阴离子的生成。显示了代表三个独立实验的平均吸光度值（±SEM）。
βA和PrP纤维刺激的酪氨酸激酶信号通路刺激THP-1单核细胞产生神经毒性因子
许多报告描述了小胶质细胞系细胞产生神经毒性产物的能力，以应对βA或PrP肽的治疗(Forloni等人，1993年;朱利安等人，1995年;Brown等人，1996年;Ii等人，1996年;Klegeris和McGeer，1997年;Klegeris等人，1997年;Kretzschmar等人，1997年;洛顿，1997年;McDonald等人，1997年; C.K.Combs、D.R.McDonald和G.E.Landreth，未发表的观察结果）。我们使用了一个组织培养系统，该系统使用了高度纯化的原代小鼠神经元群体，或者与纯化的小鼠小胶质细胞共培养，或者在THP-1细胞的条件培养基中培养，以确定神经毒性和促炎性产物的产生是否依赖于确定的酪氨酸激酶信号通路在这里。用PrP 106–126、βA 25–35或βA 1–40刺激纯化的小鼠小胶质细胞和THP-1细胞48小时，并加入或不加入选定的特异性酶抑制剂。我们观察到，来自未经处理的THP-1细胞或小胶质细胞的条件培养基只会引起低水平的神经元死亡（图。). 然而，用βA-和PrP-刺激的THP-1细胞或小胶质细胞的条件培养液培养神经元，导致神经元死亡的程度大大增加。
βA和PrP公司纤维刺激小胶质细胞和THP公司-1个单核细胞分泌神经毒性产物。小鼠皮层神经元的纯化培养物（E17；5-7天在体外)单独培养或在小胶质细胞或条件培养基中培养THP公司-1个电池（4.0×104神经元/1.8×104小胶质细胞或THP公司-1个单元格）。A、，将小胶质细胞与肽原纤维一起加入神经元培养物中βA25–35 (1 μ米)或1μg/ml LPS作为阳性对照48小时。B类–E类,THP公司-1个细胞也被刺激48小时，方法是将其放入涂有肽的组织培养孔中PrP公司106–126,βA1-40，以及βA25–35（48 pmole/mm2)在DMSO车辆在场的情况下(控制)或25μg/ml皮塞坦诺(照片.;C), 2 μ米去6976(C), 5 μ米PP1项目(D类)、和25μ米PD98095型(E类). 调节介质是从井中获得的，其中THP公司-1个细胞在没有或存在βA或PrP公司以及控制单独培养基或仅含表面结合物的培养基的培养βA或PrP公司各种药物的效果评估包括在没有或存在THP公司-1个单元格。将条件培养基添加到小鼠皮层神经元培养物中72小时。小胶质细胞-神经元共培养物维持48小时。然后固定神经元，对神经元特异性MAP2蛋白进行染色，并进行计数。每个条件下四个区域的神经元在重复的孔中计数并平均（±SEM）。图是四个独立实验的代表。
为了评估基于酪氨酸激酶的信号通路是否产生神经毒性产物，在βA和PrP纤维刺激48小时期间，使用通路中特定酶的抑制剂治疗THP-1细胞。用PP1、Go6976和piceatannol（分别抑制Lyn、PKC和Syk）处理THP-1细胞可抑制神经毒性产物的产生（图。C,D类). 我们还用MEK抑制剂PD98095预处理THP-1细胞，以抑制βA下游ERK激活和PrP原纤维刺激(Alessi等人，1995年). 观察到类似的神经保护作用。这些数据清楚地表明，我们定义的纤维激活信号通路直接负责产生神经毒性产物（图。).
脚注
这项工作得到了国家老龄研究所AG08012拨款的支持。C.K.C.得到了美国国立卫生研究院（National Institutes of Health Training Grant）HD0710422的支持。我们感谢Kurt Brunden博士和Gianluigi Forloni博士分别提供的炒制βA 25-35和PrP 106-126肽。Fred DeBeer博士亲切地为我们提供了乙酰化低密度脂蛋白。我们感谢George Dubyak博士和Ben Humphreys博士在细胞内钙测量方面的帮助和有益的评论。我们也感谢David Friel博士对细胞内钙调节的有益讨论。
信件应寄至加里·兰德雷博士，阿尔茨海默病研究实验室，E 504，凯斯西储大学医学院，10900 Euclid Avenue，Cleveland，OH 44106-4928。
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