神经科学杂志。1999年2月1日；19(3): 1038–1048.
神经营养素支持多种感觉轴形态的发育
,1 ,2 ,2和1
C.迈克尔·克努森
2华盛顿大学医学院霍华德·休斯医学研究所医学和病理学系，密苏里州圣路易斯63110
斯坦利·科尔斯迈尔
2密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院霍华德·休斯医学院医学与病理学系，邮编63110
1神经科神经系统损伤研究中心
2密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院霍华德·休斯医学院医学与病理学系，邮编63110
收稿日期：1998年8月3日；1998年9月25日修订；1998年11月13日接受。
摘要
在发育中的胚胎中，外周轴突的最初生长被认为独立于神经营养素。然而，由于神经营养素在早期发育阶段对生存的严格要求，在缺乏这些分子的情况下，外周神经元可以延伸轴突和精细轴突分支的程度尚未直接研究。我们在这里显示，BAX缺乏小鼠的胚胎感觉神经元在没有神经营养素的情况下无限期存活，即使是在高度分离的培养物中，也可以评估细胞自主轴突的生长。胚胎第11天（E11）至E13天，轴突向靶细胞快速生长的阶段体内,Bax公司在没有神经营养素的情况下培养的−/-感觉神经元几乎总是单极的，并且只延伸一个基本的轴突。添加神经营养素导致第二个轴突的生长和两个过程的显著、剂量依赖性延长。令人惊讶的是，对单个神经营养素的形态反应差异很大。神经营养素-3（NT-3）支持神经营养因子亚群的突触终末树状化Bax公司−/−神经元，而NGF在不同的亚群中主要产生轴突伸长。我们得出的结论是轴突生长在体外神经营养素依赖于感觉神经元发育的早期阶段。此外，神经营养素支持不同感觉神经元亚群特征的不同轴突形态的出现。
关键词：神经营养素、神经生长因子、神经营养素-3、脑源性神经营养因子、背根神经节、BAX、发育、轴突形态
神经营养因子的神经营养素家族最令人印象深刻的作用之一是在胚胎鸟类和哺乳动物的外周神经节外植体中观察到轴突密度的剂量依赖性增加。然而，令人惊讶的是，这一现象的解释和含义仍不清楚。对神经生长因子（NGF）对单个鸟类感觉神经元形态的影响进行的分析没有揭示出在早期发育阶段对轴突生长的剂量依赖性影响，这表明在有足够的NGF存在的情况下，外周神经元以最佳速率发育轴突，以使其能够存活(斯科特和戴维斯，1993年). 因此，外植体轴突密度的剂量依赖性增加可能与对存活的影响有关，而不是与NGF对轴突生长的直接影响有关(斯科特和戴维斯，1993年). 与感觉轴突生长有关的外周组织中NGF和感觉神经元上NGF受体出现时间的初步描述体内也不赞成这样的解释，即NGF在轴突向其目标投射的发育阶段的生长调节中发挥任何直接作用(Lumsden和Davies，1983年;Davies等人，1987年;Ernfors等人，1992年). 事实上，最受欢迎的假设是，在轴突位于其靶区附近后，神经营养因子主要起到介导分支的作用(麦克法兰和霍尔特，1997年).
然而，最近的一些观察结果与神经营养素可能在早期发育阶段调节轴突生长的观点一致。例如，背根神经节（DRG）神经元表达神经营养素受体，需要神经营养素才能在胚胎第11.5天（E11.5）存活，这表明在轴突生长的早期阶段有能力对这些分子作出反应(Fariñas等人，1996年;怀特等人，1996年). 此外，早在E10，神经营养素-3（NT-3）就沿着感觉和交感轴突投射的发育途径在间质中合成，这与NT-3可能影响几种外周神经元早期轴突生长的观点一致(Fariñas等人，1996年;Verdi等人，1996年;怀特等人，1996年;Wilkinson等人，1996年). 在BDNF-和NT-3（以及trkB-和trkC-）阴性小鼠中，前庭神经节和耳蜗神经节的轴突投射出现异常(Ernfors等人，1995年;Schimmang等人，1995年;Fritzsch等人，1997年)trkA空区中交感神经轴突向远端靶点的延伸不足(Fagan等人，1996年). 然而，在神经营养素和/或trk缺乏的情况下，很难将轴突生长的调节与存活的调节分开。有趣的是，FGF2和FGF受体信号显著影响视网膜神经节细胞轴突沿视路的延伸率爪蟾(McFarlane等人，1995年). FGF2或任何其他神经营养因子是否在调节哺乳动物轴突延伸中起作用尚不清楚（有关综述，请参阅麦克法兰和霍尔特，1997年).
研究神经营养素在早期发育阶段轴突生长中的作用的一个主要困难是，一个或多个神经营养素家族成员对许多类外周神经元的绝对生存需求。因此，在没有这些分子的情况下，也不可能直接检查轴突的生长体内或在体外然而，最近，我们对凋亡的理解取得了进展，发现了外周神经元能够存活的条件在体外和体内在缺乏外源性神经营养素的情况下（有关综述，请参阅约翰逊等人，1996年). 例如，在凋亡调节因子BAX无效的小鼠中，交感神经节神经元无限期存活在体外在缺乏NGF的情况下，新生的运动神经元可以存活下来体内(Deckwerth等人，1996年). 自然发生的细胞死亡研究Bax公司空值表明包括DRG神经元在内的许多类型的外周神经元也受到类似的调节(怀特等人，1998年). 重要的是，Bax公司−/−小鼠存活至成年，周围神经系统（PNS）或CNS均无明显异常，周围神经和视神经轴突数量增加(怀特等人，1998年). 这些发现表明，轴突的生长和连接性并没有受到这种分子缺失的深刻影响。
研究在外周神经元需要这些分子生存的发育阶段，轴突形态对神经营养素的依赖性体内，我们培养了E11–E13中DRG的感觉神经元Bax公司−/−小鼠。这个Bax公司零突变使感觉神经元能够在高度分离的培养基中存活，在这种培养基中，神经元几乎不受任何非神经元细胞的营养影响，单个神经元的轴突可以被完整地追踪。我们的发现表明，在没有这些分子的情况下，感觉神经元总是只延伸一个基本的轴突。出乎意料的是，我们发现NGF、NT-3和BDNF都支持来自感觉神经元子集的不同轴突形态反应。我们认为，神经营养素支持外周轴突的大量伸长，以跟上胚胎的生长，这些分子支持不同感觉轴突形态的发育。
材料和方法
动物。华盛顿大学动物研究委员会批准了所有涉及动物的实验程序。Bax公司+/−繁殖雄性和雌性小鼠以生产Bax公司+/+,Bax公司+/−，和Bax公司−/−后代。插入日期被认为是E0。在无菌条件下，从过量服用戊巴比妥钠的母亲身上解剖整个胚胎，并收集在添加5%热灭活（HI）马血清的冷冻L15培养基中。胚胎在E11–E13收获，发育阶段通过冠臀测量进行验证。利用尾部作为DNA来源，通过PCR确定单个胚胎的基因型。PCR引物序列已公布(怀特等人，1998年).
分离细胞培养。对先前发布方法的修改(艾希勒和里奇，1989年)用于培养分离的DRG神经元。重要的是，为每个胚胎建立了单独的培养物。随后按照上述方法对胚胎进行基因分型。从整个脊髓口尾段的神经节进行解剖，并收集在添加5%HI马血清的冰冻L15培养基中。用1 mg/ml胶原酶A（Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN）在37℃下酶解细胞15分钟，然后用0.05%胰蛋白酶和0.02%EDTA在37℃酶解7分钟。用4 vol Minimal Essential Medium（MEM；Life Technologies，Gaithersburg，MD）灭活胰蛋白酶含有5%HI胎牛血清（Summit，Fort Collins，CO）和神经节通过短暂离心收集。去除MEM和胰蛋白酶，将神经节重新悬浮在含有5%HI胎牛血清的MEM中米我-谷氨酰胺和1×青霉素/链霉素。然后通过全孔径和三分之一孔径的巴斯德吸管研磨，使细胞机械分离。将5-氟-2′-脱氧尿苷（Sigma，St.Louis，MO）以最终浓度10μ米通过台盼蓝排除法和血细胞仪测定总细胞数和活细胞数。分离的细胞被镀在高压灭菌玻璃盖玻片上（托马斯科学公司），盖玻片涂上聚乳酸混合物过夜-d日-赖氨酸（0.1 mg/ml；Sigma）和层粘连蛋白（4 ng/ml；协同生物医学产品）置于24孔无菌培养板（德克萨斯州休斯顿Fisher Scientific）中，每孔500或2000个细胞。一些培养物在电镀时补充了NGF、NT-3、BDNF或NT-4（除非另有说明，否则每种浓度为50 ng/ml）。维持姊妹培养，不添加神经营养素。每个实验都用三到五次不同交配的胚胎重复进行。
百分比Bax公司量化了在缺乏神经营养素的情况下存活的−/−神经元。最初的神经元数量是通过在电镀后2小时计数右侧相细胞来确定的。将24小时和72小时后的B相神经元数量与初始神经元数量进行比较。大约90%和60%Bax公司−/−神经元分别在24小时和72小时后在没有神经营养因子的情况下存活。相比之下，<5%Bax公司+/+24小时后神经元存活，72小时后无神经元出现。
免疫细胞化学。培养物保持3 d（除非另有说明），然后在室温下在PBS中的4%多聚甲醛和0.025%戊二醛中固定30 min。使用针对磷酸化神经丝H（NFH）和M（NFM）（SMI 31；Sternberger Monoclonals Inc.，马里兰州巴尔的摩）的单克隆抗体观察细胞形态。对于免疫组织化学，在室温下用1%猪明胶、0.2%Triton X-100和1.5%山羊血清在Superblock缓冲液（Pierce，Rockford，IL）中阻断培养30分钟。以1:1000的浓度添加一级抗体，并在4°C下培养过夜。按照制造商的协议，使用Vectastain ABC试剂盒（加利福尼亚州伯灵盖姆Vector Laboratories）对信号进行放大，并使用含有500 ng/ml四氢二氨基联苯胺的溶液进行可视化。
量化轴突数量和胞体大小。用DPX将盖玻片安装在载玻片上，用40倍物镜在尼康Optiphot显微镜的明亮视野中观察神经元。从每张盖玻片底部三分之一处随机挑选的神经元用透明摄影机进行追踪。除了Bax公司+/+用NT-3处理的神经元，从三个单独的培养实验中的六个胚胎中各提取50个神经元。因此，对于每个实验条件，总共分析了300个神经元。对于Bax公司+/+用NT-3处理的神经元，由于在这种情况下存活的神经元数量较少，只提取了145个神经元。对长度大于50μm的轴突进行评分。计算每只动物具有一个或两个或多个轴突的神经元的百分比。这些图纸被扫描到Macintosh电脑中，并使用美国国立卫生研究院1.61版图像软件对人体区域进行量化。
量化轴突总长度和分支点数量。为了量化轴突总长度，用10倍物镜在明亮的视野中观察来自极低密度培养物（每孔500个细胞）的神经元。只使用与相邻神经元完全分离的神经元。对于每种实验条件，从三到四个单独的培养实验中，从六到七个胚胎中总共绘制50个神经元的清晰图像。这些图纸被扫描到Macintosh电脑中，轴突长度使用美国国立卫生研究院1.61版图像软件进行量化。通过对每个神经元的所有轴突的长度求和来确定总轴突长度。每个神经元的分支点数量也由这个群体决定。如果轴突形成的分支持续距离≥25μm，则计算分支点。
统计分析。收集单个胚胎的数据并用于统计分析。通过单因素方差分析确定条件之间的总体显著差异。后hoc采用Tukey试验进行比较。图和文本中的数据代表了五到七个胚胎的平均值和SEM。
结果
感觉轴突的生长和束化依赖于神经营养素
图一显示了野生型分离培养物（24孔板每孔2000个细胞）中感觉神经元的典型外观(Bax公司+/+)E13小鼠在NGF存在下培养。神经体和轴突用SMI 31染色，SMI 31是一种针对NFM和NFH磷酸化表位的单克隆抗体。来自的文化Bax公司无NGF的−/−小鼠（图。b条)神经突起长出的范围要小得多，看起来有着惊人的不同。如图所示c（c），培养来自Bax公司服用50 ng/ml NGF的−/−小鼠恢复了神经突起的生长模式，与对照组无明显区别。
在缺乏神经营养素的情况下，感觉轴突生长是基本的。中等密度（每孔2000个神经元）的神经元培养物的显微照片，在50 ng/ml的浓度下生长72小时NGF公司如图所示。一，神经元来自Bax公司+/+小鼠在有NGF公司.b条，神经元来自Bax公司缺乏神经营养素的−/−小鼠(无NT)延伸不形成束的短而有分支的轴突。c（c），见证人：NGF公司，来自的文化Bax公司−/−小鼠看起来与对照组没有区别。
在每个实验中，处理过的培养物和未处理的培养物之间的束状程度也有明显差异。在Bax公司+/+在NGF存在的小鼠中，几乎所有的主要轴突干都很容易出现束状结构（图。一). 相反，Bax公司在缺乏神经营养素的情况下，−/−DRG培养物显示出很少的轴突束聚（图。b条). 在神经营养素缺乏的条件下，与相邻轴突相比，轴突显然更喜欢层粘连蛋白基质生长。治疗Bax公司含有NGF的−/−培养物恢复了束状排列，并导致外观几乎与野生型培养物相同（图。c（c）).
在缺乏神经营养素的情况下，感觉神经元是单极的
形态反应Bax公司在E13中详细描述了存在和不存在神经营养因子的−/−神经元。在高密度和中等密度下，很难确定受NGF影响的轴突生长和分支参数。因此，我们准备了高度分离的培养物（每个孔500个神经元）。值得注意的是，这些由E13小鼠制备的培养物几乎没有非神经元细胞（见材料和方法）。
对这些低密度培养物中单个神经元的分析表明，在缺乏神经营养素的情况下Bax公司−/−小鼠几乎都是单极的，并延伸出短的分支轴突（图。一). 什么时候？Bax公司−/−神经元是在NGF存在的情况下生长的，NGF是神经元的一个亚群，其反应是假设双极结构并发出长轴突（图。b条). 用NT-3治疗还导致双极形态，在神经元亚群中有广泛的轴突生长和终末分支（见下文）（图。c（c）).
神经营养素反应的量化。a–c，显微照片显示了典型的轴突延伸模式Bax公司神经元生长72小时在体外没有神经营养素(一)或在50 ng/ml的浓度下NGF公司(b条)或NT-3型(c（c）).d日,e（电子），条形图显示具有一个或两个或多个轴突的神经元的百分比（±SEM）Bax公司−/−小鼠和Bax公司+/+室友。在这些培养条件下，几乎所有的神经元Bax公司+/+小鼠在任何一种情况下NGF公司或NT-3型是两极的(点画条在里面d日和宽的-阴影条在里面e（电子））。相反，在没有添加神经营养素的情况下(无NT)，90%Bax公司−/−神经元为单极性(开放式酒吧在里面d日,e（电子）). 添加其中之一NGF公司(实心钢筋在里面d日)或NT-3型(好的-阴影条在里面e（电子）)导致了很大一部分Bax公司有两个或更多轴突的神经元。无神经营养素组与接受神经营养素治疗组之间具有单个轴突的神经元百分比的差异NGF公司或NT-3型非常重要(对< 0.001;n个=每组6个胚胎）。
在低密度和中等密度培养物中定量E13处单极、双极和多极（三个或更多轴突）神经元的数量。图中的直方图d日显示>90%的Bax公司无神经营养素培养的−/−神经元为单极性，<10%为双极性，在含有三个或更多轴突的广泛样本中没有神经元。当神经元来自Bax公司将−/−小鼠在NGF存在下培养72小时，55%的神经元有两个或多个轴突。注意，这并不接近Bax公司+/+将低密度和中等密度培养物的数据汇集在一起时，近90%的神经元有两个或多个轴突。大概所有类别的神经元都能存活Bax公司−/−培养物，即除NGF外，通常对NT-3和其他潜在生长因子产生反应的培养物。因此，毫不奇怪，这些培养物中有很大比例的神经元对NGF没有反应，并生长出第二个轴突。
NT-3的结果在性质上相似（图。e（电子）). 因此Bax公司在经NT-3处理的培养物中，−/−神经元有两个或更多轴突，而未经处理的神经元只有<10%。同样，即使在NT-3存在的情况下，仍保持单极性的近70%的神经元可能代表了一个NT-3无反应的群体，该群体已在Bax公司−/−小鼠。两种神经营养素一起添加是相加的，在83%的细胞中产生反应(n个=4个胚胎）。
神经营养素对体细胞大小的影响也被量化。添加NGF后，应答者的体细胞大小略有增加Bax公司−/−神经元与Bax公司无神经营养素培养的−/−神经元[平均体面积，206.3±8.8μm2（±扫描电镜）(n个=6）与157.1±4.8μm相比2(n个= 6)]. 正如预期的那样，因为许多NT-3反应神经元是本体感受器Bax公司NT-3处理的培养物中的−/−神经元甚至更大（平均体面积为239.4±14.5μm2;n个= 6).
轴突延伸在缺乏神经营养素的情况下是基本的
图显示了来自Bax公司无神经营养素的−/−小鼠和Bax公司−/−或野生型小鼠在NGF或NT-3存在下维持3天。根据轴突总长度对神经元进行排序，并选择每五个或十个神经元。因此，图中所示的神经元准确地反映了在整个神经元群体中观察到的差异。
形态学反应NGF公司和NT-3型.分离的DRG神经元的清晰图像Bax公司−/−和Bax公司+/+在无神经营养素或50ng/ml浓度下培养72小时NGF公司或NT-3型如图所示。一个神经元(蓝色)或两个或更多(绿色和粉红色分别考虑轴突。轴按总长度增加的顺序排列。针对每种情况显示了整个人群的周期性样本。一,Bax公司无神经营养素培养的−/−神经元(无NT)总是有很短的高度分支的轴突。b条，添加NGF公司导致出现了Bax公司具有更长轴突的−/−神经元。c（c），添加NT-3型也导致了广泛的轴突伸长，但请注意NT-3型–响应神经元与响应神经元的外观显著不同NGF公司.d日,e（电子），代表Bax公司+/+高度分离培养的神经元NGF公司(d日)或NT-3型(e（电子）)如图所示。
3天后，神经生长因子对轴突长度的显著影响很明显（图。b条,d日). 的外观Bax公司无神经营养素培养的−/−神经元非常均匀（图。一). 神经元总是有短的分支轴突，总长度为～500μm（图。一). 相反，来自Bax公司+/+接受NGF治疗的小鼠比正常小鼠长6倍，除轴突末端外几乎没有分支（图。d日,一).
量化神经营养素对轴突长度的影响。将所有轴突和分支的长度相加，计算轴突总长度。一,b条，每个酒吧代表6至7的平均值±SEM第13页胚胎。一,NGF公司. The露天酒吧显示了轴突的总长度Bax公司缺少神经营养素时的−/−神经元(无NT)72小时后。单极神经元Bax公司−/−用NGF公司(左侧实心条)与未经处理的神经元相比没有显著延长。Bax公司用NGF公司那是多极的(右实心棒)显示轴突总长度显著增加(对< 0.001). 然而，这些轴突并不像Bax公司+/+神经元NGF公司(点画条).b条,NT-3型再一次，单极Bax公司−/−神经元NT-3型(左侧罚款-阴影条)长度不超过Bax公司缺少神经营养素时的−/−神经元(露天酒吧). 多极神经元存在NT-3型(好吧，罚款-阴影条)轴突总长度显著增加(对< 0.001). 对于NT-3型–反应神经元，总长度与Bax公司+/+神经元(宽的-阴影条).c（c），剂量-轴突生长的反应第13页.Bax公司−/−神经元在缺失的情况下生长(无NGF)或出现浓度增加的NGF公司持续1d在体外(DIV公司). 每个点代表五个胚胎（每个胚胎20个神经元）测得的平均轴突总长度（±SEM）。的剂量NGF公司与未经处理的神经元相比，低至0.5ng/ml导致轴突长度显著增加。增加的浓度NGF公司以剂量依赖的方式增加轴突的生长量。d日，神经营养素对轴突生长的影响第12页胚胎。每个酒吧表示五个参数的平均值±SEM第12页胚胎。这个露天酒吧显示了轴突的总长度Bax公司−/−神经元在缺乏神经营养因子的情况下(无NT)72小时后。Bax公司用NGF公司显示了一种形态反应(实心钢筋)轴突总长度显著增加(对< 0.001). 有反应神经元NT-3型(好的-阴影条)轴突总长度也显著增加(对< 0.001).
Bax公司用NGF处理的−/−神经元分为两个不同的群体（图。b条,一). 因此，双极神经元对NGF的反应是延长长轴突，其外观和总长度与野生型神经元相似。相反，单极神经元只延伸出基本的轴突。这些神经元可能对NGF无反应，但由于Bax公司零突变。
值得注意的是，用NGF治疗并没有完全恢复到正常的轴突长度Bax公司-空神经元。因此，72小时后，双极神经轴突的总长度Bax公司-空神经元为轴突长度的～65%Bax公司+/+培养（图。一). 这可能表明Bax公司在调节轴突生长方面（见下文），或者可能是包含一些Bax公司可能是两极但对NGF无反应的−/−神经元。确实是两极的Bax公司在无NGF的情况下，−/−神经元的轴突总长度仅为598.9±66.3μm（±SEM；n个= 4). 单极Bax公司+/+存在NGF的神经元与双极性神经元无法区分Bax公司+/+神经元，轴突总长度为2214.7±348.7μm(n个= 4).
的响应Bax公司NT-3的−/−神经元在某些方面相似，尽管存在明显的重要差异。因此，来自Bax公司对NT-3有反应的−/−小鼠（即具有两个或多个轴突的神经元）的轴突总长度是单极性无反应神经元或在缺乏神经营养素的情况下生长72小时的神经元的3.5倍（图。一,c（c）,b条). 轴突总长度Bax公司用NT-3处理的培养物中的−/−神经元与野生型小鼠神经元的总轴突长度没有显著差异（图。c（c）,e（电子）,b条). 然而有趣的是Bax公司NT-3处理的−/−神经元没有达到NGF存在下生长神经元的轴突长度。NT-3处理神经元的另一个显著特征是轴突高度分支，这使得这些神经元看起来与NGF处理的神经元明显不同（见下文）。同样Bax公司+/+在这种条件下，NT-3处理的培养物与双极神经元的长度（1847.8±365.9μm；n个= 4).
据报道，在鸟类神经元的早期发育阶段，NGF的浓度足以支持存活神经元的最大生长(斯科特和戴维斯，1993年). 然而，在我们的培养条件下，随着NGF浓度的增加，小鼠感觉神经元的轴突长度明显增加。因此，在培养的24小时内，轴突长度在50 pg/ml至50 ng/ml NGF的浓度范围内增加了几乎四倍（图。c（c）). 我们的结果与斯科特和戴维斯（1993）虽然我们注意到在他们的研究中使用了鸟类三叉神经细胞，并且神经元培养了不同的时间长度，但目前还不清楚。
轴突向周围靶点大量生长体内发生在E13之前。为了评估早期神经营养素非依赖性轴突的生长，我们培养了E11和E12的感觉神经元Bax公司−/−小鼠。即使在这样的年龄，Bax公司在缺乏神经营养素的情况下，感觉轴突的伸展是基本的。事实上，对添加的神经营养因子的反应甚至比E13神经元的反应更令人印象深刻（图。d日)NGF诱导轴突长度增加6倍。
有趣的是，在E12，对单个神经营养素家族成员有反应的神经元百分比发生逆转，约60%的神经元对NT-3有反应，而只有40%的神经元对NGF有反应。这可能反映了这样一个事实，即表达trkC的神经元比表达trkA的神经元更早生成。值得注意的是，许多表达trkA的神经元在这个年龄段也表达trkC(Ernfors等人，1992年;怀特等人，1996年；另请参阅布赫曼和戴维斯，1993年). 然而，增加NT-3浓度对表现出形态反应的细胞百分比没有影响，可能使通过trkA激活的可能性降低。
在E12，很少Bax公司+/+在这些高度分离的条件下，即使存在神经营养素，神经元也能存活72小时。在E11，几乎没有任何基因型的神经元在任何条件下存活。少数人Bax公司在没有神经营养素的情况下，在E11存活的−/-神经元几乎没有轴突生长，而在这个年龄段，至少有一些神经元在有神经营养素存在的情况下延伸轴突（数据未显示）。
NGF、NT-3和BDNF对轴突分支的不同影响
在低功率（左侧面板）和高功率（中间面板和右侧面板）的各种条件下，轴突的代表性外观如图所示.感觉神经元来自Bax公司−/−小鼠表现出沿着整个轴突或至少轴突远端一半的小而薄的分支的典型模式（图。a–c). 相反，在野生型和Bax公司用NGF处理的−/−小鼠，沿着轴突的大部分长度，神经元没有分支（图。d日). 然而，在轴突的最远端，经NGF处理的神经元的分支比未经神经营养素培养的神经元的轴突长且厚（图。e（电子）,（f）). 这些观察结果表明，NGF在早期发育阶段的一个主要作用是促进间质延长，抑制轴突主要部分的分支，仅在远端轴突部分增强分支。
NGF公司,NT-3型、和BDNF公司调节不同的形态反应。一,d日,克,j个，低功率显微照片（比例尺j个).b条,c（c）,e（电子）,（f）,小时,我,k个,我，高倍显微照片（比例尺英寸我). 为了可视化单个细胞的形态Bax公司将−/−小鼠以低密度（每孔500个神经元）放置并生长72小时在体外无神经营养素或存在50 ng/mlNGF公司,NT-3型，或BDNF公司.a–c，代表Bax公司无神经营养素培养的−/−神经元(无NT). 神经元是单极的，从初级轴突沿其全长延伸出许多短分支。d–f日，典型NGF公司-反应灵敏的Bax公司−/−神经元在NGF公司这些神经元是双极的，长而相对不分枝的轴突。NGF公司处理抑制了细胞体附近短枝的延伸。典型的情况是，沿着轴突的远端有一些粗口径的分支。g–i类，典型的NT-3响应Bax公司−/−神经元NT-3型.NT-3型虽然神经元的初级轴突经NT-3型比NGF公司-经处理的神经元。NT-3型–反应性神经元几乎总是在其轴突末端出现精细的分支。j–l，代表Bax公司−/−神经元描述了神经元子集对BDNF公司请注意突出的板条足。
在用NT-3处理的培养物中，这种模式明显不同，因为末端分支要广泛得多。因此，NT-3反应神经元来自Bax公司+/+和Bax公司−/−培养物通常具有许多粗枝，从轴突的远端出现广泛的三级树状结构（图。g–i类). 这种分支反应可能令人惊讶，因为轴突向靶细胞延伸，并被这个年龄段间充质合成的NT-3所包围。然而，即使在E12，这种分支模式在大多数对NT-3有反应的神经元中也很明显。
定量了NGF和NT-3对分支的影响（图。). 大多数分支机构Bax公司−/−神经元非常短，因此延伸的时间不够长，无法将其起源视为分支点（见材料和方法）。因此，E13Bax公司在没有神经营养素的情况下生长72小时的−/−神经元，每个神经元的分支点相对较少。NGF的存在导致每个神经元的分支点数量适度增加。用NT-3处理培养物导致分支点数量大幅增加。当考虑到轴突总长度时，NGF和NT-3处理的神经元之间的轴突分支差异也很明显。NGF反应神经元有4.0±0.5（±SEM；n个=6）而NT-3反应神经元为10.6±0.8(n个=6）分支点/总轴突长度的每毫米。
NGF公司和NT-3型差异调节轴突分支的范围。酒吧显示六个胚胎每个E13 DRG神经元的平均分支点数（±SEM）。在缺乏神经营养素的情况下(无NT),Bax公司72小时后，每个神经元大约有5个分支点在体外.治疗Bax公司−/−和Bax公司+/+含有NGF的神经元导致每个神经元的分支点数量略有增加。NT-3的存在导致每个神经元的分支点数量显著增加(对< 0.001).
当将NGF和NT-3同时添加到E13培养物中时，如果NGF和NT-3作用于不同的群体，则可以观察到两种形态反应的细胞。在这些条件下，54%的神经元显示出清晰的NGF型形态，13%的神经元具有清晰的NT-3样形态。百分之十六的人无法自信地分类，可能是因为这些形态学标准不是绝对的，或者是因为一个小的亚群对这两个因素都有反应。
BDNF在某些方面支持类似于NT-3诱导的分支反应（图。j个). 在E12，约40%的人口Bax公司−/−神经元对BDNF的反应是轴突形态发生变化。然而，除了分支外，BDNF还沿E12处约30%的反应人群的远端轴突轴诱导了明显的跛足反应（图。k个,我). 这种特征形态的意义尚不清楚。有趣的是，Bax公司+/+神经元在BDNF单独存在下无法存活。
最后，NT-4支持这些年龄段较少神经元的反应（～20%）。形态学反应分为NGF-like和NT-3 like两类（数据未显示）。
讨论
BAX的消除使得神经营养素对形态学的调节与神经营养素从感觉神经元发育的早期阶段对存活的调节分离开来。在感觉神经元需要这些分子生存的发育阶段，感觉轴突在良好的基质上生长是基本的，在发育阶段，神经营养素缺乏，而感觉轴突迅速向周围靶点延伸体内早期轴突生长的几个关键特征受到调节，包括第二轴突的延伸、延伸率和束状程度。此外，神经营养素支持不同感觉神经元亚群特征的不同轴突形态的出现。
BAX水平和轴突生长
重要的是，首先要考虑我们的结果在某种程度上可以通过BAX直接参与控制轴突生长的信号转导途径来解释的可能性。事实上，BAX同源物BCL-2水平降低对感觉轴突生长速度的实质性影响在体外已报告(希尔顿等人，1997年). 此外，在泛神经启动子的控制下，过度表达BCL-2的转基因小鼠的视网膜神经节移植体比发育后期的对照组更有力地延伸轴突在体外和体内受伤后(Chen等人，1997年).
BCL-2家族成员与涉及轴突生长的信号转导途径的关系尚待确定(巴德，1997年). 然而，有两个令人信服的理由认为，BAX本身对轴突生长并不重要，这里报道的结果不能归因于BAX的缺失。第一，Bax公司-null小鼠发育相对正常，并在没有行为特征的情况下存活到老年，这表明轴突投射或连接性受到损害。事实上，外周神经和视神经中轴突的直接计数Bax公司−/−小鼠的轴突比正常小鼠更多，而不是更少，如果BAX本身对轴突延长至关重要的话(怀特等人，1998年).
其次，标准浓度的神经营养素在很大程度上逆转了我们在Bax公司-在缺乏神经营养素的情况下培养的DRG神经元为空。值得注意的是，证明BCL-2缺乏对感觉轴突生长的影响的实验是在没有血清的情况下进行的(希尔顿等人，1997年). 在这种降低的条件下，BCL-2水平在非存活功能中可能具有非同寻常的重要性。有趣的是，当BCL-2缺陷小鼠的交感神经节神经元在血清和NGF存在下培养时，交感神经轴突的生长没有明显缺陷(Greenlund等人，1995年).
在缺乏神经营养素的情况下，感觉神经元是单极的
最引人注目的是Bax公司-null小鼠表示，在没有神经营养素的情况下培养时，几乎所有的感觉神经元都是单极的。NGF和NT-3都介导第二个轴突的生长，可能来自不同的神经元群。注意，即使存在神经营养素，感觉神经元也不具有感觉神经元特有的假单极形态体内在这个年龄。以前的一项使用鸟类感觉神经元的研究表明，伪单极形态的发育在体外需要与施万细胞接触(玛奇，1984年)在本文报道的培养条件下，这些细菌数量不多。
虽然很容易推测双极形态的最初发展可能需要神经营养素的刺激体内事实上，通过E11，感觉神经元已经扩展了外周和中枢过程(Ozaki和Snider，1997年)在培养这些神经元的过程中，两者都被切除了。众所周知，成年动物感觉神经元的中央突起在损伤后的生长不如外围突起好(理查森和伊萨，1984年;Richardson和Verge，1986年). 一种有趣的可能性可以解释我们的结果，即轴切断后两个过程的内在生长潜力的差异可能已经存在于发育的早期阶段，并且在神经营养素缺乏的情况下表现得尤为明显。即使在早期发育阶段，中枢和外周过程的生长能力的内在差异也不会令人惊讶，因为外周感觉树化明显比中枢更广泛。这一概念的证明需要为中心过程识别特定的分子标记。
神经营养素对轴突伸长的调节
我们已经证明，神经营养素通过一种与它们对神经元存活的影响分离的机制，能够有力地促进轴突生长。这个问题一直存在争议，因为之前在小鸡身上的研究表明，与存活相适应的最小NGF浓度促进了早期发育阶段轴突的最大生长(斯科特和戴维斯，1993年). 我们在这里展示了这一点Bax公司除非提供了神经营养素，否则在小鼠相当时期培养的−/−感觉神经元只延伸基本轴突。对于从E13开始培养72小时的神经元Bax公司-与有血清但不含特定神经营养素的培养神经元相比，在有NGF的情况下，空白神经元几乎增加了四倍，在有NT-3的情况下增加了3.5倍。重要的是，在没有神经营养因子的情况下，72小时内获得的平均500μm轴突长度小于E16（相当于胚胎期）DRG和远端后肢之间距离的5%体内(考夫曼，1992年). 在E12培养的神经元中，含和不含神经营养素的轴突长度差异更为显著。在较少分离的培养物中观察到的轴突束聚缺陷（如果存在）体内也可能会影响感觉轴突的伸长速度。因此，我们的研究结果与神经营养素家族成员需要支持外周轴突的深度伸长的观点一致，外周轴轴突是远端靶点神经支配和胚胎整体生长的伴随物。
需要强调的是，神经营养素对轴突伸长的影响可能有两种机制，而不是相互排斥的。神经营养素可能通过Ras/MAP激酶途径调节细胞骨架蛋白的mRNA水平和/或磷酸化。这种调节与NGF诱导嗜铬细胞瘤-12细胞的形态分化和突起生长有关(格林和卡普兰，1995年；有关查看信息，请参阅卡普兰和斯蒂芬斯，1994年;西格尔和格林伯格，1996年). 然而，重要的是要指出，对于必须激活以促进初级神经元轴突生长的信号转导途径和遗传程序，人们知之甚少。事实上，初级神经元在缺乏神经营养素的情况下存活的培养系统应该成为探索神经营养素介导形态学效应的信号转导途径的有用工具。
另一种同样合理的轴突生长调节机制与神经营养因子对信使核糖核酸和蛋白质合成的全局影响有关。因此，缺乏NGF的交感神经节细胞将其整体蛋白质合成和许多mRNA水平降低至基线的～10%，类似于此处所示的情况，即神经营养素缺乏后细胞凋亡调节剂可阻止细胞死亡(Deckwerth等人，1998年). 这些发现提出了一种有趣的可能性，即神经营养素对细胞代谢的一般影响在轴突生长的调节中可能与控制细胞骨架蛋白合成的特定信号转导通路的激活同等或更重要。
以前对神经营养素在早期发育过程中对轴突生长的控制的考虑主要集中在短距离的趋化性调节和侧支（有关综述，请参阅Tessier-Lavigne和Placzek，1991年;麦克法兰和霍尔特，1997年). 也许令人惊讶的是，鉴于广泛的兴趣，与趋化性和轴突侧支分支有关的神经营养素的作用仍未明确(Ernfors等人，1994年;O'Leary和Daston，1994年;Schimmang等人，1995年;Fagan等人，1996年;Fritzsch等人，1997年;Wright等人，1997年). 迄今为止的研究尚未确定，因为相关神经元过早死亡或动物在缺乏特定神经营养素家族成员的情况下过早死亡。这个Bax公司null现在提供了一种将神经营养素对存活的调节与神经营养素调节轴突生长分开的方法体内试验。事实上，在小鼠体内BAX和NT-3的双零以及在小鼠体内的BAX和trkA的双零的初步结果表明，感觉神经元存活，但与NT-3或trkA缺乏相关的显著行为表型没有被挽救，这表明可能无法建立外周和/或中枢联系(Snider等人，1997年).
最后，值得注意的是，尽管神经营养素在一生中调节轴突分支，但这些分子对轴突伸长的需求可能在发育上受到限制。事实上，成年动物分离的感觉神经元对NGF的反应具有明显的分支而非伸长（S.I.Lentz和W.D.Snider，未发表的观察结果；另见Smith和Skene，1997年). 此外，成年动物皮肤轴突再生过程中NGF的剥夺体内即使NGF明显介导这些轴突的萌芽，也不会影响再生的时间进程(Diamond等人，1992年). 在成年动物的PNS中，NGF和其他神经营养素与它们作为靶向衍生因子的作用一致，通常会增强与维持轴突口径相关的基因的表达，如神经丝(Verge等人，1990年;Munson等人，1997年)并可能抑制GAP-43和Tα1-α微管蛋白等基因的表达，这些基因通常与成功的轴突再生有关(Gratto and Verge，1996年). 我们的发现提高了这种模式在神经发育早期可能被逆转的可能性。
神经营养素支持不同轴突形态的出现
虽然NGF和NT-3都促进了第二轴突的生长和轴突的伸长，但敏感神经元对各自因素的反应却大不相同。因此，出乎意料的是，NGF促进的伸长率远远大于NT-3，并且只产生局限于轴突末端的适度分支。事实上，NGF似乎抑制了轴突主轴的分支。相反，NT-3支持较少的延伸，但实质上更显著的末端分支。如大量神经元的绘图所示，该效果是稳健的，并且在E13用这两种因子处理的神经元的外观几乎没有重叠。重要的是，E12也出现了这些独特的反应。NT-3对轴突分支的这些显著作用与Erzurumlu及其合作者的发现一致，他们发现NT-3促进三叉神经感觉轴突向脑干的侧支化(Ulupinar和Erzurumlu，1998年). 特征性NT-3分支反应的早期出现表明，沿着NT-3反应神经元的通路存在抑制分子，可能是信号素家族成员，这些抑制分子可能抑制轴突分支(Taniguchi等人，1997年).
BDNF在E12大约相同百分比的神经元中产生了与NT-3相似的形态学反应，这表明在早期发育过程中，对这两个因素作出反应的感觉亚群存在大量重叠。事实上，最近的研究表明，E11处trkB和trkC广泛共存，并且NT-3上表达这两种受体的感觉神经元具有依赖性(Fariñas等人，1998年). 此外，BDNF通过其反应神经元的一个子集沿远端轴突轴诱导大而复杂的跛足。也许令人惊讶的是，鉴于BDNF诱导的明显形态学效应，大多数研究人员都没有发现BDNF支持相当比例的胚胎DRG神经元的存活在体外，以及是否有体内DRG神经元对BDNF的存活要求存在争议（参见Matheson等人，1997年，其中的引用；Silos-Santiago等人，1997年，其中的参考文献）。
这些不同的形态反应可以被解释为神经营养素在形成感觉轴突形态方面具有“指导性”作用的证据。目前的许多证据与这样的观点一致，即整个神经系统特有的轴突和树突形态可能在一定程度上取决于神经营养素表达的局部模式和/或反应神经元trk表达的空间分离(Segal等人，1995年;Neveu和Arenas，1996年;McAllister等人，1997年). 事实上，我们证明NT-3对分支有明显的调节，这可能解释了最近报道的NGF和NT-3转基因过度表达对肌垫三叉神经感觉轴突树状化的不同影响体内(Davis等人，1997年;赖斯等人，1998年；另请参阅ElShamy等人，1996年). 指导作用的概念可以预测，将“错误的”trk转染到特定的感觉亚群中会改变其轴突形态。
然而，这里报告的结果中特别值得注意的是，NGF和NT-3反应神经元几乎可以肯定代表不同的人群。在这种情况下，神经营养素也可能在允许分化早期指定的特征形态出现方面发挥“允许性”作用。因此，除了诱导特定类型的形态反应外，神经营养素还可能调节受体和表面分子的表达，这是细胞骨架组织内在差异得以显现和轴突对局部线索（例如。，塔特尔和奥利里，1998年). 在这种情况下，NT-3依赖性（主要是本体感受性）和NGF依赖性（基本是伤害性）神经元可能具有不同轴突形态的内在能力，可能类似于不同神经元类别之间树突形态的更好特征差异。神经营养素的这种允许作用似乎很可能广泛存在，因为这个在哺乳动物中只有四个已知成员的家族调节整个PNS和CNS的神经元。
脚注
这项工作得到了美国国立卫生研究院NS31768和NS34448（W.D.S.）以及HD27500（S.J.K.）的支持。S.I.L.得到了培训拨款HL07275-18的支持。我们特别感谢J.C.Harding和L.A.Worley提供的专业技术援助。我们还感谢P.Lampe在建立细胞培养物方面提供的建议。
通信地址应为威廉·斯奈德博士，神经病学系神经系统损伤研究中心，邮箱8111，华盛顿大学医学院，660 South Euclid Avenue，St.Louis，MO 63110。
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