利用GABA能中间神经元中表达绿色荧光蛋白的转基因小鼠鉴定新的海马神经元间亚型

摘要

GABA能神经元是哺乳动物大脑中的主要抑制性神经元，由多种不同的神经元亚型组成，根据其在特定脑区的位置、显微解剖特征（包括树突树枝状结构和轴突投射、特定大分子的表达和神经生理特性）进行区分。虽然GABA能神经元间功能的传统观点是执行反馈抑制，但越来越明显的是，这些细胞执行更复杂的功能，这些功能对控制整个大脑活动至关重要。例如，在海马体中，GABA能中间神经元似乎主要参与θ节律的启动和维持，以及γ、尖锐波和快速振荡（综述见Freund和Buzsáki，1996年). 这是通过错综复杂的相互连接的神经元间网络实现的，这些网络由各种GABA能亚型组成，严格调控锥体细胞的活动。

对于大脑的每个主要兴奋途径，似乎都有相关的抑制途径(Buzsáki和Chrobak，1995年). 例如，海马中间神经元的一个亚群，其躯体和树突局限于oriens层（SO），选择性地支配腔隙分子层（SLM）(Lacaille等人，1987年;Lacaille和Williams，1990年;Gulyás等人，1993年a,b条;McBain等人，1994年;Blasco-Ibáñez和Freund，1995年;Sík等人，1995年;哈霍斯和莫迪，1997年;Yanovsky等人，1997年;Alcántara等人，1998年). 因此，这些细胞被称为O-LM细胞（腔隙-分子轴突树突化的孔雀/肺泡中间神经元）。由于SLM是内嗅皮层通过穿孔通路的输入靶点，O-LM细胞被假定控制从内嗅皮质到CA1的信息流。

为了更好地阐明特定的神经元间亚型对正常和病理性脑功能的贡献，在实验中识别特定的亚型并单独进行操作是至关重要的。而使用红外差分干涉对比度（IR-DIC）视频显微镜的膜片钳记录(Dodt和Zieglgänsberger，1990年,1994)极大地扩展了我们对中间神经元特性的理解，尽管如此，许多技术局限性仍继续阻碍着对中间神经元的深入理解。特别是在电生理记录之前，一般无法直观地识别特定的神经元间亚型并对其进行形态学特征描述。

为了促进GABA能神经元的研究，我们创建了转基因小鼠，选择性表达自身荧光蛋白的“增强”衍生物，绿色荧光蛋白（EGFP）(Morise等人，1974年;Prasher等人，1992年;Cormack等人，1996年)在GABA能神经元的亚群中。在其中一个衍生的转基因株系中，EGFP在表达生长抑素（SOM）的海马和新皮质中间神经元亚群中表达；因此，该菌株被命名为GIN，因为G公司FP-表达我抑制的N个欧元。利用这些小鼠，我们鉴定了海马CA1区SLM投射中间神经元的两个先前未鉴定的亚型。

这部作品的一部分以前以抽象形式出现过(Oliva等人。,1998).

材料和方法

材料。PCR参与使用GeneAmp XL试剂盒创建质粒载体（PE Applied Biosystems，加利福尼亚州福斯特市）；PCR用于筛选转基因小鼠塔克DNA聚合酶（普罗米加，威斯康星州麦迪逊）。参与核酸操作的所有其他酶均来自美国联合生物化学公司（Aurora，CO）、Ambion公司（Austin，TX）、Epicentre Technologies公司（Madison，WI）、新英格兰生物实验室（Beverly，MA）或Promega。寡核苷酸由Paul Gardner（芝加哥大学）善意合成。QIAEX II（加利福尼亚州查茨沃斯市齐根）用于转基因DNA的凝胶纯化。所有化学试剂均来自Sigma（密苏里州圣路易斯）、Epicenter Technologies和Ambion。

转基因用于创建转基因小鼠。采用标准分子生物学技术(Sambrook等人，1989年). 如下创建载体pGAD67-EGFP。将两个相同的多重限制性内切酶位点引入载体pGFP-1（Clontech，Palo Alto，CA），一个位于GFP开放阅读框的上游，另一个位于SV40多聚腺苷酸化信号的下游，顺序如下：福斯我，Sfi公司我，Srf公司我，不是我，Sgf公司一、 和活力I.这些位点是通过两轮PCR引入的，随后使用以下引物进行连接：第1轮：5′-CAACACTCACCTATCCGGTCTA-3′；5′-GGCCGCGCGGGCGCGCCGATCGCTTCCAGTTGGAACAAGAGTCCAC-3′；第2轮：5′-CTCAGATCTCGAGCTCAAGCT-3′；5′-GGCCGCGCGGGCGCGCCGCGATCGCTTCCGGTAGCGCTTAGTAATAAC-3′。这产生了载体pGFP-1/MCS II。一只老鼠加德1使用以下引物集，通过PCR获得约2.8 kbp的基因片段：5′-ATCACAGTTTTTGCCTAAAGG-3′；5′-TTGGGTCTCTACGGTTCAAG-3′。结果产品被子克隆到Sma公司载体pGFP-1的I位点。从该合成载体中提取的转基因盒在用生态RI和Mlu公司一、 然后将子克隆到生态RI公司/Mlu公司I消化的pGFP-1/MCS II。然后用消解得到的载体巴姆HI和血红蛋白一、 将携带EGFP的片段亚克隆到其中巴姆HI（高）/血红蛋白I消化的pEGFP-N1载体（Clontech）。最终的载体是pGAD67-EGFP。

转基因小鼠的创建。pGAD67-EGFP用Sfi公司一、 转基因DNA随后凝胶纯化。如前所述，在Paul Overbeek博士（贝勒医学院）的实验室将转基因DNA微注射到近交白化小鼠FVB/N株的单细胞期胚胎中(Hogan等人，1994年).

将方正小鼠培育成野生型FVB小鼠（印第安纳波利斯州哈兰·斯普拉格·道利），得到F₁杂合小鼠随后相互杂交。F类₂并对转基因纯合的随后几代小鼠进行杂交以建立集落。

转基因小鼠的筛选。通过PCR筛选转基因小鼠，方法类似于Busler和Li（1996）简单地说，脚趾夹被放置在一个裂解缓冲区（20米米三盐酸，pH 8.4，50 m米KCl，1米米EDTA、pH 8.0、0.1 mg/ml明胶、0.1%Triton X-100和4 mg/ml蛋白酶K）在55°C下保持3-5小时，然后在96°C下维持10分钟，然后放在冰上，5μl冷裂解液直接用于PCR（100μl反应体积）。每个PCR反应都使用一组转基因特异性引物和一组跨越小鼠内含子15的引物加德1基因(Bu和Tobin，1994年;Szabó等人，1996年;Yanagawa等人，1997年)（用作每个PCR反应的内部阳性对照）。转基因特异性引物组为：5′-ATCGAGTTTTTTGCCCCTAAAGG-3′；5′-CTCTACTGAGCCAGTATGGCTGTACGG-3′。这个加德1基因特异性引物组为：5′-CCCACGCGTGATCACGAGAGAAAGCTAC-3′；5′-CCCACGCGTGTAGAGCTGTCTTGGGAGC-3′。

动物的护理和使用。所有动物的维护和所有使用的手术程序都得到了机构动物护理委员会的批准，并符合国家卫生研究院制定的指南。

动物的未来可用性。转基因GIN小鼠将从杰克森实验室（马萨诸塞州巴尔港）获得。

免疫组织化学和细胞计数。用美托芬麻醉成年纯合小鼠，经心灌注PBS，然后灌注含有4%多聚甲醛/5%蔗糖的磷酸盐缓冲液。取下大脑，将其浸泡在4°C的同一固定剂中过夜，然后将其置于4°C含30%蔗糖的PBS中过夜。然后使用Microm冷冻滑动切片机（HM 400 R型；Carl Zeiss，纽约州桑伍德）制备30和50μm厚的冠状脑切片。

根据制造商的方案，使用M.O.M.试剂盒（PK-2200；Vector Laboratories，Burlingame，CA）和Vectastain Elite ABC试剂盒（包含在M.O.M试剂盒中）对自由漂浮脑切片进行基于二氨基联苯胺（DAB）的免疫组化。抗AFP抗体（AFP-5002；Quantum Biotechnologies，Montreal，Quebec，Canada）（针对绿色荧光蛋白衍生物）以1:2000稀释度使用。最终用0.02%3,3′-二氨基联苯胺四氯化氢/0.04%镍/0.002%H处理切片5-15分钟₂O（运行）₂，安装在载玻片上，风干过夜，并使用DPX中性安装介质（31761-6；威斯康星州密尔沃基市奥尔德里奇）盖玻片。

荧光免疫组化检测如下。在室温下，在含有适当稀释度和0.3%Triton X-100抗体的PBS中培养游离切片过夜（不使用洗涤剂的抗GAD67抗体反应除外）。冲洗切片并将其与第二抗体在PBS中孵育1小时。使用SuperMount永久性水性安装介质（BioGenex Laboratories，San Ramon，CA）冲洗切片并湿安装。分别以1:3000、1:2000和1:400稀释度使用多克隆抗GAD67、抗SOM和单克隆抗NeuN抗体（分别为AB108、AB1752和MAB377；Chemicon、Temecula、CA）。使用多克隆抗mGluR1a抗体（06–310；Upstate Biotechnology，Lake Placid，NY），稀释度为1:100。罗丹明结合二级抗体（111-085-144；Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA）以1:200稀释度使用。

使用Omega Optical Inc.（VT Brattleboro；XF100、XF101、XF52和XF53）和Chroma Technology（VT brattlebolo；61000版本2）的滤光片组，使用Microphot-FXA立式荧光显微镜（德克萨斯州达拉斯市尼康）观察和拍摄切片。随后，使用SprintScan 35幻灯片扫描仪（Polaroid，Cambridge，MA）将照片幻灯片扫描到计算机中。还使用MicroMax 5 MHz冷却数码相机（新泽西州特伦顿市普林斯顿仪器公司）直接获取数字图像。使用Photoshop 5.0（Adobe Systems，San Jose，CA）渲染图像，并使用染料升华打印机（型号MD-1300；Alps Electric，San Jose，CA）进行打印。对于图形​图55和​和6，6，中连续图像平面的部分z（z）-将基于DAB的免疫组织化学处理切片的轴蒙太奇在一起，以最大限度地增加焦点信息量；用于图形​图9，9使用SprintScan 35玻片扫描仪（Polaroid）直接获得冠状断面扫描。随后，数字图像​图5，5,​,6,6，以及​和99数字反转以增强对比度。除非另有规定，否则所有图像均来自50μm厚的切片。

在单独的窗口中打开

图5。

O-LM细胞形态特征。一，一种O-LM细胞，其胞体靠近肺泡。该中间神经元是位于这部分地层的典型的O-LM细胞，具有椭圆形的胞体和水平排列的树突。b条典型的O-LM细胞，其胞体位于SP附近。这种O-LM电池产生初级树突，最初向肺泡放射状突出，但在进入SO的远端后，会转向水平突出，平行于层边界。注意，可以看到该细胞的初始轴突段(箭头)遍历SP。c、，d日，高倍图像显示了O-LM细胞典型的细树枝状特征。c（c）和O-LM细胞一样，初级树突(大箭头)通常又大又光滑。从二级枝开始，树突通常变得更薄，并出现许多静脉曲张(箭头). 这种形态将在树突树的其余部分持续存在。d日，许多（但不是全部）O-LM细胞稀疏到中等棘。通常，脊椎(箭头)仅在O-LM细胞的最远端树突状节段发现，通常在末端分支上，如这里的情况。轴突起始段可见于c（c）(小箭头). Strata缩写与图中相同​图2。2。比例尺：一,b条，40微米；c（c），20微米；d日，10微米。

在单独的窗口中打开

图6。

R-LM和P-LM细胞的形态学特征。一，R-LM电池。正如这种神经元间亚型的典型特征一样，这种R-LM细胞有一个金字塔形的体细胞，其中有三个初级树突。该细胞也有相对光滑的初级树突(大箭头)在第一次树枝状分支之后，它变得非常曲张(箭头). 轴突起始段也可以从一级树突中看到(小箭头).b条，P-LM电池。请注意，轴突从一级树突发出，并向SLM投射。c（c）、R-LM和P-LM细胞树突通常不进入SLM。本例显示了在SR-SLM边界处突然远离SLM的R-LM细胞树突。在这种情况下，枝晶没有进入SLM。在许多其他情况下，树突会在返回之前进入SLM的最近端部分。对于所有三个图像，SO在上面，SLM在下面。Strata缩写与图中相同​图2。2。比例尺：a–c，40微米。

在单独的窗口中打开

图9。

成年GIN小鼠脑冠状切片中EGFP的表达。一，对EGFP进行50微米厚切片免疫组织化学处理。请注意，图像是数字反转的，以增强对比度。b条，面板中大脑部分的痕迹一其中EGFP表达的躯体显示为黑色圆点注意，EGFP表达神经元在新皮质不同区域的分布相对均匀，中脑完全缺乏表达。比例尺，1 mm。

进行细胞计数以确定EGFP与GABA能细胞标记物在不同海马区域的共定位。在缰连合第一次出现的位置，选择海马背中部的冠状切片，其尾侧为0–0.4 mm。在四只小鼠的三个切片上对SOM-和mGluR1a-免疫反应神经元进行计数；对来自两只小鼠中的每只的四个切片进行GAD67的计数。对于每只小鼠，EGFP表达细胞的总数及其与免疫反应细胞的共定位是通过计算每组海马亚区切片的计数来确定的；对于抗SOM和抗GAD67免疫反应，还测定了免疫荧光细胞总数。数据以直接百分比或平均百分比±标准偏差的形式呈现，使用人口加权统计数据计算(Wonnacott和Wonnacot，1984年)，用于所有小鼠的综合数据。

神经清醒重建。如上所述，使用抗AFP抗体对来自成年小鼠的冠状脑切片的连续切片进行基于DAB的免疫组织化学。然后使用Neurolucida软件包和Lucivid显示硬件（MicroBrightField、Colchester、VT）进行三维神经元重建。对于图中描述的神经元​图4，4，对树突状树进行整体重建。

在单独的窗口中打开

图4。

表达EGFP的O-LM、R-LM和P-LM细胞的神经清醒重建，说明其完整性体内树突结构和轴突神经支配模式。采用基于DAB的免疫组织化学方法对EGFP进行免疫组织化学处理的连续脑切片进行重建。枝晶是绿色，轴突是红色，和somata是蓝色.一，O-LM细胞的重建。该细胞的树突局限于SO，并产生一个轴突，该轴突主要无分叉地穿过SLM，并在那里分支。注意，该细胞在SO中产生局部轴突侧支。该O-LM细胞的完全重建树突树在隔颞轴延伸至~350μm，在内侧方向延伸至~450μm。b条，重建R-LM细胞。该细胞在SR中有体细胞，并产生轴突，在SLM中显著分支。这种神经元间亚型具有跨越SO到SR的树突，但很少进入SLM。注意，其中一个树枝状突起似乎深入SLM；这是一种误传，归因于三维重建被展平为二维，其中层流边界无法正确保留。该R-LM细胞的树突树在隔颞轴延伸至～400μm，在中外侧延伸至～850μm。c（c），P-LM细胞的重建。该细胞在SP中有体细胞，并产生一个在SLM中分支的轴突。与R-LM细胞一样，这种神经元间亚型具有跨越SO到SR的树突，除了最接近的部分外，树突往往避开SLM的所有部分。该P-LM细胞的树突树在隔颞轴延伸至~350μm，在内侧方向延伸至~400μm。所有重建均来自成年GIN小鼠。请注意，只有部分轴突重建是可能的：轴突在进入SLM后只能被短距离追踪，因为它们被其他表达EGFP的轴突的高密度所掩盖。嵌入式显示每个重建中间神经元的海马位置。Strata缩写与图中相同​图2。2。比例尺：a–c，100μm。

体外切片：视频显微镜和神经生理记录。用美托芬麻醉出生后第10-14天的小鼠，并使用752M型振动切片机（英国拉夫堡Sileby Campden Instruments）在冰镇解剖液中切片250至300μm厚的横向脑片。将切片转移到包含室温解剖和记录溶液等量混合物的保存室中至少1小时。对于光学成像和电生理记录，根据需要将切片转移至记录室，该记录室连续灌注室温记录溶液。解剖溶液包括（单位：m米）：60.0氯化钠，3.0氯化钾，7.0氯化镁₂，1.25 NaH₂人事军官₄，0.5氯化钙₂，25.0氯化钠_三、110.0蔗糖和7.0葡萄糖。记录溶液包括（单位：m米）：125.0氯化钠，2.5氯化钾，1.0氯化镁₂，1.25 NaH₂人事军官₄，25.0氯化钠_三，2.0氯化钙₂和25.0葡萄糖。所有溶液都用95%的O连续鼓泡₂和5%CO₂.

使用火焰抛光的硼硅酸盐玻璃电极（6–12 MΩ）进行全电池接线灯记录。电极填充（单位：m米）：120公里⁺d日-葡萄糖酸、20 KCl、10 EGTA、10 HEPES和2 MgCl₂pH值7.3–7.4。

Axioskop垂直显微镜（卡尔蔡司）配备了MicroMax 5 MHz冷却数码相机（普林斯顿仪器），用于外荧光和IR-DIC视频显微镜，MTI NC-70CX红外敏感相机（印第安纳州密歇根市Dage-MTI）用于IR-DIC显微镜。该显微镜还配备了MAC 2000型聚焦驱动器（Ludl Electronics Products，Hawthorne，NY）、Lambda 10-2滤光片轮（Sutter Instruments，Novato，CA）和用于外荧光照明的光纤液体光导管（Carl Zeiss；417087）。用于外荧光的GFP滤波器组（XF100）和用于IR-DIC视频显微镜的红外带通滤波器（780-DF32）来自Omega Optical。EGFP表达的中间神经元首次通过荧光显微镜鉴定。随后，使用IR-DIC视频显微镜获得全细胞补丁灯记录。为了确保在切换到IR-DIC显微镜时，通过荧光显微镜选择的每个神经元都可以很容易地被识别，两种形式的成像都使用了相同的数码相机，这避免了两组图像的错位。如果选定的EGFP表达中间神经元位于其他神经元密集聚集的区域[例如金字塔层（SP）]，荧光图像和IR-DIC图像之间的简单对齐不足以在IR-DIC视频显微镜下明确识别合适的神经元。在这种情况下，将由长程二向色镜和长程发射滤波器（分别为510DRLP和510LP；Omega Optical）组成的滤波器组放置在光学路径中，以便通过荧光和红外-DIC视频显微镜在同一台相机上同时显示所选神经元。在完成全细胞记录后，使用荧光显微镜确认每个贴片神经元确实是表达EGFP的感兴趣中间神经元。

使用MetaMorph成像系统（Universal Imaging，West Chester，PA）完成数字图像采集。在进行斑贴灯记录之前，在0.5–1.0μm z间距下采集一系列连续的光学切片。记录后，使用AutoDeblur软件包（纽约州沃特弗利特的AutoQuant Imaging）对数字图像集进行反褶积，随后生成最大投影图像。基于以下参数，使用宽场外荧光显微镜的理论点扩散函数进行迭代反褶积：物镜的数值孔径；荧光发射波长510nm；折射率为1.33；计算的dx公司和第y天用测微计测量的相邻像素之间的间距；和校准的第纳尔相邻焦平面之间的间距。对于一些神经元，将整个图像集作为一个整体进行反褶积；对于其他神经元，对每个图像序列的子部分进行去卷积，从中生成最大投影图像，然后蒙太奇以产生完整的去卷积图像。

结果

EGFP表达转基因小鼠的建立：使用加德1基因序列

EGFP公司(Cormack等人，1996年)是绿色荧光蛋白的“增强型”版本，具有～35×克与野生型蛋白质相比，荧光更强，密码子偏向更适合哺乳动物的表达。将EGFP表达赋予转基因小鼠中GABA能中间神经元，小鼠的上游调控序列加德1基因(Szabó等人，1996年)用于控制EGFP表达（图。​（图1）。1). 进行了52次转基因DNA原核注射，结果产生了9只携带转基因的创始小鼠。其中，有三种通过了转基因，其中每种系的小鼠在不同的GABA能神经元亚群中一致表达EGFP。

在单独的窗口中打开

图1。

用于制造GIN小鼠的转基因。约2.8 kbp小鼠加德1将基因序列亚克隆到EGFP编码序列的上游。The portion of the加德1所用基因由～1.2 kbp的上游调控序列组成(mGad1型^乌尔;灰色方框)5′到主要转录起始位点(箭头)，整个第一（和非编码）外显子(黑匣子)和内含子（倒置“V（V）“）和第二外显子的一部分(黑匣子)距离加德1翻译开始站点。因此，转基因并不编码EGFP融合蛋白产物。EGFP编码区，大条纹箭头SV40多聚腺苷化位点；白色方框.

在这些创始人之一的后代中，EGFP在海马体和大脑皮层的中间神经元中表达强烈。因此，该行被命名为GIN，因为G公司FP-表达我抑制性的N个欧元。GIN转基因小鼠在杂合或纯合状态下均未表现出明显的生理或行为异常。杂合子和纯合子杂交的产仔量均为7至13只幼崽，与野生型杂交的产卵量一致。雌性每3.5-4周产仔一次，幼崽死亡率很低。

EGFP在GIN转基因株系中的表达

在GIN小鼠的中枢神经系统中发现EGFP表达神经元。最主要的是那些在大脑皮层和新皮层中发现的（图。​（图2；2; 参见图。​图8，8,​，9）。9). 在中脑、脑干和脊髓中也发现EGFP表达神经元。其中最显著的是耳蜗背侧核和腹侧核、前庭核、外侧丘系核、中脑导水管周围灰质核、丘脑网状核的不同区域、唾液下核、舌下前核、X核、，以及贯穿脊髓背角全长的EGFP表达神经元的密集网络。一般来说，中脑和脑干EGFP表达神经元的数量远低于海马、新皮质和脊髓对应神经元。小脑和纹状体以及下丘脑也明显缺乏EGFP的表达，这两个区域都密集分布着GABA能神经元。

在单独的窗口中打开

图2。

GIN小鼠海马中EGFP的表达模式。一蒙太奇是成年背海马EGFP表达模式的例证，该模式是由纯合子小鼠50μm厚切片的重叠显微照片创建的。星号表示CA3区SLM中表达EGFP轴突终末的神经丛。b条——d日，中各字母表示的区域的高倍图像a.乙，CA3区SO中的细胞。c（c），来自CA1区SO的细胞，其中一个显示经典的O-LM细胞型形态(箭头).d日，来自CA1区SR的细胞，具有长锥形树突。e（电子），EGFP表达细胞位于门CA3边界附近的齿状回门。f、 克对神经元特异性核蛋白NeuN进行免疫组织化学处理的切片显示，EGFP在成人海马CA3区的表达。（f），仅EGFP表达可视化。克，使用双过滤器集同时可视化EGFP和NeuN表达。所有表达EGFP的细胞共表达NeuN，如亮黄色细胞核位于身体中央。需要注意的是，当使用GFP滤波器组进行查看时，NeuN信号显示出一些漏气现象（将SP与一具有（f）). Strata缩写：A类，阿尔维斯；SO公司，层位；服务提供商，金字塔状地层；SR公司，辐射层；SLM公司，腔隙分子层；性虐待，分子层；新加坡，颗粒层；H（H）齿状回门；SL公司，透明层。比例尺：一，200微米；e（电子），50μm（用于b–e（电子）);克，100μm（用于（f）和克).

在单独的窗口中打开

图8。

成年GIN小鼠新皮质EGFP表达细胞的特征。一，显示桶场皮层EGFP模式的显微照片。这种表达模式是所有新皮质区的典型表现。b、，c（c），通过对神经元特异性核蛋白NeuN进行30μm厚的免疫组织化学处理，在初级体感皮层中显示了EGFP表达的层特异性。EGFP表达的可视化(b条)或同时可视化EGFP和NeuN表达(c（c）)使用双过滤器组。EGFP表达的躯体主要局限于第II-IV层和上层V。注意，EGFP表示的神经元完全出现黄色的而不仅仅是细胞核，这是显微摄影过程中周围NeuN信号高密度的结果（与图。​图22克). 还应注意，使用EGFP滤波器（比较一，未为NeuN处理，具有b条.)d日，表示区域的高倍视图小写d面板内b条。单元格由箭头具有许多新皮质EGFP表达中间神经元常见的放射状双极形态。e（电子），来自听觉皮层的表达EGFP的中间神经元的高倍放大图，举例说明表达EGFP的中间神经元的另一亚型。该亚型的中间神经元有一个位于上层II的金字塔形胞体，有两个显著的下降一级树突，覆盖在层III中，但没有显著的上升树突。此子类型的另一个单元格位于面板的左上角a、f，小尺寸表示的区域的高倍视图（f）面板内一.躯体由大箭头有一个突出的水平运行的树突(小箭头)，并例证了新皮质EGFP表达中间神经元的第三个亚型。克，梨状皮层表达EGFP的中间神经元进一步说明了所发现的形态多样性。h–j小时，新皮质EGFP表达的中间神经元与生长抑素共存。小时EGFP在次级视皮层的表达。我，SOM表达式与面板中的相同部分h、i，使用双过滤器集同时可视化EGFP和SOM表达式。注意，每个表达EGFP的中间神经元都共同表达SOM。所有显微照片的方向应确保第一层在上面，第六层在下面，层流边界基本上与页面顶部平行。层表示为罗马数字.箭头在里面b、 c（c）和h–j小时表示每个图像集的相同单元格。比例尺：a、 c、j，100微米；d–g，50微米。

EGFP在所有脑区的表达神经元的细胞质中自由扩散。在固定和活体制剂中，绝大多数EGFP表达神经元都具有非常强的荧光，使得树突很容易被观察到并可追踪到其末端。在某些情况下，轴突也可以被观察到，并从它们的母体上追踪数百微米。许多EGFP表达的神经元也被发现稀疏到中等棘，特别是在新皮质。

EGFP在GIN中的表达模式已经持续了五代以上。杂合与纯合小鼠以及雄性与雌性小鼠的荧光强度或EGFP表达神经元的数量几乎没有差异。发现大约在出生后第5天开始诱导海马和皮层EGFP表达。EGFP表达的这种发育开始时间上与GABA能中间神经元的终末分化和描绘成熟GABA能神经元亚群的许多大分子（例如生长抑素）的表达开始时间一致(Naus等人，1988年;Bergmann等人，1991年;江和斯旺，1997).

海马EGFP表达细胞是生长抑素表达的GABA能中间神经元

为了确定GIN小鼠海马EGFP表达神经元的身份，对大量GABA能中间神经元标记物进行了荧光免疫组化。

鉴于根据其层流分布，海马EGFP表达细胞明显是中间神经元，对GAD67进行荧光免疫组化以证实这一点（图。​（图3三a–c). 超过99%的海马EGFP表达神经元共表达GAD67（268个EGFP阳性细胞中的267个）。当合并SO、SP和SR的计数时，发现所有海马GABA能神经元中的约7和22%分别在CA1和CA3区表达EGFP；在齿状回门，约10%的GABA能中间神经元表达EGFP。简而言之，GIN转基因小鼠的海马EGFP表达细胞是GABA能中间神经元的一个亚群。

在单独的窗口中打开

图3。

GIN成年小鼠海马EGFP表达细胞的免疫组织化学特征。一——c（c），EGFP表达细胞共同表达GAD67。一，EGFP在CA3区表达。b条，GAD67表达式位于与中相同的节中a.c，节与相同一和b条其中EGFP和GAD67的表达使用双过滤器集同时观察。请注意，每个EGFP表达细胞都同时表达GAD67，并且出现了两种蛋白的共表达黄色的使用双滤光片组。d日——我，EGFP表达的中间神经元共同压迫生长抑素。d日，EGFP在CA3区表达。e（电子），SOM表达式位于与中相同的节中d、f、EGFP和SOM表达式使用双过滤器集同时查看。请注意，每个表达EGFP的中间神经元共同表达SOM。克——我，神经元的高倍视图，由箱在里面d日该神经元的形态与CA3 O-LM细胞一致。j个——我CA1区SO中EGFP和SOM的表达。j个，EGFP表达的SO中间神经元为SOM阳性，并显示CA1区O-LM细胞的形态学特征(大箭头).小箭头表示一种EGFP表达的体细胞，对SOM呈弱免疫阳性。米——o个，EGFP表达的中间神经元共同表达mGluR1a。米，CA1区SO中的一个EGFP表达O-LM细胞。n个，mGluR1a在月，EGFP和mGluR1a表达的同时可视化。注意这个神经元轴突的起始段(米,箭头)mGluR1a表达为阴性。虽然只有它的起始段位于显微照片的焦平面上，但这个轴突可以通过SP和SR到达SLM，并在那里分支；该过程对mGluR1a在其整个长度上的表达是阴性的。Strata缩写与图中相同​图2。2.箭头在面板中a–（f）表示每个图像集的相同单元格。比例尺：c、，我，50微米；（f），100微米；i、 o个，20微米。

如上所述，GIN小鼠CA1区海马EGFP表达中间神经元的一个显著特征是其常为卵形的躯体定位于SO，树突平行于地层边界（图。​（图22a、 c（c）,箭头). 这种形态是O-LM细胞的特征。在CA3区，O-LM细胞通常具有锥体状胞体，树突横跨除SLM外的所有层(Gulyás等人，1993年a,b条)；因此，CA3区SO中EGFP表达中间神经元的形态（图。​（图22b条,箭头)也与O-LM细胞相一致。许多研究表明，所有O-LM细胞都表达神经肽SOM，海马体中SOM的表达定义了GABA能中间神经元的一个子集(科勒和Chan-Palay，1982年;莫里森等人，1982年;Johansson等人，1984年;Sloviter和Nilaver，1987年;Kosaka等人，1988年;Kunkel和Schwartzkroin，1988年;米尔纳和培根，1989年;Esclapez和Houser，1995年). 如图所示​图3三d–l日荧光免疫组化显示，表达EGFP和SOM的海马中间神经元之间存在显著重叠。在CA3区域的全景图像中（图。​（图3三d–f日)发现每个表达EGFP的中间神经元都与SOM共存。这种共表达在高倍视图中很容易观察到（图。​（图3三g-i公司)来自SO的细胞（图。​（图3d，三d、 盒子). 图​图3三j–l显示了CA1区SO中EGFP和SOM表达的明显重叠。注意O-LM细胞样形态(大箭头)；还注意到表达EGFP的中间神经元对SOM的免疫阳性非常弱(小箭头). EGFP和SOM表达神经元重叠的细胞计数结果详见表​表1。1平均95.13±2.33%(n个=707）GIN小鼠海马EGFP表达神经元共表达SOM。共表达EGFP的表达SOM的海马中间神经元的总比例从～15%（门和CA1 SO）到～35%（CA3 SO）不等。因此，GIN小鼠中EGFP表达的海马中间神经元定义了SOM表达中间神经元的子集。

表1。

EGFP与SOM和mGluR1a在海马中间神经元中的共表达

	表达SOM的EGFP中间神经元（%）	表达EGFP的SOM中间神经元（%）	表达mGluR1a的EGFP中间神经元（%）
大约1个	97.70  ± 2.34 (n个 = 87)	16.16  ± 2.91 (n个 = 526)	100  (n个 = 110)
CA1 SP/SR	90.48  ± 5.79 (n个 = 21)	21.58  ± 13.74 (n个 = 88)	100  (n个 = 31)
CA3 SO公司	96.41  ± 1.80 (n个 = 306)	37.67  ± 0.63 (n个 = 784)	100  (n个=551）
CA3 SP/SR	92.57  ± 3.20 (n个 = 202)	27.99  ± 1.68 (n个 = 668)	100  (n个=253）
希卢斯	95.12  ± 1.35 (n个 = 91)	16.05  ± 4.41 (n个 = 536)	100  (n个 = 90)

在单独的窗口中打开

结果显示为平均值±标准偏差。细胞计数为体细胞，发现于初级层（SO）、锥体层和放射层（SP/SR）以及齿状回门（hilus）。

先前的研究表明，大鼠海马中每一个SOM表达神经元都与代谢型谷氨酸受体1（mGluR1a）的“a”剪接形式共存，其相关性为1:1(Martin等人，1992年;Baude等人，1993年;Görcs等人，1993年;Blasco-Ibáñez和Freund，1995年;Kerner等人，1997年). 因此，对mGluR1a进行荧光免疫组化。结果表明，每个海马EGFP表达的中间神经元共同表达该受体亚单位（表​（表1）。1). 图​图3三百万美元示例了CA1区O-LM细胞中的这种共表达。在该细胞中，mGluR1a在体细胞和树突上被强烈标记；相反，来自躯体中心的轴突（图。​（图3三j个,箭头)整个长度的mGluR1a表达为阴性。轴突穿过SO和SP，主要垂直于地层边界运行，仅在到达SLM时才分支。定量共表达mGluR1a的EGFP表达细胞的总数是困难的，因为在每个体细胞中都没有观察到mGluR1a的强烈荧光免疫反应；然而，mGluR1a和EGFP共表达的树突可以追溯到所检测的每一个EGFP表达体。此外，我们没有观察到任何EGFP表达的树突缺乏mGluR1a免疫反应性。因此，GIN小鼠中表达EGFP的海马中间神经元与mGluR1a共存。这进一步支持了GIN小鼠海马EGFP表达细胞是SOM表达中间神经元的结论。

根据其他神经化学标记物的共表达，海马中表达SOM的中间神经元可分为若干亚型。在大鼠中，研究表明，SO（即O-LM细胞）中约32%的所有SOM-表达中间神经元共同表达钙结合蛋白钙结合蛋白（CB），并且这些O-LM电池向海马外投射(Tóth和Freund，1992年;托特等人，1993年;Katona等人，1996年). 此外，研究表明，在CA1区所有神经肽Y（NPY）表达的中间神经元中，约40–60%对应于O-LM细胞(科勒等人，1987年). 荧光免疫组化显示，GIN小鼠绝大多数EGFP表达的海马中间神经元既不表达CB也不表达NPY。尽管这些结果可能会反驳GIN小鼠海马外投射EGFP表达的O-LM细胞的存在，但在穹窿中仍发现EGFP阳性轴突，而Broca复合体内侧隔斜带似乎没有EGFP阴性躯体。再加上CB表达在小鼠和大鼠之间显著不同的事实（M.Jiang和J.Swann，个人通讯），GIN小鼠中表达海马EGFP的O-LM细胞可能确实向海马外投射。另外两种钙结合蛋白，即小白蛋白（PV）和钙视网膜蛋白（CR）的荧光免疫组化也显示出与EGFP缺乏共表达。

总之，GIN转基因小鼠中表达EGFP的海马中间神经元的表型特征为：SOM（+）、mGluR1a（+），GAD67（+）；NPY（−），CB（−。

表达EGFP的海马中间神经元的神经生理学特性

进行全细胞斑贴灯研究，以确定急性制备的海马EGFP表达中间神经元的神经生理学特性在体外大脑切片。图​图77一描绘了R-LM细胞的去卷积图像集的最大投影图像，从中获得了神经生理学记录。在这个例子中，R-LM细胞有两个主要的一级树枝状突起，向SO方向延伸。其中一个一级树枝形突起分叉成两个大小大致相等的主要分枝，继续向SO延伸，而SR中没有进一步的分枝。相比之下，另一个一次树枝状突触在SR中产生了许多更高阶的分枝，以及一个主要面向SO的无分歧分支。

在单独的窗口中打开

图7。

目测确定的海马EGFP表达中间神经元的神经生理特性。一，R-LM细胞的去卷积图像集的最大投影图像，揭示了该中间神经元的广泛树突树枝状结构。图像集由50张在1.0μm下拍摄的图像组成z（z）-轴间距。进行了100次反褶积迭代，生成了最大投影图像，如图所示。b条，R-LM电池的响应一去极化电流注入（0.05–0.15 nA，0.05 nA增量）。当方波去极化电流阶跃随着去极化的增加而增加时，动作电位序列被激发出来。与表达EGFP的中间神经元的典型情况一样，该神经元几乎没有表现出尖峰频率适应（调节）。c（c），R-LM细胞对方波超极化电流注入的响应（−0.20至−0.05 nA，0.05 nA增量）。注意这种神经元间细胞类型典型的时间依赖性内向整流（去极化“sag”）。d日，O-LM单元图像集的记录后反褶积。图像集由70张在1.0μm下拍摄的图像组成z（z）-轴间距。对图像的子部分进行100次迭代的反褶积，从中生成最大投影图像，然后将其拼接在一起以生成完整的图像。e（电子），在EGFP表达的O-LM细胞中激发动作电位序列，以响应方波去极化电流阶跃（0.03–0.09 nA，0.03 nA增量）。表达EGFP的O-LM细胞几乎没有调节能力。（f），O-LM电池对超极化电流阶跃的响应（−0.12至−0.03 nA，0.03nA增量）。作为对超极化电流阶跃的响应，O-LM细胞通常表现出去极化“凹陷”。比例尺：一，20微米；d日，40微米。输入电阻：b条，150 MΩ；c（c），300兆欧；e、 （f），550兆欧。静息膜电位：b条，−69毫伏；c（c），-67毫伏；e（电子）,（f），−59 mV。校准：200 msec，20 mV（如所示c（c）对于b条,c（c）;e（电子）对于e（电子）,（f）). 所有记录均在室温下进行。

全细胞记录显示，海马EGFP表达的R-LM细胞具有快速尖峰中间神经元的典型特性：表达EGFP R-LM的细胞的自发动作电位(n个=5）显示出快速的尖峰复极率（半峰宽<1.2毫秒，在室温下进行记录）和显著的大后超极化（−5至−10毫伏）。作为对方波去极化电流阶跃的响应，动作电位序列被激发出来，显示出很少（如果有的话）的尖峰频率适应（调节）（图。​（图77b条). 这些动作电位序列随着去极化的增加而增加，它们代表了从其他EGFP表达细胞观察到的反应。作为对超极化电流阶跃的响应，所有五个R-LM细胞都表现出与时间相关的向内整流（去极化“sag”），随着超极化程度的增加而变得更加突出（图。​（图77c（c）). 偶尔，在超极化步骤结束时会引发反弹动作电位（数据未显示）。

从表达EGFP的O-LM细胞的记录显示出与R-LM细胞非常相似的神经生理学特性，并且与先前的观察结果一致。图​图77d日显示了来自进行记录的背侧海马CA1区的O-LM细胞的去卷积图像。正如预期的那样，EGFP表达O-LM细胞(n个=6）为快速尖峰，并表现出不适应方波去极化电流阶跃的动作电位序列（图。​（图77e（电子）). 作为对超极化方波电流阶跃的响应，O-LM细胞（六分之四）通常表现出去极化凹陷（图。​（图77（f）)与R-LM细胞的情况非常相似。这种矫正以前曾被报道为O-LM细胞的一种独特的神经生理学特征(McBain等人，1994年;Sík等人，1995年).

除了上述特性外，我们没有发现R-LM和O-LM细胞中记录的自发突触电位速率有任何差异。在我们的实验条件下，这两种细胞在静息膜电位下也自发放电。总的来说，我们没有观察到任何使R-LM细胞容易与O-LM细胞区分开来的电生理特性。

讨论

为了促进对中枢神经系统GABA能神经元的研究，我们培育了转基因小鼠，这些转基因小鼠在GABA能神经细胞的不同亚群中选择性地持续表达EGFP。小鼠上游调节区加德1编码67 kDa形式的GABA合成蛋白谷氨酸脱羧酶（GAD67）的基因被选为驱动EGFP表达的基因，因为该基因似乎在GABA能神经元中普遍表达。一个相对较小的片段加德1使用基因，期望这样一个小片段将赋予转基因表达GABA能特异性，同时允许转基因的时间和空间表达受转基因整合到小鼠基因组中的位点控制，即位置效应。在之前的研究中LacZ公司作为一名记者，我们发现加德1该基因足以限制转基因小鼠中GABA能中间神经元的转基因表达，LacZ公司表达似乎确实受到位置效应的支配（A.Oliva、M.Jiang、P.Overbeek和J.Swann，未发表的结果）。在创建EGFP表达的小鼠时，我们推断，由于没有创建融合蛋白，EGFP应该在表达神经元的细胞质中自由扩散，不仅填充躯体，还填充树突和轴突。然而，如果所有中间神经元都表达EGFP，那么可视化单个细胞的微观解剖特征可能是不可能的，因为感兴趣的过程会被过多的其他EGFP表达过程所掩盖。为了避免这种潜在的限制加德1基因片段被利用：我们预计EGFP的表达将局限于每个衍生转基因株中GABA能神经元的不同亚群。当检查GIN小鼠的CA3区时，这种方法的优点是显而易见的：虽然SO、SP和SR表达EGFP的中间神经元总数只有～20%，但含有EGFP过程的密度几乎使神经膜饱和。

通过使特定的神经元间亚型易于识别，转基因小鼠的GIN和未来类似品系应被证明是研究GABA能神经元的有力工具。例如，GIN小鼠应促进对先前表征的中间神经元亚型（例如O-LM细胞）以及表征不太好或先前未研究的中间神经元亚型（例如R-LM和P-LM细胞）、在新皮层上层表达SOM的中间神经元的高度详细研究，以及中脑、脑干和脊髓中EGFP表达细胞。GIN小鼠也应被证明在癫痫研究中有用(斯洛文特，1987,1991;Sloviter和Nilaver，1987年,Sloviter和Lowenstein，1992年)、创伤性脑损伤(Lowenstein等人，1992年)和阿尔茨海默病(Davies等人，1980年;Roberts等人，1985年;比塞特，1997年;Grouselle等人，1998年;Van Uden等人，1999年)，表达SOM的中间神经元似乎具有选择性脆弱性的疾病。

R-LM和P-LM细胞：“输入性”中间神经元

基于它们的共同特征，R-LM、P-LM和O-LM细胞可被视为更广泛类型的SLM投射中间神经元的特殊亚型。因此，这些中间神经元的主要功能似乎是通过穿孔通路调节从内嗅皮层到CA1区的信息流。由于R-LM和P-LM细胞在SR中有树突，这些中间神经元很可能从CA3 Schaffer侧支接受兴奋性输入（图。​（图10）。10). 由于该输入是来自CA3的单突触，因此SLM中对CA1锥体细胞远端树突的抑制可能被证明在控制信息流方面是稳健的（见下文）。CA1锥体细胞对SO中树突的反复激发可能会进一步增强这种抑制的强度；但由于相对SO而言，R-LM和P-LM细胞树突状突起在SR中更为普遍，Schaffer侧支输入似乎支配着这些中间神经元的整体活动。

在单独的窗口中打开

图10。

提出了涉及R-LM和P-LM细胞的前馈抑制模型。夏弗抵押品(联合国安全理事会)同时刺激R-LM和P-LM细胞以及CA1锥体细胞(个人计算机). R-LM和P-LM细胞的兴奋导致SLM中锥体细胞远端树突发生抑制。这种抑制的作用是通过减弱穿孔通路选择性地隔离从内嗅皮层到CA1的信息流(聚丙烯)CA1锥体细胞远端树突上的突触。因此，在这个模型中，R-LM和P-LM细胞促进并隔离从CA3到CA1的信息流，从而充当“输入-偏置”中间神经元。

由于树突的层流限制，与R-LM和P-LM细胞相比，O-LM细胞应该接受更少的直接Schaffer侧支输入。相反，这些细胞被局部CA1锥体细胞直接激活(Lacaille等人，1987年;Blasco-Ibáñez和Freund，1995年). CA1锥体细胞的突触兴奋和自发放电随后会刺激O-LM细胞，这反过来会抑制SLM中的锥体细胞远端树突。因此，O-LM细胞会通过多种来源的CA1锥体细胞激活抑制内嗅输入。O-LM细胞可能接受Schaffer侧支输入，因为这些纤维的一部分穿透SO。然而，来自局部CA1锥体细胞的输入纤维的普遍性似乎支配了这些中间神经元的活动。简而言之，根据条件，R-LM、P-LM和O-LM电池可能执行并行功能；然而，这些细胞上突触输入的重量表明，R-LM和P-LM细胞与O-LM细胞的主要功能不同。

那么R-LM和P-LM细胞在CA1网络中的功能可能是什么呢？从它们的形态来看，这些神经元间亚型可能通过选择性地过滤从内嗅皮层进入CA1的信息来隔离从CA3流向CA1的信号。这种过滤可以通过以下一种或两种机制来完成。最明显的是GABA_A类CA1锥体细胞远端树突中这些中间神经元产生的受体介导的IPSP将导致分流，从而减弱来自穿孔通路输入的EPSP。这些中间神经元也可能限制钙²⁺CA1锥体细胞远端树突内流的反向传播动作电位(Traub等人，1994年;克里斯蒂等人，1995年;Magee和Johnston，1995年,1997;Miles等人，1996年;Markram等人，1997年;Parra等人，1998年). 在这种情况下，对R-LM和P-LM细胞的Schaffer侧支兴奋将在CA1锥体细胞远端树突上产生IPSP，这可能与Schaffer-侧支兴奋CA1锥骨细胞诱导的反向传播动作电位在时间上一致。因此，这些中间神经元亚型的激活可能起到防止在CA1锥体细胞的穿孔通路输入中发生Hebbian样突触可塑性的作用，同时允许在Schaffer侧支输入中发生符合检测。

无论使用何种机制，选择性调节特定通路的突触效能的能力可能会对海马神经网络中的信息流产生重大影响，并可能对记忆的形成和巩固产生重大影响。本质上，R-LM和P-LM细胞可能充当“输入-偏置”中间神经元。

脚注

参考文献