AMPA受体亚基GluR2磷酸化对其与PDZ结构域蛋白质相互作用的调控

摘要

谷氨酸受体介导中枢神经系统的兴奋性突触传递，对大多数神经元过程至关重要，包括突触可塑性、神经元发育以及一些神经和精神疾病(Sheng和Kim，1996年;Kim和Huganir，1999年). 谷氨酸能突触上的两个主要的离子性受体是AMPA和NMDA受体，它们是同源亚单位的异聚复合体（GluR1-4代表AMPA受体，NR1，NR2A-D代表NMDA受体），它们不同地结合形成各种受体亚型(Choi，1988年;布利斯和柯林里奇，1993年;Seeburg，1993年;霍尔曼和海涅曼，1994年). AMPA受体介导快速兴奋性突触传递，而NMDA受体对于诱导学习和记忆下的活动依赖性突触可塑性至关重要(Choi，1988年;布利斯和柯林里奇，1993年;Seeburg，1993年;霍尔曼和海涅曼，1994年). AMPA和NMDA受体都高度集中在兴奋性突触的突触后膜，其亚基的C末端尾部通过PSD-95、DLG、ZO-1（PDZ）结构域介导的相互作用与细胞骨架和信号分子结合(Sheng和Kim，1996年;Kim和Huganir，1999年). PDZ结构域是特异性结合膜或膜相关蛋白C末端的模块化蛋白质-蛋白质相互作用基序(伍兹和布莱恩特，1991年;Cho等人，1992年;Kistner等人，1993年;肯尼迪，1995年). NMDA受体的NR2亚单位通过其C末端序列（IESDV）与PSD-95/SAP90家族蛋白的PDZ结构域特异性相互作用(Kim等人，1995年;Kornau等人，1995年). 相反，AMPA受体的GluR2和GluR3亚基的C末端序列（ESVKI）与包括GRIP1和-2（谷氨酸受体相互作用蛋白）、ABP（AMPA受体结合蛋白）和PICK1（与C激酶1相互作用的蛋白）在内的几种蛋白中的特定PDZ结构域结合(Dong等人，1997年,1999;Srivastava等人，1998年;Xia等人，1999年).

PDZ结构域蛋白被认为可以调节谷氨酸受体和钾的突触靶向⁺突触通道(Sheng和Kim，1996年;Kim和Huganir，1999年). PSD-95在兴奋性突触与NMDA受体共定位，并可诱导NMDA受体和Shaker K的聚集⁺异源细胞中的通道(Kim等人，1995年,1996). 遗传研究果蝇属表明PSD-95相关蛋白大圆盘（DLG）对Shaker-type K的突触聚集至关重要⁺通道(Tejedor等人，1997年). 类似地，PICK1已被证明在异源表达系统中诱导AMPA受体聚集(Xia等人，1999年). 此外，GluR2亚单位C末端结构域的过度表达导致培养神经元中突触AMPA受体簇的丢失(Dong等人，1997年). PDZ结构域蛋白也被认为可以调节突触信号通路。PSD95/SAP90家族蛋白与几个参与信号转导的蛋白质相互作用，包括SynGAP，一种神经元RasGTPase激活蛋白和神经元一氧化氮合酶（nNOS）(Brenman等人，1996年;Chen等人，1998年;Kim等人，1998年). 小鼠中PSD-95基因的靶向缺失似乎扰乱了NMDA受体的下游信号传导，而不影响NMDA受体突触定位(Migaud等人，1998年). GRIP1和-2与多种信号蛋白相互作用，包括EPH受体、肾上腺素和GRAP1（GRIP-associated proteins 1），一种新型神经元rasGEF(Ye等人，2000年). 此外，PICK1与PKCα相互作用。因此，PDZ结构域蛋白发挥多种功能作用，并可能作为衔接蛋白，将受体与突触细胞骨架以及下游信号转导级联偶联。

最近的研究表明，在包括长时程增强（LTP）和长时程抑制（LTD）在内的几种形式的突触可塑性中，AMPA受体功能可以快速调节(Isaac等人，1995年;廖等，1995;Carroll等人，1999年;Kim和Huganir，1999年;廖等，1999;Shi等人，1999年). 这些结果表明，AMPA受体-PDZ结构域的相互作用可能是动态调节的。我们之前提出，GluR2和GluR3亚单位的C末端PDZ配体（IESVKI）中的丝氨酸可能是调节AMPA受体与PDZ结构域结合的潜在磷酸化位点(Dong等人，1997年). 在这里，我们表明GluR2 PDZ配体中Ser880的磷酸化对GluR2与GRIP1和PICK1的相互作用有不同的调节作用。神经元中PKC的激活增加了Ser880磷酸化并诱导GluR2亚单位的内化。这些结果表明，在突触可塑性过程中，通过磷酸化调节GluR2与PDZ结构域蛋白的相互作用可能调节AMPA受体的表面表达。

材料和方法

抗GluR2-pS880的生成和表征。针对合成肽LVYGIESVKIA（对应于GluR2的873–883氨基酸）产生抗GluR2-pS880抗体，其中磷酸丝氨酸包含在Ser-880中。通过与非磷酸化和Ser880-磷酸化GluR2肽共价连接的Affi-Gel（Bio-Rad）柱的顺序色谱，从血清中亲和纯化抗GluR2-pS880抗体。对从18日龄胚胎大鼠分离的3周龄高密度皮质培养物进行抗体鉴定(Goslin和Banker，1991年)或表达GluR2或GluR2 S880A的HEK293T细胞，其中丝氨酸-880突变为丙氨酸。细胞在低渗透缓冲液（2 m米HEPES，5米米乙二胺四乙酸，1μ米冈田酸，50米米氟化钠，10米米焦磷酸钠，1米米原钒酸钠）与蛋白酶抑制剂混合物（PIC:2μg/ml抑肽酶、1μg/ml亮氨酸肽、2μg/ml安替比林、10μg/ml苯甲酰胺、1 m米苯甲基磺酰氟）。匀浆在14000×克在4°C下保持10分钟。将膜部分重新悬浮在SDS样品缓冲液中，加载到SDS-PAGE凝胶上，转移到PVDF膜（Immobilon-P膜，Millipore，Bedford，MA），并使用抗GluR2-pS880和抗GluR2 C-末端或抗GlurR2 N-末端抗体（Chemicon，Temecula，CA）进行免疫印迹分析。为了测试抗GluR2-pS880的特异性，用0.2μg/ml浓度的非磷酸化或Ser880-磷酸化GluR2肽预先吸收抗体，或者在免疫印迹前用λ−磷酸酶处理PVDF膜30分钟。根据下述程序进行大鼠脑膜制剂（P2）的免疫沉淀Luo等人（1997）按照说明进行修改(Kim等人，1996年). 用SDS-PAGE样品缓冲液洗脱免疫沉淀物，并进行免疫印迹分析。

GluR2的PKC磷酸化。表达GluR2的人类胚胎肾（HEK）293T细胞和3周龄的高密度皮质培养物用对照溶液或激酶活化剂处理[20μ米forskolin或0.2–1μ米佛波醇12-肉豆蔻酸13-醋酸盐（TPA）]作用15分钟。然后用抗GluR2-pS880和抗GluR2 C-末端或抗Glur2N-末端抗体（Chemicon）通过定量免疫印迹分析膜部分。免疫印迹通过增强化学荧光（ECF）显影（Amersham Pharmacia，Arlington Heights，IL）进行可视化，并在Storm Imaging System和ImageQuant软件（分子动力学）上进行量化。为了量化GluR2磷酸化的相对程度，我们计算了用磷酸化位点特异性抗体标记GluR2的强度与用C末端磷酸化依赖性GluR2抗体标记强度的比值。然后取对照样品的磷酸化率为100%，并将TPA或forskolin处理样品的磷酸化率归一化为对照样品的比率，以获得磷酸化百分比。对于在体外GluR2融合蛋白、细菌谷胱甘肽的磷酸化S公司-如前所述，构建并纯化含有GluR2 C末端或GluR2突变体（S880A或S863A）最后50个氨基酸的转移酶（GST）融合蛋白(Roche等人，1996年). 用1μg融合蛋白（50μg）进行磷酸化反应米ATP和0.1μg PKC在30°C下30分钟，总体积为100μl（10 m米HEPES，pH值7，10 m米氯化镁₂，1米米氯化钙₂50 mg/ml磷脂酰丝氨酸和5 mg/ml二油酸）。通过添加50μl 3×SDS-PAGE样品缓冲液对反应进行猝灭，并用抗GluR2-pS880和抗GluR2C末端抗体进行免疫印迹分析融合蛋白。

HEK293T细胞转染及相互作用研究。如前所述，使用磷酸钙共沉淀法将亚克隆到载体pBKCMV（全长GRIP1）、pRK5（GluR2或GluR2S880E）或带有N末端myc-tag（PICK1；氨基酸1–386）的pRK5cDNA转染到HEK293T细胞中(Dong等人，1997年). 对于在体外绑定研究,将转染GRIP1或PICK1 cDNA的细胞置于1%Triton X-100的冰镇免疫沉淀缓冲液（25m）中米100 m Tris-HCP米氯化钠，5米米EDTA，5米米EGTA，1μ米OKA，50米米氟化钠，1米米钒酸钠和PIC）。然后将裂解产物与未磷酸化或Ser880-磷酸化的GluR2肽结合亲和树脂在4°C下孵育1小时。通过将2 mg/ml肽与2 ml活化的AffiGel-10树脂偶联来制备柱。用相同的缓冲液洗涤结合蛋白五次，用SDS样品缓冲液洗脱，并用抗GRIP1或抗PICK1抗体进行免疫印迹分析。为了用GRIP1或PICK1共免疫沉淀GluR2，用对照溶液或1μ米TPA在37°C下溶解于含有2%Triton X-100的冰镇免疫沉淀缓冲液中。根据上述程序，分别使用抗GRIP1抗体或抗myc（myc-PICK1）抗体进行协同免疫沉淀(Dong等人，1997年;Xia等人，1999年). 为了进行免疫细胞化学，将PICK1、Narp和GluR2或突变的GluR2S880E cDNA三次转染到HEK293T细胞中，这些细胞生长在涂有0.2%明胶的盖玻片上。如前所述，用抗N末端GluR2、抗PICK1和抗Narp抗体固定细胞并进行三重染色(O'Brien等人，1999年;Xia等人，1999年). 对于GRIP1、Narp和GluR2或突变GluR2S880E的三重转染，细胞被抗N-末端GluR2、抗GRIP1和抗Narp抗体染色。

蛋白质相互作用的酵母共转化分析。如前所述进行酵母分析(Dong等人，1997年;Xia等人，1999年)以携带HIS3、ADE2和β-半乳糖苷酶的PJ69菌株为报告基因。将亚克隆到载体pPC97（野生型GluR2或突变型GluR2S880E的最后50个氨基酸）、pPC86（PICK1；氨基酸1-386或GRIP1；PDZ4-6）的cDNA转化为PJ69细胞。阳性克隆在四个负板（Leu-、Trp-、His-、Ade-）中生长，并以X-gal为底物检测β-半乳糖苷酶活性。

海马神经元的免疫细胞化学和数据分析。从18天龄胚胎大鼠中制备低密度海马培养物，如下所述(戈斯林和银行家，1991年). 用对照溶液或200 n溶液处理盖玻片上的3周大神经元米TPA 15分钟，然后按照前面所述进行固定和染色(廖等，1999). 抗GluR2-pS880抗体直接与Cy3TM（Amersham Life Science；红色染色）结合。使用抗N-末端GluR2抗体（Chemicon）观察总GluR2。突触由抗突触素或抗N末端NR1抗体显示。用数码相机（普林斯顿仪器公司）拍摄锥体神经元的图像，使用相同的曝光时间来观察荧光强度的差异。使用MetaMorph成像系统（Universal Imaging Co.）对图像进行分析。设定与树突轴类似的荧光强度阈值后，用MetaMorph对Ser880-磷酸化GluR2的突触簇进行计数。只有与突触素或突触素GluR2共定位的GRIP1和PICK1簇被视为突触簇，并手动计数。在手动跟踪和测量图像中的所有树枝状分支后，用树枝状长度将簇数归一化。

生物素化。对于稳态生物素化，对3周龄的高密度培养皮层神经元进行对照或1μ米，37°C下TPA 15分钟以刺激PKC。将培养物在冰上冷却，用冰冷的人工CSF（ACSF）洗涤两次，所述人工CSF含有（单位：米)：125氯化钠、2.5氯化钾、25氯化钠_三，1 NaH₂人事军官₄，10葡萄糖，2.5氯化钙₂，1.25氯化镁₂和5%CO₂然后在冰上与含有1 mg/ml磺化-NHS-LC-生物素的ACSF（皮尔斯化学公司，伊利诺伊州罗克福德）孵育20分钟。未反应的生物素化试剂用冰镇ACSF清洗一次，然后在含有100 m的ACSF中连续清洗两次20 min进行淬火米甘氨酸，然后在冰镇TBS（50 m）中清洗两次米Tris，pH 7.5，150 m米氯化钠）。在改良的RIPA缓冲液（1%Triton X-100，0.5%SDS，0.5%脱氧胆酸，50 m米NaPO4，150米米氯化钠，2米米EDTA，50米米氟化钠，10米米焦磷酸钠，1 m米原钒酸钠和PIC）。匀浆在14000×克在4°C下保持15分钟。将所得上清液与100μl 50%中性亲和素琼脂糖（皮尔斯化学公司）在4°C下培养3小时。用RIPA缓冲液洗涤中性亲和素琼脂糖五次后，用SDS样品缓冲液煮沸15分钟洗脱结合蛋白。总蛋白和分离的生物素化蛋白用抗GluR2 C末端和抗NR2B C末端抗体进行定量免疫印迹分析。对于内化试验，首先用冰上的生物素标记皮层神经元，然后用1μ米37°C下TPA 15分钟，以允许内化。培养物在冰上冷却，然后用剥离缓冲液（50 m）剥离表面的生物素米谷胱甘肽，75米米氯化钠和75 m米氢氧化钠、10%FBS、pH 8.5–9.0）。将神经元溶解在RIPA缓冲液中，用抗GluR2-C末端和抗R2-pS880抗体进行免疫印迹分析生物素化的GluR2亚基。所有免疫印迹均通过ECF显影（Amersham Pharmacia）进行可视化，并在风暴成像系统（分子动力学）上进行量化。

数据分析。所有数据均以平均值±标准误差报告。样本量n个指在免疫细胞化学中处理的图像数量，以及在生物素化和激酶活化实验中分析的培养皿数量。分组配对t吨激酶活化试验用于测试对照组和试验组之间的差异，而免疫细胞化学和生物素化试验则使用Student’st吨已使用测试(*对< 0.05, **对< 0.01, ***对< 0.001).

结果

GluR2亚单位C末端PDZ配体在丝氨酸-880处磷酸化体内

确定GluR2 PDZ配体中的丝氨酸残基（Ser880）是否磷酸化体内，我们针对与GluR2的最后10个氨基酸对应的合成磷酸肽（包含磷酸化Ser880）生成了磷酸化位点特异性抗体。所得抗体，抗GluR2-pS880，在用野生型GluR2或突变体GluR2（R2S880A）转染的HEK293T细胞中进行表征，其中Ser880突变为丙氨酸。抗GluR2-pS880抗体在GluR2转染的HEK293T细胞中检测到一个105 kDa的单一蛋白，即GluR2亚单位的预测分子量。Ser880突变为丙氨酸消除了抗GluR2-pS880对GluR2的免疫识别，证明了抗体的特异性（图。​（图11一). 免疫印迹前用λ−磷酸酶对GluR2进行去磷酸化，消除了抗GluR2-pS880抗体的免疫识别，证明了抗体的磷酸化依赖性（图。​（图11b条). 此外，在使用0.2μg/ml Ser880-磷酸化GluR2 C末端肽（pR2）进行免疫印迹之前，抗体的预吸收阻止了抗GluR2-pS880对GluR2的识别，而使用非磷酸化肽（R2）的预吸收没有影响（图。​（图11c（c）).

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图1。

GluR2亚单位C末端PDZ配体在Ser880上磷酸化。a–c在表达GluR2的HEK293T细胞的免疫印迹上对磷酸化位点特异性抗GluR2-pS880抗体进行了表征。通过使用磷酸化非依赖性抗GluR2-C末端抗体（anti-R2C-term）分析GluR2的表达。一，抗-GluR2-pS880抗体识别野生型GluR2，但不识别丝氨酸-880突变为丙氨酸的突变GluR2。b条用λ-磷酸酶处理PVDF膜时，抗-GluR2-pS880不再识别GluR2。c（c）、抗GluR2-pS880抗体与Ser880-磷酸化R2肽的预吸收(第2页)但不是非磷酸化肽(R2级)通过抗GluR2-pS880阻止GluR2识别。d日,e（电子），Western Blot检测皮层培养神经元匀浆中的GluR2-pS880(d日)和老鼠大脑(e（电子）).（f）、抗GluR2-pS880抗体与Ser880-磷酸化R2肽的预吸收(第2页)但不是非磷酸化肽(R2级)用抗GluR2-pS880阻断GluR2的免疫沉淀。

我们检测了培养神经元和大鼠大脑中GluR2是否在丝氨酸-880处磷酸化。抗GluR2-pS880抗体在培养的皮层神经元和大鼠脑匀浆中识别出单个105 kDa蛋白（图。​（图11d日,e（电子）). 此外，用来自大鼠脑膜清洁剂提取物的抗GluR2-pS880抗体免疫沉淀GluR2。带有Ser880-磷酸化肽（pR2）而非非磷酸化肽的抗体的预吸收阻止了GluR2的免疫沉淀，表明抗GluR2-pS880抗体以磷酸化特定的方式免疫沉淀GluR2（图。​（图11（f）). 免疫沉淀定量显示，大鼠大脑中约5%的总GluR2在丝氨酸-880处磷酸化，而在培养3周的皮层神经元中约30%的总GluR2在丝酐-880处磷酸化（数据未显示）。这些结果表明Ser880上GluR2的磷酸化水平显著体内试验。

PKC磷酸化GluR2的丝氨酸-880

围绕Ser880（ESVKI）的氨基酸序列是PKC共有位点（S/T-X-K/R），表明PKC可能磷酸化该位点。为了确定PKC是否磷酸化Ser880，我们使用磷酸化位点特异性抗体观察PKC激活物是否增加了GluR2转染的HEK293T细胞中的Ser880磷酸化。为了量化GluR2磷酸化的相对程度，我们计算了用磷酸化位点特异性抗体标记GluR2的强度与用C末端磷酸化依赖性GluR2抗体标记强度的比值。用1μ米激活PKC的佛波酯（TPA）增加了丝氨酸-880的相对磷酸化（对照组的240±15%，n个= 4;对<0.05）（图。​（图22一,b条). 相反，20μ米forskolin，PKA激活剂（110±2%的对照；对>0.05）（图。​（图22一,b条).

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图2。

PKC磷酸化GluR2的丝氨酸-880在体外和体内.一，Western blot检测用对照溶液处理的转染HEK293T细胞中的GluR2-pS880(控制), 1 μ米佛波醇12-肉豆蔻酸13-乙酸酯(TPA公司)，或20μ米用抗GluR2-C末端抗体检测GluR2总量。b条计算信号强度比（抗GluR2-pS880抗体标记强度/抗GluR2 C末端抗体标记强度），并将其归一化为对照细胞。TPA刺激PKC显著增加GluR2的Ser880磷酸化。c（c），免疫印迹分析在体外与GluR2、GluR2S880A和GluR2863A的C末端相对应的纯化GST融合蛋白与纯化PKC的磷酸化反应。PKC直接磷酸化GluR2，而不是GluR2S880A突变融合蛋白。d日，Western blot检测3周龄高密度皮层培养神经元中用对照溶液处理的GluR2-pS880(控制)，200牛顿米TPA或20μ米用抗GluR2-N末端抗体（Chemicon）检测GluR2总量。e（电子）计算信号强度比（抗GluR2-pS880抗体标记强度/抗GluR2 N末端抗体标记强度），并将其归一化为对照神经元。神经元中PKC的刺激显著增加GluR2的Ser880磷酸化。

为了证实丝氨酸-880被PKC直接磷酸化，我们进行了在体外使用与GluR2的C末端相对应的纯化融合蛋白和纯化的大鼠脑PKC进行磷酸化反应。抗GluR2-pS880的免疫印迹分析表明，GluR2C末端的融合蛋白在丝氨酸-880处被PKC磷酸化在体外（图。​（图22c（c）). 丝氨酸-880突变为丙氨酸完全消除了这种磷酸化，而丝氨酸-863的突变是另一个GluR2 PKC磷酸化位点（B.J.McDonald,A.L.Mammen、H.J.Chung和R.L.Huganir，未发表的数据）对Ser880磷酸化没有影响（图。​（图22c（c）). 这些结果表明PKC直接磷酸化丝氨酸-880在体外并提供PKC直接磷酸化该位点的证据体内.

为了确定PKC是否能磷酸化神经元中丝氨酸-880上的GluR2，我们检测了皮层神经元培养物中Ser880磷酸化的调节。GluR2在丝氨酸-880处基本磷酸化，但用0.2μ米TPA（控制的260±2%，n个= 12;对<0.05）（图。​（图22d日,e（电子）). 相比之下，20μ米forskolin对丝氨酸-880的磷酸化几乎没有影响（为对照的98±4%；n个= 5,对>0.05）（图。​（图22d日,e（电子）). 用Ser880-磷酸化GluR2肽预吸收抗GluR2-pS880抗体，但不与等效的非磷酸化肽预吸收，消除了对基础和佛波酯刺激GluR2的抗体识别（数据未显示）。这些结果强烈表明PKC磷酸化神经元中GluR2的丝氨酸-880。

GluR2 PDZ配体磷酸化差异调节其与GRIP1和PICK1的相互作用

为了研究GluR2 C-末端PDZ配体中丝氨酸-880的磷酸化是否可以调节GluR2与GRIP1和PICK1的相互作用，我们分析了GRIP1或PICK1与Ser880-磷酸化（pR2）或非磷酸化GluR2 C末端肽（R2）的结合在体外将表达GRIP1或PICK1的HEK293T细胞裂解物与GluR2肽缀合的亲和柱孵育，然后洗脱结合的蛋白质并通过免疫印迹分析进行分析。当GluR2 C末端肽在Ser880被磷酸化时，GRIP1不再与GluR2肽相互作用（图。​（图3三一). 然而，当磷酸化肽在GRIP1结合前通过λ-磷酸酶处理去磷酸化时，GRIP1与GluR2 C末端的相互作用可以恢复（图。​（图3三一). 相反，PICK1结合到未磷酸化和磷酸化的GluR2肽（图。​（图3三b条). 这些结果表明，GluR2 PDZ配体的磷酸化对PICK1和GRIP1的PDZ结构域的结合有差异调节在体外.

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图3。

GluR2 C末端的Ser880磷酸化差异调节GluR2与GRIP1和PICK1的相互作用。一,b条,体外GRIP1的绑定(一)或PICK1(b条)含有Ser880-磷酸化GluR2肽。表达GRIP1或PICK1的HEK293T细胞提取物与Ser880-磷酸化R2肽孵育(第2页)或非磷酸化肽(R2级)固定在亲和树脂上，通过免疫印迹检测结合的GRIP1或PICK1。一，GRIP1不与pR2肽相互作用，而pR2肽的磷酸酶处理恢复了GRIP1结合。b条，PICK1与pR2和R2肽结合。c（c）,d日、GluR2与GRIP1的免疫共沉淀(c（c）)或PICK1(d日)来自转染的HEK293T细胞，含或不含1μ米TPA治疗。PKC激活增加GluR2 C末端的Ser880磷酸化减弱GRIP1与GluR2的相互作用(c（c）)但对PICK1与GluR2的结合亲和力没有影响(d日).

然后我们检测了HEK293T细胞中PKC的激活是否可以调节GluR2与GRIP1 PDZ结构域的相互作用体内通过GluR2与GRIP1的共免疫沉淀测定，福尔波酯处理增加了GluR2的Ser880磷酸化，并降低了GluR2与GRIP2的相关性（图。​（图3三c（c）). 这些结果表明，PKC增加Ser880磷酸化显著损害了GluR2和GRIP1之间的相互作用。相反，TPA处理不影响GluR2与PICK1的联合免疫沉淀，表明PICK1与Ser880磷酸化和非磷酸化的GluR2结合体内（图。​（图3三d日).

用谷氨酸替换丝氨酸-880会干扰GluR2与GRIP1而非PICK1的相互作用

通过检测GRIP1或PICK1在异源表达系统中对GluR2簇的靶向性，我们进一步研究了Ser880磷酸化对GluR2C末端与GRIP1和PICK1相互作用的作用。我们先前通过免疫染色显示，细胞外神经元即刻早期基因Narp在HEK293T细胞中共表达时，可以诱导GluR2亚单位聚集成受体丰富的斑块(O'Brien等人，1999年). 有趣的是，HEK293T细胞与Narp、GRIP1和GluR2的三重转染导致GRIP1招募到Narp诱导的GluR2簇。然而，GRIP1并没有被招募到Narp诱导的突变GluR2簇（GluR2S880E）中，其中丝氨酸-880被谷氨酸残基取代，以模拟磷酸化丝氨酸-88的负电荷（图。​（图44一). 因此，在HEK293T细胞中，GluR2突变亚基（S880E）似乎不与GRIP1相互作用。相反，PICK1被招募到Narp诱导的野生型GluR2和GluR2S880E簇中，这表明PICK1可以与野生型和GluR2 S880e突变体相互作用，这模拟了Ser880磷酸化的负电荷（图。​（图44b条). 因此，用谷氨酸替换丝氨酸-880破坏了GRIP1而不是PICK1与GluR2簇的关联体内.

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图4。

GluR2的S880E突变破坏了GRIP1与GluR2而非PICK1的相互作用。一对转染Narp、GRIP1和GluR2或GluR2S880E突变株的HEK293T细胞进行免疫染色。转染细胞用小鼠抗GluR2-Neterm进行双重标记(红色)和抗GRIP1抗体(绿色). Narp诱导GluR2聚集，GRIP1与GluR2共聚集；然而，S880E突变破坏了GRIP1与GluR2的共聚类。b条对转染Narp、PICK1和GluR2或GluR2S880E突变株的HEK293T细胞进行免疫染色。转染细胞用小鼠抗GluR2-Neterm进行双重标记(红色)和抗PICK1抗体(绿色). S880E突变没有破坏PICK1和GluR2的共聚类。

类似地，在酵母双杂交系统中，野生型GluR2 C末端与GRIP1相互作用良好，而GluR2S880E突变体未能相互作用。相反，突变的GluR2 S880E C末端与PICK1以及野生型GluR2相互作用（数据未显示）。此外，我们还对海马cDNA文库进行了酵母双杂交筛选，以突变的GluR2S880E C末端为诱饵，搜索可能与Ser880-磷酸化GluR2亚单位结合的其他蛋白质。有趣的是，在我们通常使用野生型GluR2 C末端作为诱饵分离许多GRIP1 cDNA的条件下，在这个无偏见的筛选中分离出的唯一阳性相互作用克隆是PICK1（数据未显示）。这些结果表明，谷氨酸（S880E）取代丝氨酸-880大大减弱了GluR2 C末端与GRIP1的相互作用，但在酵母双杂交试验中保留了其与PICK1的相互影响。

Ser880磷酸化GluR2亚基的神经元定位

我们用免疫细胞化学技术检测了Ser880-磷酸化GluR2的亚细胞定位与大鼠海马神经元中总GluR2亚单位的分布关系。抗GluR2-pS880抗体表明，大多数Ser880-磷酸化的GluR2以小簇的形式定位于树突状轴，在棘突触处仅检测到低水平的免疫染色（图。​（图55一). 这与使用N端抗体检测到的GluR2总群体的分布形成对比，该抗体显示高水平的聚集性GluR2（图。​（图55一)与树突棘上的突触标记共定位(廖等，1999)（未显示数据）。在树突轴中，低水平的GluR2 N-末端染色也与Ser880磷酸化的GluR2共定位（图。​（图55一). 抗GluR2-pS880抗体与其抗原的预吸收阻止了显示抗体特异性的免疫染色（数据未显示）。为了证实Ser880-磷酸化GluR2不定位于突触，我们用突触标记物抗突触素单克隆抗体对海马神经元进行双重标记。未观察到Ser880-磷酸化GluR2与突触素的共定位（图。​（图55c（c）). 此外，其他突触蛋白，即NR1亚单位，在兴奋性突触处未与Ser880-磷酸化GluR2亚单位共定位（图。​（图55e（电子）). 这些结果表明Ser880磷酸化可能参与GluR2亚单位的突触靶向。

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图5。

GluR2-pS880在培养海马神经元中的定位。一,b条，用兔抗GluR2-pS880双标记培养的3周龄低密度海马神经元(红色)和小鼠抗GluR2-N项抗体(绿色).一在对照神经元中，GluR2-pS880在树突中与N-末端GluR2染色共定位，但在突触中与突触GluR2不共定位。b条，在用200n处理的神经元中米TPA持续15分钟，PKC激活显著增加了脊柱头部和树突中Ser880-磷酸化GluR2的染色。c（c）,d日，神经元用兔抗GluR2-pS880双标记(红色)和小鼠抗突触素抗体(绿色).c（c），GluR2-pS880不与突触素共定位。d日，在200 n处理的神经元中米TPA持续15分钟，PKC激活增加Ser880-磷酸化GluR2与突触素在突触的共定位。e（电子）,（f），神经元用兔抗GluR2-pS880双标记(红色)和小鼠抗NR1 N末端抗体(绿色).e（电子），GluR2-pS880不与NR1共定位。（f），在200 n处理的神经元中米TPA 15分钟，PKC激活增加了Ser880磷酸化GluR2与NR1在突触的共定位。克，PKC激活对每100μl突触GluR2-pS880簇数量影响的统计分析米枝晶。TPA治疗显著增加突触GluR2-pS880簇(n个=36，用于控制和n个TPA=40，t吨测试，对< 0.001). 然而，突触GluR2簇的总数没有变化(n个=15，用于控制和n个对于TPA＝20，t吨测试，对>0.05）和突触NR1簇(n个=10，用于控制和n个TPA=10，t吨测试，对> 0.05).

PKC激活增加突触Ser880-磷酸化GluR2以及PICK1的突触靶向性

有趣的是，用0.2μ米佛波酯显著增加了脊椎头部或脊椎颈部GluR2的磷酸化，这是树突轴和树突轴的线状挤出物（图。​（图55b条). TPA治疗后5分钟即观察到突触Ser880-磷酸化GluR2亚单位的出现（数据未显示）。此外，用抗GluR2-pS880和抗突触素或抗NR1抗体对神经元进行双重染色显示，TPA治疗后，Ser880磷酸化GluR2亚基与突触素和NR1在棘突触处共定位（图。​（图55d日,（f）). PKC激活显著增加了Ser880-磷酸化GluR2突触簇的数量[控制=每100μm树突1±0.1(n个= 36); TPA=41±1.0每100μm枝晶(n个= 40);对<0.001]（图。​（图55克). 相反，由磷酸化诱导的抗GluR2 N端抗体检测到的GluR2突触簇总数没有显著变化[对照组=44±1.5/100μm树突(n个= 15); TPA=42±1.6/100μm枝晶(n个= 20);对>0.05]（图。​（图55克). 同样，NR1突触簇的总数也没有统计学上的显著变化[对照组=44±2.0/100μm树突(n个= 10); TPA=45±3.7/100μm枝晶(n个= 10);对>0.05]（图。​（图55克).

由于Ser880-磷酸化的GluR2与PICK1结合，但不与GRIP1结合，我们还利用免疫细胞化学技术检测了磷酸化GluR2在大鼠海马神经元中的亚细胞定位，以及GRIP1和PICK1的分布。PICK1在树突中与Ser880-磷酸化GluR2共定位，但在这些条件下，在棘突触中观察到很少PICK1（图。​（图66一). 这与我们之前的结果不一致，我们发现PICK1定位于突触(Xia等人，1999年). 然而，我们最近发现PICK1的突触定位因培养条件而异，并且受PKC的调节。如图所示​图66b条，PKC激活导致PICK1和Ser880-磷酸化GluR2亚基急剧重新分布到树突棘（图。​（图66b条). 福尔波酯处理显著增加了突触PICK1簇的数量[对照=1±0.4/100μm树突(n个= 16); TPA=38±2.2每100μm枝晶(n个= 15);对<0.001]（图。​（图66c（c）). 这些结果表明，PKC激活增加了突触GluR2的磷酸化，并诱导兴奋性突触中PICK1水平的重新分布。

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图6。

PKC激活显著增加培养海马神经元中的突触GluR2-pS880和PICK1。a–c，用抗PICK1抗体对培养的3周龄低密度海马神经元进行双重标记(绿色)和抗GluR2-pS880抗体(红色).一在对照神经元中，PICK1与GluR2-pS880在树突中共定位。b条，在200 n处理的神经元中米TPA持续15分钟，PKC激活增加突触PICK1染色。c（c），PKC激活对每100μm突触PICK1簇数影响的统计分析米枝晶。PKC激活显著增加突触PICK1簇(n个=16，用于控制和n个=TPA为15，t吨测试，对< 0.001).d–f日，神经元被抗GRIP1抗体双重标记(绿色)和抗GluR2-pS880抗体(红色).d日在对照神经元中，GRIP1与GluR2-pS880在树突和棘中的共定位都不好。e（电子），在用200n处理的神经元中米TPA持续15分钟，突触GRIP1分布无明显变化。（f），PKC激活对每100μm突触GRIP1簇数影响的统计分析米枝晶。PKC激活适度降低突触GRIP1簇(n个=7，用于控制和n个=TPA为8，t吨测试，对> 0.05).

先前的研究表明，GRIP1在一些突触与总GluR2共定位(Dong等人，1997年,1999). 然而，带有抗GRIP1和Ser880磷酸化GluR2抗体的双标记神经元表明，GRIP1在树突和棘突触中与Ser880磷化GluR2没有很好的共定位（图。​（图66d日). PKC激活对GRIP1的亚细胞定位几乎没有影响，导致GRIP1与一些Ser880磷酸化的GluR2亚基在棘突触处共定位（图。​（图66e（电子）). 量化显示PKC激活后突触GRIP1簇的数量略有减少，但并不显著[对照=21±1.6/100μm树突(n个= 7); TPA=18±1.8每100μm枝晶(n个= 8);对>0.05]（图。​（图66（f）).

PKC激活诱导GluR2内化

突触GluR2的Ser880磷酸化以及PKC激活后PICK1动员到突触可能参与AMPA受体的表面膜转运。为了验证这一假设，我们使用可逆的表面生物素化技术测量了皮层神经元培养物中TPA处理后内化的表面GluR2亚单位。神经元首先在4°C下用生物素标记，然后在37°C下用TPA处理15分钟，以允许膜运输。将神经元放回4°C以阻止细胞膜的运输，并用还原剂谷胱甘肽处理剩余在细胞表面的生物素。在这一步中，只有内化的表面蛋白质受到还原剂的保护，并保持生物素化。然后在亲和素结合树脂上纯化生物素化的内化表面分子，并使用抗GluR2-C末端抗体进行定量免疫印迹分析。PKC刺激后内化的表面GluR2的数量通过比较谷胱甘肽还原前后生物素化蛋白的数量进行量化，并以总表面GluR2的百分比表示。在该分析中，我们发现PKC激活显著增加了内化表面GluR2亚单位的水平（对照=2.0±0.7%，n个= 8; TPA=17.0±1.1%，n个= 8,t吨测试：对<0.001）（图。​（图77一). 此外，使用抗GluR2-pS880抗体的免疫印迹分析表明，TPA刺激后内化的GluR2亚单位在丝氨酸-880处磷酸化。这些结果表明，丝氨酸-880处的GluR2磷酸化可能调节GluR2的内化速率。

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图7。

PKC激活诱导培养的皮层神经元内吞GluR2。一，对3周龄高密度培养的皮层神经元进行内化实验，检测TPA处理后内化的GluR2亚单位。用抗GluR2-C末端和抗GluR2 pS880抗体进行免疫印迹分析生物素化、内化的GluR2亚单位。内化的GluR2亚基被量化为总表面GluR2子基的百分比(n个对于对照和TPA均为8，t吨测试；对< 0.001). PKC激活诱导表面GluR2亚单位的快速内化。b条TPA治疗后，对皮层神经元进行表面生物素化，以检测总表面GluR2亚基的稳态水平。用抗GluR2-C末端抗体免疫印迹法分析生物素化的GluR2亚基。表面GluR2亚基的稳态水平被量化为GluR2总亚基的百分比(n个=控制和TPA均为8，t吨测试；对< 0.001). PKC刺激导致表面GluR2亚基的总水平降低，但不降低NMDA受体的表面NR2B亚基(n个=控制和TPA均为8，t吨测试；对> 0.05).

为了测试PKC激活是否降低GluR2亚单位的表面表达，我们使用表面生物素化技术测量了皮层神经元培养物中PKC激活后表面GluR2子单位的稳态水平。用对照溶液或TPA处理神经元15分钟后，在4℃用生物素标记表面分子，在亲和素结合树脂上纯化，并使用抗GluR2-C末端和抗NR2B-C末端抗体进行定量免疫印迹分析。通过比较生物素化蛋白质的数量和总蛋白质的数量来量化表面蛋白质的数量，并以总蛋白质的百分比表示。PKC刺激导致总表面GluR2亚基水平略有下降，但具有统计学意义（对照组=47±1.2%，n个= 8; TPA=40±0.6%，n个= 8,t吨测试：对<0.001）（图。​（图77b条). 相反，NR2B亚基的表面水平不受TPA处理的影响，这表明TPA诱导的内化对GluR2亚基是特异性的（对照=28±1.3%，n个= 8; TPA=30±2.6%，n个= 8,t吨测试：对>0.05）（图。​（图77b条). 这些结果表明，PKC激活后丝氨酸-880处GluR2磷酸化的增加可能与表面GluR2亚单位的内化有关。

讨论

PDZ结构域是普遍存在的蛋白质模块，通过与靶蛋白的C末端结合介导蛋白质相互作用(Sheng和Kim，1996年;Kim和Huganir，1999年). 突触后密度是兴奋性突触的一个显著结构，包含几个PDZ结构域蛋白，对谷氨酸受体的突触靶向和信号转导似乎很重要(Sheng和Kim，1996年;Kim和Huganir，1999年). 最近研究表明，突触上的谷氨酸受体功能被迅速调节，这表明可能存在动态调节机制来调节谷氨酸受体与突触蛋白的联系(Isaac等人，1995年;廖等，1995,1999;Carroll等人，1999年;Shi等人，1999年). 谷氨酸受体的C端细胞内区域包含与细胞内蛋白质相互作用的主要结构域，但也包含已被证明可以调节离子通道特性的蛋白质磷酸化的主要位点(McGlade-McCulloh等人，1993年;Wang等人，1994年;Roche等人，1996年;Mammen等人，1997年). 在本研究中，我们研究了AMPA受体亚单位的蛋白磷酸化是否也可以调节它们与PDZ结构域蛋白的相互作用。我们证明GluR2的PDZ结构域相互作用区域在丝氨酸-880处磷酸化体内试验。我们还发现丝氨酸-880被PKC磷酸化在体外Ser880磷酸化增加体内通过佛波酯处理。这些结果表明PKC磷酸化了这个位点体内虽然我们不能排除PKC刺激激活的其他下游激酶可能磷酸化该位点的可能性体内.

GluR2的Ser880磷酸化不同程度地调节GluR2 C末端与GRIP1和PICK1的PDZ结构域的相互作用。有趣的是，Ser880的磷酸化破坏了GluR2与GRIP1的结合，而磷酸化和非磷酸化的GluR2都可以与PICK1相互作用。在这项工作进行中，Matsuda等人（1999年）还发现，PKC在Ser880上磷酸化GluR2，这种磷酸化抑制了其与GRIP1的相互作用(Matsuda等人，1999年). GluR2磷酸化对GRIP1和PICK1结合的差异影响可能来自GRIP1与PICK1 PDZ结构域的不同结构。GRIP1的PDZ结构域与GluR2（PDZ5）相互作用，是一个2型PDZ结构区，它在-2残基（例如GluR2 C末端（ESV（V）KI）(Dong等人，1997年;宋阳等，1997). 相反，PICK1的PDZ结构域是一个1b型PDZ结构区，它与具有典型T/SXV基序的C端PDZ配体结合，例如发生在PKCα的C端，其中位置-2处的羟基对结合PDZ结构段很重要(宋阳等，1997;Staudinger等人，1997年). 然而，PICK1也与GluR2、EPH受体和2型PDZ配体肾上腺素的C端结合(Torres等人，1998年;Xia等人，1999年). 这些结果表明，在GRIP1中，PICK1-PDZ域的选择性低于PDZ5，并且可能解释了PICK1与GluR2的结合，无论Ser880磷酸化状态如何。

用Ser880磷酸化特异性抗体对培养的海马神经元进行免疫染色显示，在控制条件下，Ser880-磷酸化的GluR2在树突状轴中富集并与PICK1共定位，在含有非磷酸化GluR2的突触中很少观察到染色。这与我们之前的结果不同，我们在控制神经元中看到了PICK1的一些突触定位(Xia等人，1999年). 突触PICK1染色的变化可能与培养条件有关，并可能反映神经元中PKC的激活。因为我们的数据表明PICK1的突触定位是动态的，并受PKC的调节，所以这两种情况（控制神经元中PICK1有或没有突触定位）可能共存体内相反，GRIP1与磷酸化的GluR2不能很好地共定位，并且在一些棘突触处与总GluR2共定位。有趣的是，用PKC活化剂处理神经元，显著增加了树突和突触中GluR2的Ser880磷酸化，以及PICK1的突触靶向性。相反，GRIP1突触簇的数量略有下降。这些观察结果与GRIP1和PICK1与磷酸化和非磷酸化GluR2的差异相互作用一致，并表明GluR2的Ser880磷酸化可能调节突触的分子组成。PKC激活后GRIP1分布无明显变化，表明GRIP1可能通过其多个PDZ结构域与突触细胞骨架蛋白相互作用而安全地锚定在突触后密度。

最近的数据表明，GluR2的C末端与PDZ结构域蛋白的相互作用对于AMPA受体的突触靶向非常重要。GluR2 C末端PDZ配体的过度表达抑制了培养神经元中AMPA受体的突触聚集，表明PDZ结构域介导的GluR2相互作用对AMPA受体突触靶向至关重要(Dong等人，1997年). 这些数据表明，通过磷酸化调节GluR2与GRIP1和PICK1的相互作用可能调节AMPA受体的膜转运。事实上，皮层培养神经元中PKC的激活增加了GluR2的Ser880磷酸化，并诱导表面GluR2亚单位的内化，导致表面GluR2的总水平降低。有趣的是，PKC激活还诱导PICK1显著动员到突触，表明PICK1与Ser880-磷酸化GluR2的相互作用可能参与AMPA受体的内化。

AMPA受体突触定位的变化最近被认为在许多形式的突触可塑性中都很重要，包括LTP和LTD(Carroll等人，1999年;Kim和Huganir，1999年;廖等，1999;Shi等人，1999年). 在海马脑片中诱导LTP已被证明可以诱导AMPA受体快速重新分布到突触棘(Shi等人，1999年)而神经元培养物中LTD的诱导降低了AMPA受体的表面表达(Carroll等人，1999年). 现在有大量证据表明，小脑浦肯野细胞中的LTD需要PKC激活(林登，1994年;De Zeeuw等人，1998年)，最近的研究提供了证据，证明小脑LTD可能是由AMPA受体内吞作用介导的(王和林登，2000年). 此外，海马CA1区代谢型谷氨酸受体依赖性LTD(斯坦顿等人，1991年;Bolshakov和Siegelbaum，1994年;Yang等人，1994年)已显示需要PKC激活(Oliet等人，1997年;Otani和Connor，1998年;Wang等人，1998年). 我们的结果表明，丝氨酸-880处的GluR2磷酸化可能通过调节GluR2与PDZ结构域蛋白的相互作用，在几种形式的突触可塑性中调节AMPA受体的内化。

PKC激活调节GluR2内化的发现令人惊讶，因为大多数先前的研究表明，PKC可能通过GluR1亚单位上Ser831的磷酸化增强AMPA受体功能(Roche等人，1996年;Carroll等人，1998年). 此外，最近研究表明，通过依赖GluR2与GRIP相互作用的机制，PKC的激活是5HT诱导沉默脊髓感觉突触激活所必需的(Li等人，1999年). 然而，如上所述，PKC激活似乎调节小脑浦肯野细胞LTD期间AMPA受体的内化。这些不同系统之间的差异尚不清楚；然而，AMPA受体的亚单位组成和这些系统突触中特定受体相关蛋白的表达水平可能在AMPA受体功能的差异调节中起重要作用。例如，在感觉神经元中，GluR2和GRIP之间的相互作用，而不是PICK1之间的相互作用，被认为与突触激活有关，而我们的结果表明，皮层神经元中GluR2和PICK1的相互作用与受体内化有关。此外，在小脑浦肯野细胞中，AMPA受体由GluR2/3异构体组成，不包含PKC增强AMPA受体所需的GluR1亚单位的显著水平。PKC影响AMPA受体功能的分子机制显然非常复杂，需要进一步的实验来剖析这些过程的相互作用。

最后，AMPA受体与GRIP1和PICK1的差异结合也可能调节受体与参与信号转导的不同蛋白复合物的偶联(Kim和Huganir，1999年). GRIP1包含七个PDZ结构域，每个结构域都独立地与各种蛋白质相互作用，包括EPH受体酪氨酸激酶及其配体肾上腺素(Kim和Huganir，1999年)以及GRASP1（GRIP-associated protein 1），一种新型神经元rasGEF(Ye等人，2000年). 虽然PICK1只包含一个PDZ结构域，但它可以将AMPA受体与其他蛋白质（包括PKCα(Kim和Huganir，1999年). 因此，Ser880的磷酸化除了调节AMPA受体膜的运输外，还可以调节兴奋性突触处AMPA受体信号转导复合体的形成（图。​（图88).

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图8。

通过GluR2 PDZ配体磷酸化调节大分子AMPA受体蛋白复合物的模型。GluR2 C末端PDZ配体中Ser880的PKC磷酸化差异调节其与GRIP和PICK1的PDZ结构域的相互作用。PDZ结构域介导的相互作用的差异调节可能调节AMPA受体的表面表达以及AMPA受体复合体的组成和兴奋性突触处随后的下游信号级联。

脚注

参考文献