白细胞介素-1β对长时程增强的抑制作用与应激激活蛋白激酶活性的增加有关

摘要

与海马中IL-1受体的高表达一致(Lechan等人，1990年;Ban等人，1991年;Parnet等人，1994年)观察到外源性IL-1在该脑区的几种作用。例如，IL-1β对（1）CA1的长时程增强（LTP）产生抑制作用(Bellinger等人，1993年)，CA3(Katsuki等人，1990年)和齿状回(坎宁安等人，1996年;默里和林奇，1998年a,b条)，（2）乙酰胆碱释放(Rada等人，1991年)和谷氨酸(Murray等人，1997年)海马突触体中的钙内流(Murray等人，1997年)和（4）钙²⁺海马神经元的通道电流(Plata-Salaman和ffrench-Mullen，1994年).

IL-1β抑制LTP的机制尚待确定。因为LTP的维持与谷氨酸释放增加有关(布利斯和柯林里奇，1993年;Canevari等人，1994年;McGahon和Lynch，1996年;McGahon等人，1997年)IL-1β对谷氨酸释放的抑制作用可能是抑制LTP的一个因素。然而，最近有报道称IL-1β诱导齿状回LTP的衰减在体外被SB203580阻塞(库根等人，1997年)，一种p38抑制剂，是丝裂原活化蛋白（MAP）激酶家族的一个成员。MAP激酶家族已被确定为细胞信号传递的主要参与者，并显著影响细胞增殖、细胞分化和细胞死亡等多种过程。与神经生长因子和其他生长因子刺激细胞外信号调节蛋白激酶（ERK）的证据相一致的是，普遍认为这种特殊途径的激活会导致神经突起生长、细胞增殖或分化(Seger和Krebs，1995年;Xia等人，1995年;Creedon等人，1996年). 相反，c-Jun N末端激酶（JNK）和p38被环境应激激活，包括氧化应激(Raingeaud等人，1995年;Uciechowski等人，1996年;Junger等人，1997年)激活会导致生长停滞甚至细胞死亡(Park等人，1996年;Maroney等人，1998年). IL-1β刺激JNK和p38(Derijard等人，1994年;Raingeaud等人，1995年;Rizzo和Carlo-Stella，1996年;Uciechowski等人，1996年;Lu等人，1997年)这与IL-1β参与细胞死亡的观察结果一致(Rothwell，1999年). 总的来说，在各种循环和培养细胞中已经获得了IL-1β激活JNK和p38以及这些途径的激活导致细胞损伤或细胞死亡的证据，而在神经元组织中缺乏类似变化的证据。

在这项研究中，我们研究了海马组织中IL-1β增加的下游后果，并报告称该细胞因子增加了JNK和p38的活性。我们还提供证据表明，IL-1β诱导的JNK和p38激活导致谷氨酸释放减少，可能是在脑室注射IL-1β的大鼠中观察到的LTP早期和晚期成分减弱的原因。

材料和方法

动物。这些实验中使用了几组雄性Wistar大鼠（300-350克）。动物被分成两到四组，在12小时的光照/暗照时间表下饲养。环境温度控制在22至23°C之间。有食物和水随意在一些实验中，连续1周每天测量食物和水的摄入量，并在这段时间结束时将大鼠随机分为两组。一组接受添加了维生素E（250 mg数字图书馆-α-生育酚醋酸酯/大鼠/天，溶于玉米油；爱尔兰都柏林Beeline Healthcare）。实验室食物中含有3.5%的原油和55 mg/kg的维生素E；因此，该饮食中维生素E的平均每日摄入量为2.75毫克/只。将抗坏血酸（250 mg/大鼠/天）添加到给这些大鼠的水中。第二组接受添加玉米油的正常实验室食物，以确保与第一组的等热量摄入。给大鼠提供100%的平均每日食物和平均水摄入量，以便摄入全部每日维生素。饮食是每天新鲜准备的。各组之间的食物和水摄入量没有差异，饮食调整前后的日常食物和水摄入没有显著差异。用相应的对照或补充饮食喂养大鼠5天，并在实验期间接受兽医监督。

LTP在通路-颗粒细胞突触中的诱导作用体内试验。如前所述诱导LTP(McGahon和Lynch，1996年). 通过腹腔注射氨基甲酸乙酯（1.5 gm/kg）麻醉大鼠，将其置于立体定向框架内的头枕中，并在脑室内注射IL-1β（5μl；3.5 ng/ml；人重组；5×10⁻⁷U/mg；生物反应调节剂计划，国家癌症研究所，马里兰州贝塞斯达）或生理盐水（5μl）。[我们在注射前立即和注射90分钟后每隔15分钟测量一次深部体温。体温从35.18°C略微升高（±1.29，SEM，n个=5）至36.05°C（±2.08），在治疗过程中，注射盐的大鼠和IL-1β治疗的大鼠分别为35.08°C（士0.32）至35.22°C（？.61）。]取下颅骨窗口，将记录和刺激电极分别放置在齿状回的分子层（脑桥外侧2.5毫米和后部3.9毫米）和穿孔通路（角束，λ外侧4.4毫米）。调整电极的深度以获得细胞体区域的最大响应。在～15分钟内记录稳定的基线记录，脑室注射后30分钟开始进行电生理记录；给药后约60分钟。以1/30秒的速度进行强直刺激前10分钟和后40分钟的测试电击（三组刺激；250 Hz 200毫秒；组间间隔30秒）。在单独的一系列实验中，一组四只大鼠接受破伤风刺激，另一组四个大鼠接受相同的刺激总数，但没有高频刺激序列，即每12秒一次刺激。在电生理记录期结束时，大鼠被斩首处死，海马被移除，用McIlwain组织切割器将破伤风化和非破伤风化齿状回以及海马体在冰上解剖并交叉切成薄片（350×350μm）。从死亡之日起，制备切片所需的时间为2.5–3.5分钟。将所有样品分别冷冻在1毫升克雷布斯溶液中（克雷布斯的成分以米为单位）米：氯化钠136、氯化钾2.54、钾₂人事军官₄1.18，硫酸镁₄.7小时₂O 1.18，NaHCO_三16、葡萄糖10和氯化钙₂1.13）含有10%二甲基亚砜，根据Haan和Bowen（1981）为了进行分析，在新鲜的冰镇克雷布斯溶液中将解冻的未去金属化和去金属化齿状回切片冲洗三次，并在1ml冰镇蔗糖（0.32米)用于制备P₂(McGahon和Lynch，1996年)用于分析谷氨酸释放以及p38和JNK的活性。海马切片在200μl新鲜克雷布斯溶液中冲洗和均质，以分析维生素E和C以及超氧化物歧化酶活性，或在40μl新鲜克雷布斯溶液米三氯化氢，pH 7.4，用于分析活性氧生成。

谷氨酸释放。不纯突触体制剂P₂被重新悬浮在含2 m氧气的Krebs溶液中米氯化钙₂(McGahon和Lynch，1996年)，并且如前所述评估谷氨酸释放(McGahon等人，1999年). 简单地说，将突触体组织放在Millipore（Bedford，MA）过滤器（0.45μm）上，在真空下冲洗，并丢弃滤液。然后将突触体在250μl含氧克雷布斯溶液中37°C孵育3分钟，有无40 m米收集KCl和滤液，并按说明保存以进行分析(Ordronneau等人，1991年). 三硅酸盐样品（50μl）或谷氨酸标准品（50μl；25 n米至1μ米在100 m内准备米纳₂高性能操作₄将pH值为8.0的缓冲液添加到戊二醛涂层的96平皿中，在37°C下孵育60分钟，并用100 m水洗米不₂人事军官₄缓冲区。乙醇胺（250μl；0.1米100米以内米纳₂高性能操作₄缓冲液）用于结合未反应的醛类，并添加驴血清（200μl；PBS-T中的3%）以阻止非特异性结合。样品在4°C下与抗谷氨酸抗体（在兔子体内培养；100μl；在PBS-T中1:5000；英国普尔Sigma）孵育过夜，在室温下洗涤并与二级抗体[抗兔辣根过氧化物酶（HRP）相关的二级抗体；100μl；在PBS-T中1:10000；英国阿默沙姆]反应60分钟。添加3,3′，5,5′-四甲基联苯胺液体底物作为显色剂，在室温下持续培养60 min，此时H停止反应₂SO公司₄(4米; 30微升）。使用多孔板阅读器在450 nm处测定光密度，并参考标准曲线计算值，对蛋白质进行校正(布拉德福德，1976年)并表示为每毫克蛋白质中的谷氨酸微粒。

MAP激酶活性分析。在P₂从经盐处理和IL-1β预处理的大鼠海马冷冻切片中获得的制剂，其中一些以对照和实验饮食喂养。在没有和存在IL-1β（10 pg/ml）以及没有和存在H的情况下，通过预孵育样品20分钟来评估激酶的活性₂O（运行）₂（5米米); 这些实验是在P₂从新制备的海马体中获得。在所有实验中，对样品进行蛋白质分析，稀释以使蛋白质浓度相等，并将这些突触体蛋白样品（10μl，1 mg/ml）添加到10μl样品缓冲液（Tris-HCl，0.5 m米pH 6.8；甘油10%；十二烷基硫酸钠，10%；β-巯基乙醇，5%；溴酚蓝，0.05%w/v），煮沸5分钟，并加载到凝胶上（p38为10%SDS，JNK为12%）。通过施加30 mA恒流25–30 min分离蛋白质，转移到硝化纤维条上（225 mA持续75 min），并用适当的抗体进行免疫印迹。用抗体对蛋白质进行免疫印迹，抗体特异性靶向磷酸化JNK【加州圣克鲁斯圣克鲁斯生物技术公司；PBS中1:500–吐温（0.1%吐温20），含2%脱脂奶粉】或磷酸化p38【圣克鲁斯生技公司；PBS-吐温（0.1%吐温20，含2%脱脂奶粉）中1:500】在室温下培养2小时。用二级抗体清洗硝化纤维条并在室温下孵育2小时【过氧化物酶连接的抗鼠IgG；JNK和过氧化物酶连接抗鼠Ig M的1:1000稀释度（Sigma）；p38的1:1000倍稀释度（Amersham）】。通过ECL检测（Amersham）实现可视化；将免疫印迹暴露于胶片过夜，并使用富士x射线处理器进行处理。蛋白质条带的定量是通过密度计分析实现的，使用两个软件包，分别用于摄影和密度计的Grab It（Grab It Annotating Grabber，版本2.04.7，Synotics；UVP Ltd）和Gelworks（Gelworks ID，版本2.51；UVP Ltd）。Gelworks提供了一个表示每个印迹密度的单一值（以任意单位表示），此处显示的值是至少四个单独实验产生的数据的平均值。根据ECL检测后仅观察到一条带的事实判断，这些实验中使用的抗体具有特异性。

活性氧生成分析。活性氧物种的形成通过以下方法进行评估勒贝尔和邦迪（1990）它依赖于2′7′-二氯荧光素（DCF）的测量，DCF是2′7’-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）的氧化荧光产物。对从注射盐和注射IL-1β的大鼠海马体制备的突触体进行评估，也对从新鲜解剖的海马体制得的突触体进行评估（其中评估了在有/无IL-1β和谷氨酸的情况下孵化的效果）。在37°C下，在DCFH-DA（10μl；5μl）存在下培养突触体15分钟米，库存500μ米甲醇中）。为了终止反应，将染料悬浮液在13000×克在4°C下保持8分钟，并将颗粒重悬在2 ml冰冷的40 m中米Tris缓冲液，pH 7.4，并在37°C下监测荧光，激发波长为488 nm，发射波长为525 nm。在一些实验中，IL-1β（1 ng/ml）或谷氨酸（50μ米或250μ米)包括在培养基中，以评估其对活性氧生成的影响。结果表示为DCF标准曲线中每毫克蛋白质形成的DCF（0.05–1μ米).

超氧化物歧化酶活性分析。根据下述方法测定超氧化物歧化酶活性斯皮茨和奥伯利（1989）.孵育缓冲液等分（800μl）[50 m米钾缓冲液，pH 7.8，含1.8 m米黄嘌呤，2.24米米硝基蓝四氮唑（NBT）、40 U过氧化氢酶、7μl/ml黄嘌呤氧化酶和1.33 m米将二乙烯三胺五乙酸]添加到1.5 ml微滤管中，该微滤管含有以不同稀释度（1:2、1:5、1:10、1:20、1:50和1:100）从海马组织（100μl）制备的上清液样品，并在560 nm处通过紫外光谱进行分析。将切片均匀化，并将酶活性评估为NBT的减少速率，NBT的降低速率随着蛋白质浓度的增加而受到抑制。一个活性单位被定义为将NBT减少50%所需的蛋白质量。

维生素C分析。如前所述测定维生素C浓度(Omaye等人，1979年). 简单地说，将从海马体制备的上清液（100μl）的重复等分样品添加到2,4-二硝基苯肼/硫脲/铜（DTC）溶液中（单位：mm： 50个9 N H中的硫脲、2硫酸铜和150二硝基苯肼₂SO公司₄; 20μl），并在37°C下培养3小时。冰镇H₂SO公司₄添加（65%；150μl）以停止反应，将样品旋涡混合并在室温下孵育30 min，然后将等分样品（100μl）转移到96-well板上，在545 nm处通过紫外光谱进行评估。结果以微摩尔/克组织表示。抗坏血酸标准品是在5%三氯乙酸中制备的。

维生素E的分析。维生素E的分析方法为瓦塔塞里（1994）简单地说，将从海马组织（150μl）制备的等分匀浆在含有0.025%丁基羟基甲苯（150μl）、25%抗坏血酸（70μl）和10%氢氧化钾（135μl）的乙醇存在下在60°C下培养30分钟。添加含有0.025%丁基羟基甲苯的己烷（540μl），将样品涡流混合1 min，并以1500 rpm离心6 min。去除己烷相并在氮气下蒸发干燥；使用该程序，维生素E的回收率在70%到80%之间。对于HPLC分析，将干燥样品重新悬浮在含有0.025%丁基羟基甲苯的甲醇（150μl）中，并将30μl体积注入Intersil C18柱。α-生育酚的分离使用75%乙腈：25%甲醇的流动相，流速为1.2 ml/min，样品在292 nm处通过紫外光谱进行检测。维生素E浓度通过外部标准方法进行估算，并表示为每克组织的纳米数。

统计分析。进行单因素方差分析以确定条件之间是否存在显著差异。当该分析显示显著性（在0.05水平上）时临时的学生-纽曼-凯尔斯测试分析用于确定哪些条件彼此之间存在显著差异。学生的t吨在某些情况下，使用检验来确定统计显著性；例如，当对在有或无IL-1β的情况下培养的同一组织的等分样品进行分析时。学生的使用t吨当对来自同一只大鼠的非变性组织和破伤风组织制备的组织进行分析时，配对值检验也适用。

结果

脑室内注射IL-1β抑制了过路粒细胞突触中的LTP。在破伤风刺激后2分钟内，盐预处理组和IL-1β预处理组EPSP斜率的平均增加百分比分别为158.6±6.2和120.3±3.1(n个=每种情况下为6）。在实验的最后5分钟内，盐处理组和IL-1β预处理组的EPSP斜率平均增加百分比分别为139.3±1.6和106.2±1.3（图。​（图11A类).

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图1。

脑室内注射IL-1β抑制LTP和相关的谷氨酸释放增加。A、，破伤风刺激导致注射盐水和注射IL-1β的大鼠EPSP斜率立即增加，尽管注射IL-1α后这一斜率减弱。IL-1β治疗大鼠的平均EPSP斜率降低，因此在40分钟记录期结束时，该值接近基线值。将强直性刺激前5分钟和实验最后5分钟内的样本记录叠加在注入盐水的样本记录上(左手记录）和注射IL-1β(右侧记录）大鼠。每10次响应都包含SEM值。B、，在由未分化齿状回制备的突触体中，内源性谷氨酸释放显著增加(取消设置)通过添加40m的盐注射大鼠米KCl至培养基(*第页< 0.05; 方差分析），但在由强直齿状回制备的突触体中，这一作用增强到了更大的程度(泰特; **第页< 0.01; 方差分析）。注射白细胞介素-1β增加了由未特化和强直齿状回制备的突触体中的非刺激性释放(+第页< 0.05; 方差分析；与盐水注射大鼠的值相比），但增加了40 m米KCl孵育未能增强这些制剂中的谷氨酸释放。数据是六个单独实验的平均值（±SEM）。

对从这些大鼠（每组6只大鼠）获得的破伤风化和非破伤风组织制备的突触体中内源性谷氨酸释放的分析表明，注射IL-1β有显著效果。图​图11B类表明增加了40 m米KCl对从经盐处理的大鼠获得的未去角化齿状回制备的突触体，显著增加了谷氨酸的释放(第页< 0.05; ANOVA），但从破伤风组织制备的突触体中观察到释放的进一步增强(第页< 0.01; 方差分析）。相比之下，KCl未能刺激从IL-1β预处理大鼠获得的未去角化和去角化组织制备的突触体中的谷氨酸释放（图。​（图11B类). 在本实验中，我们观察到，与盐水处理的动物相比，IL-1β预处理的大鼠制备的组织中未刺激的谷氨酸释放显著增加(第页< 0.05; 方差分析）。然而，尽管在另一个实验中也观察到非刺激性谷氨酸释放增加（见图。​图77A类)，这第二次增加没有达到统计意义。

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图7。

饮食控制逆转了IL-1β的一些作用。A、，添加40 m后，谷氨酸释放量显著增加米氯化钾对用对照和实验饲料喂养的盐水注射大鼠齿状回突触体的作用(*第页< 0.05; 学生的t吨测试成对值）。这种作用在用对照饮食喂养的IL-1β注射大鼠齿状回制备的突触体中被阻断，但用实验饮食喂养的注射IL-1β的大鼠制备的神经突触体的衰减被逆转(*第页< 0.05; 学生的t吨测试成对值）。JNK的活动(B类)和第38页(C)在相同大鼠海马突触体的等分样品中进行评估。饮食控制并没有显著改变从注射盐的大鼠制备的样品中任一酶的活性。然而，注射IL-1β的大鼠突触体中JNK和p38的活性均显著增加（相比之下车道3和4具有车道1和2)如样品免疫印迹和密度分析得出的平均数据所示；(*第页< 0.05; 学生的t吨测试成对值）。通过饮食控制，IL-1β诱导的两种酶活性变化被阻断(车道2和4). 这些值是所有实验中六个观察值的平均值（±SEM）。

在从同一组大鼠的海马体制备的突触体组织的等分试样中评估JNK和p38的活性。图​图22证明强直刺激不会影响JNK(A类)或第38页(B类)用含盐大鼠制备的组织中的活性。样品免疫印迹和密度分析的平均数据均表明，IL-1β预处理大鼠组织中两种激酶的活性均增强(*第页< 0.05;^†第页< 0.01; 方差分析）。在p38活性的情况下，非标准化组织和强直化组织中的增加相似，但在JNK的情况中，与强直化的组织相比，未标准化组织的增加更显著(*第页< 0.05; 方差分析）。为了证实观察到的谷氨酸释放和JNK和p38活性的变化实际上与LTP相关，我们比较了接受强直刺激（如上所述）的大鼠制备的同侧和对侧齿状回中的这些测量值或者，在没有高频刺激序列的情况下，对执行路径接收的刺激总数相同。图​图3三A类结果表明，以每12秒一次电击（低频刺激）的速度刺激50分钟对EPSP斜率没有显著影响。图​图3三B类表明KCl的添加刺激了突触体中谷氨酸的释放，突触体由接受低频刺激（双侧）的大鼠齿状回和接受强直刺激的大鼠非特化组织制备而成(第页所有病例均<0.05；n个= 4; 方差分析）；然而，由强直齿状回制备的突触体释放增强(第页< 0.01; 方差分析）。图​图3，三,C和D、，表明所有制剂中JNK和p38的激活相似。

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图2。

IL-1β增加了齿状回突触体中JNK和p38的活性。A、，在由未脱金属和脱金属制备的突触体中，JNK活性显著增加(*第页< 0.05; +第页< 0.01; ANOVA））IL-1β注射大鼠齿状回与从盐水注射大鼠制备的未变性或破伤风化组织进行比较。注射IL-1β后，与未经特化处理的组织相比，经特化的组织中JNK活性降低，但在从注射盐的大鼠身上获得的两种制剂中类似。B、，注射IL-1β的大鼠的未去角化和去角化齿状回制备的突触体中p38组织的活性与注射盐水的大鼠获得的未去去角化或去角化组织相比显著增加(*第页< 0.05; 方差分析）。破伤风刺激不会影响生理盐水或IL-1β处理大鼠组织中的酶活性。数据是六个（±SEM）单独实验的平均值。样本免疫印迹A类和B类证明用盐处理制备的未变性和破伤风化组织中的激酶活性(车道1和2)和IL-1β治疗(车道3和4)大鼠。

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图3。

低频刺激不影响JNK和p38的谷氨酸释放和激活。A、，在50分钟的记录期内，以每12秒一次电击的速度刺激，平均EPSP斜率保持不变，而强直刺激增加了平均EPSP的斜率。B类添加KCl显著增加了低频刺激大鼠齿状回突触体中谷氨酸的释放（双侧；第页< 0.05; 方差分析）和来自非标准化(第页< 0.05; 方差分析）和强碱化(第页< 0.01; 方差分析）接受强直刺激的大鼠组织。C、 D、，所有制剂中JNK和p38的激活情况相似。值是JNK的四个独立实验和p38的三个实验的平均值（±SEM）。

先前的研究表明，IL-1β可能诱导活性氧产生的增加，并且由于在某些细胞类型中活性氧和IL-1β都会增加JNK和p38的活性，我们研究了海马组织中的这些变化。图​图44A类表明在IL-1β（1 ng/ml）存在下培养海马突触体在体外显著增加活性氧生成(第页< 0.05; 学生的t吨测试成对值）。由于IL-1β可能增加未刺激的谷氨酸释放，我们评估了谷氨酸（50和250μ米)活性氧生成的研究在体外并发现没有效果（数据未显示）。图​图44B–E类显示了七个单独实验中的样本免疫印迹和密度分析得出的平均数据，其中IL-1β（10 pg/ml）和H₂O（运行）₂（5米米)对JNK的活性进行了评估，并对四个单独的实验中对p38活性的影响进行了评估。平均数据分析表明，IL-1β显著增加JNK和p38的活性(第页每种情况下<0.05；学生的t吨成对值测试；图。​图44B、 C类). 尽管在p38的情况下，对照组和IL-1β处理组织的SEM值重叠，但平均值之间的差异非常显著，因为IL-1β增加了所有实验中的p38磷酸化。H（H）₂O（运行）₂与IL-1β一样，这两种激酶的活性都显著增加(第页< 0.05; 学生的t吨成对值测试；图。​图44D、 E类).

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图4。

IL-1β和活性氧增加了JNK和p38的活性。A、，IL-1β显著增加活性氧(ROS公司)未经处理的大鼠海马突触体的产生(*第页< 0.05; 学生的t吨成对样本测试；n个= 6). IL-1β（10 pg/ml）显著增加两种JNK的活性(B类)和第38页(C)，如样本免疫印迹所示（比较车道2具有车道1)以及来自7个JNK和4个p38的单独免疫印迹密度分析的平均数据(第页每种情况下<0.05；学生的t吨成对样本测试）。H（H）₂O（运行）₂（5米米)还显著增加了JNK的活性(D类)和第38页(E类)，如样本免疫印迹所示（比较车道2具有车道1)以及来自六个单独免疫印迹的密度分析的平均数据（±SEM）(第页每种情况下<0.05；学生的t吨成对样本测试）。

这些数据表明，IL-1β的部分作用可能来自其对活性氧生成的刺激作用；如果是这样，可以预测，抗氧化剂会抑制IL-1β的作用。因此，我们评估了侧脑室注射IL-1β对喂食对照饮食和富含抗氧化维生素E和C的饮食的大鼠LTP的影响。图​图55表明用富含维生素的饮食喂养的大鼠不存在IL-1β诱导的LTP损伤。在这些实验中，强直刺激后2分钟内EPSP斜率的平均百分比增加（与强直刺激前5分钟的平均值相比）在用对照饮食喂养的含盐组和IL-1β预处理组中分别为143.2±5.6和127.1±2.0，在用富含维生素的饮食喂养的含盐组和含IL-1β预先处理组中，分别为141.0±3.7和172.7±9.7。在实验的最后5分钟内，生理盐水和IL-1β预处理组的EPSP斜率相应的平均增加百分比分别为120.1±1.2和107.5±1.6，以及119.3±3.5和125.8±2.3（图。​（图5）；5); 两组服用富含维生素饮食的患者之间的数值差异没有达到统计学意义。

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图5。

通过饮食控制抗氧化剂维生素E和C，可以逆转IL-1β诱导的LTP损伤。在以对照饮食喂养的IL-1β注射大鼠中，LTP受到抑制，但补充富含维生素E和维生素C的饮食（详见材料和方法）可逆转此效应。饮食控制对盐处理大鼠的LTP没有影响。数据来自每个治疗组的六个观察结果，每10个反应中包含SEM值。

为了评估饮食控制引起的变化，我们分析了超氧化物歧化酶的活性、活性氧物种的形成以及海马组织中维生素E和C的浓度，这些组织是由生理盐水和白细胞介素-1β注射大鼠制成的，这些大鼠以对照组和富含维生素的饮食喂养。图​图66表明IL-1β显著增加了喂食对照和实验饲料的大鼠组织中超氧化物歧化酶的活性(第页< 0.05; 学生的t吨成对样本的测试；图。​图66A类). 我们观察到，脑室内注射IL-1β可显著增加喂食对照饮食的大鼠海马突触体的活性氧生成(第页< 0.05; 学生的t吨但饮食控制扭转了这种影响（图。​（图66B类). 与对照组、饮食组相比，实验组大鼠海马中的维生素C浓度显著增加(第页< 0.05; 学生的t吨独立方法测试；图。​图66C)，但维生素E浓度不受饮食控制的影响（图。​（图66D类); IL-1β预处理没有改变任何一种维生素的浓度。

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图6。

饮食控制逆转了IL-1β诱导的活性氧生成增加。侧脑室注射IL-1β显著提高超氧化物歧化酶活性(草地;第页< 0.05; 学生的t吨配对平均值测试）；饮食控制不影响酶的活性(A类). 活性氧生成(ROS公司)与注射盐的大鼠制备的突触体相比，注射IL-1β的大鼠海马突触体显著增加（p0.05；Student’st吨配对平均值测试）。饮食控制扭转了这种影响(B类). 维生素C的浓度(C)和维生素E(D类)注射盐和注射IL-1β的大鼠海马组织中的维生素C含量相似，但饮食控制显著增加了这两组大鼠组织中维生素C的浓度(第页< 0.05; 学生的t吨配对平均值测试）。维生素E浓度不受饮食影响。这些值是每种情况下六个观察值的平均值（±SEM）。

用生理盐水和IL-1β处理的大鼠齿状回制备突触体，并以对照组和富含维生素的饮食喂养，评估突触体中谷氨酸的释放以及JNK和p38的活性。图​图77A类证明增加40 m米KCl显著增加了喂食对照和实验饮食的盐水注射大鼠组织中谷氨酸的释放(第页< 0.05; 方差分析）。KCl诱导的释放增强在注射IL-1β的大鼠（以对照饮食喂养）的组织中受到抑制，但在接受实验饮食的大鼠中这种抑制被逆转，因此KCl刺激的释放明显大于非刺激的释放(第页< 0.05; 方差分析）。

对这些治疗对JNK活性的影响的分析表明，与饮食组或实验饮食中IL-1β治疗的大鼠中的盐处理大鼠的酶活性相比，以对照饮食喂养的IL-1β处理大鼠中酶活性显著增加(第页< 0.05; 学生的t吨测试；图。​图77B类). 在这些对JNK活性的影响的同时，我们观察到，用两种饮食喂养的含盐大鼠制备的组织中p38活性相似，而用对照饮食喂养的IL-1β预处理大鼠的酶活性显著增加(第页< 0.05; 学生的t吨成对值测试；图。​图77C). 在四种条件（盐水预处理大鼠和IL-1β预处理对照和实验饮食大鼠）中的每一种条件下，对六个单独的样本进行p38活性评估，在每种情况下，与盐水预处理大鼠相比，IL-1β预处理对照饮食大鼠制备的组织中的酶活性增强。因此，饮食控制逆转了IL-1β注射液的作用。样本免疫印迹显示JNK活性的这些趋势（图。​（图77B类)和第38页（图。​（图77C).

讨论

我们开始研究海马IL-1β增加的下游后果，目的是加深我们对齿状回LTP受损机制的了解。数据表明，伴随LTP损害的IL-1β浓度升高的细胞后果是活性氧生成增加，从而导致JNK和p38活性增加。根据所提供的证据，我们认为IL-1β诱导的活性氧生成增加增加了JNK和p38的激活，进而抑制LTP。IL-1β诱导的LTP抑制也可能是由于观察到的谷氨酸释放抑制所致。该工作假设如图所示​图88.

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图8。

提示导致IL-1β诱导LTP损伤的级联事件的方案。脑室内注射IL-1β导致活性氧生成增加，从而增加JNK和p38的活性。我们认为，谷氨酸释放受到IL-1受体激活的影响，其结果之一是这些激酶的激活，并且这种抑制谷氨酸释放的行为大大有助于IL-1β诱导的LTP损伤。

与这一假设相一致，我们报道IL-1β对执行通路-颗粒细胞突触中LTP的抑制作用伴随着JNK和p38的活性增加。IL-1β诱导的LTP衰减证实了我们之前的观察结果(默里和林奇，1998年a)并确认了在体外证明IL-1β抑制齿状回LTP的实验(坎宁安等人，1996年)，CA1(Bellinger等人，1993年)，和CA3(Katsuki等人，1990年). 结合IL-1β诱导的LTP抑制，我们观察到IL-1β抑制KCl诱导的谷氨酸释放。因此，虽然在用盐处理大鼠的破伤风组织制备的突触体中观察到KCl刺激的释放增加，但在用IL-1β处理的大鼠的未破伤风和破伤风的组织制备突触体时，KCl刺激释放明显减少。这些数据支持这样的假设，即齿状回中的LTP与执行通路-颗粒细胞突触中谷氨酸释放的增加紧密相关(Canevari等人，1994年;McGahon和Lynch，1996年;McGahon等人，1999年). 我们观察到IL-1β增加了谷氨酸的非刺激释放，但这种变化并不总是具有统计意义。

我们观察到IL-1β对LTP的抑制作用与对JNK和p38活性的刺激作用相结合。因此，虽然这两种激酶的活性不受强直刺激的影响，但从注射IL-1β的大鼠海马中制备的突触体中，这两种酶的活性都显著增加。对这一发现的一种解释是，IL-1β激活这些激酶，这种作用可能导致LTP的抑制；这与报道的p38抑制剂SB203580对IL-1β诱导的LTP减弱的抑制作用一致(库根等人，1997年). 为了直接解决这个问题，我们分析了IL-1β对JNK和p38活性的影响在体外并发现，在细胞因子存在下孵育，两种激酶的活性都增加。许多使用不同细胞类型的小组报告了这种行为。例如，据报道，IL-1β可增加人肾小球系膜JNK的活性(Uciechowski等人，1996年)和赫拉(Raingeaud等人，1995年)中国仓鼠CCl39中有IL-1β诱导p38激活的报道(Guay等人，1997年)和赫拉(Raingeaud等人，1995年)细胞。

有人认为IL-1β的某些作用可能通过增加活性氧的产生来介导(Sumoski等人，1989年;Raingeaud等人，1995年;默里和林奇，1998年b)在这项研究中，我们通过证明（1）IL-1β增加海马组织中活性氧的形成和（2）过氧化氢，从而导致羟自由基的形成，进一步证明了这一观点(秦等，1999)，通过刺激JNK和p38模拟IL-1β的作用体外试验。这些发现与紫外线辐射的观察结果一致(Zhang等人，1997年)和渗透压力(秦等，1999)，它还诱导活性氧物种的形成，刺激JNK和p38的活性(Raingeaud等人，1995年)在HeLa细胞中。这些结果支持我们的工作假设；如果海马中IL-1β浓度增加，活性氧物种形成增加，应激激活激酶激活，LTP表达受阻。虽然数据，特别是在体外分析表明，这些影响可能是连续的，这一点尚待明确确定。

为了挑战这一假设，有理由提出，如果IL-1β通过刺激活性氧生成而起作用，那么IL-1β的后续作用将被抗氧化剂抑制。我们试图通过在注射IL-1β之前给各组大鼠喂食抗氧化维生素E和C来解决这个问题。数据表明，饮食调控阻断了IL-1β诱导的LTP抑制，从而得出结论，IL-1β的作用是通过活性氧的产生介导的。这得到了以下工作的支持Pellmar等人（1991年），他报告说过氧化氢抑制豚鼠CA1中的LTP在体外本文提供的数据表明，IL-1β处理的大鼠海马中活性氧产生的增加是超氧化物歧化酶活性增加的结果，这与先前关于IL-1β诱导的Mn超氧化物歧化酶基因表达上调的报道一致(Antras Ferry等人，1997年)，mRNA(Borg等人，1992年)以及各种细胞制剂中的酶活性(Borg等人，1992年). 对喂食对照组和富含维生素饮食的大鼠海马组织的分析表明，在喂食对照饮食的IL-1β处理大鼠的组织中，活性氧生成增加，但在维生素处理大鼠中，IL-1β诱导的这种变化被阻断。饮食控制后，未观察到维生素E的组织浓度发生变化，但这并不奇怪，因为已经证明，长期服用这种脂溶性维生素对其融入膜是必要的(哈里维尔1992;默里和林奇，1998年b). 这些发现与该实验室之前的观察结果一致，在该实验室中，我们发现老龄大鼠海马组织中IL-1β浓度和活性氧生成增加，这表明维持LTP的能力受损(McGahon等人，1997年;默里和林奇，1998年a,b条). 他们也与观察结果一致，即3个月的维生素E和C饮食操作恢复了老年大鼠维持LTP的能力(默里和林奇，1998年b). 可以预见的是，饮食调控不会影响IL-1β诱导的超氧化物歧化酶刺激，因此我们提出，饮食调控后观察到的维生素C组织浓度升高是逆转IL-1β导致的活性氧生成增加的原因。

为了获得进一步的证据来支持抗氧化治疗逆转IL-1β对海马功能的影响这一假设，我们分析了用盐处理和IL-1β处理的大鼠（喂食对照组和富含维生素的饮食）制备的突触体中谷氨酸的释放和JNK和p38的活性。数据表明，通过饮食控制，IL-1β对释放的抑制作用被阻断。结合这一变化，我们观察到饮食控制逆转了IL-1β诱导的JNK和p38活性增加。这些结果表明，饮食控制引起的组织维生素C增加阻止了IL-1β的刺激作用及其随后对谷氨酸释放的抑制作用。如果认为IL-1β对LTP的抑制作用是JNK和/或p38激活的结果，那么必须预测，当海马内源性IL-1β浓度增加时，LTP将被抑制，JNK或p38的活性将增加，例如在老龄大鼠海马组织中(默里和林奇，1998年a,b条). 我们最近观察到，从老龄大鼠制备的海马组织中JNK活性和p38活性增加(O'Donnell等人，2000年)IL-1β浓度和活性氧生成增加(林奇，1998).

JNK和p38的激活增加与细胞死亡有关(Yang等人，1997年;Luo等人，1998年)证据表明IL-1β在缺血诱导的细胞死亡中起作用(Rothwell，1999年). 可以推测，在当前实验条件下，IL-1β刺激JNK和/或p38，细胞损伤可能是由这种作用引起的。这一建议与我们最近的研究结果一致，即肠外注射脂多糖增加了内嗅皮层的IL-1β浓度和细胞变性，脑室内注射caspase-1抑制剂可抑制这些变化，表明IL-1β在其中起关键作用(Campbell等人，2000年).

我们认为，IL-1β对过氧化物酶体细胞突触中LTP的抑制作用是活性氧物种形成增加的结果，证据表明IL-1β的主要作用是刺激超氧化物歧化酶的活性。我们的证据表明，JNK和p38的激活增加代表活性氧物种增加的关键下游事件，导致IL-1β的抑制作用。

脚注

参考文献