神经科学杂志。2000年10月1日；20(19): 7417–7423.
ELISA检测初级感觉神经元内源性脑源性神经营养因子的活性依赖性释放现场
1俄亥俄州克利夫兰凯斯西储大学医学院神经科学系44106
2000年5月22日收到；2000年7月5日修订；2000年7月13日验收。
摘要
为了定义内源性脑源性神经营养因子（BDNF）的活性依赖性释放，我们开发了一种在体外使用初级感觉神经元和改良ELISA的模型，称为ELISA就地将新生大鼠结-岩神经节细胞的分离培养物生长在预先涂有抗BDNF抗体的微孔中，以捕获释放的BDNF，随后使用常规ELISA检测。在慢性去极化40 m后，仅用常规ELISA无法检测到BDNF浓度高于对照值的任何增加米KCl 72小时。然而，ELISA就地在KCl处理的培养物中，BDNF释放量显著增加，从对照组的65 pg/ml增加到228 pg/ml。The efficacy of the就地该分析似乎主要与快速捕获释放的BDNF有关，BDNF阻止BDNF与培养细胞结合。因此，我们使用这种方法来比较暴露30分钟培养物中BDNF的释放情况，或者是通过升高KCl持续去极化，或者是模式电场刺激（50个25毫秒的双相矩形脉冲，20赫兹，每5秒）。短期KCl去极化在诱发任何可检测到的BDNF释放方面完全无效，而模式化电刺激使细胞外BDNF水平增加了20倍。此外，BDNF释放的幅度取决于刺激模式，高频脉冲是最有效的。这些数据表明，BDNF释放的最佳刺激模式与其他神经活性肽相似。此外，我们的研究结果表明，BDNF的释放可以编码突触前神经元活动的时间特征。
关键词：BDNF释放、慢性去极化、电场刺激、ELISA、ELISA就地、频率、模式刺激、P-CREB、初级感觉神经元
越来越多的证据表明，脑源性神经营养因子（BDNF）在调节初级感觉神经元和二级感觉接力细胞之间的传递中起着跨突触作用。BDNF由感觉神经节细胞亚群表达(Schecterson和Bothwell，1992年;Wetmore和Olson，1995年;Apfel等人，1996年;Zhou等人，1998年;Brady等人，1999年)，可在背根神经节（DRG）神经元的中央投射处转运(Zhou和Rush，1996年;Tonra，1999年)，定位于DRG中枢轴突终末内的致密核小泡(Michael等人，1997年). 我们的研究表明，长期接触高钾可以支持表达和依赖BDNF的感觉神经元的存活，这表明BDNF可以在培养的去极化条件下释放(Brady等人，1999年). 最近我们发现BDNF在二级感觉接力神经元中强烈抑制AMPA介导的电流，表明BDNF可能调节谷氨酸能初级传入传递(Balkowiec等人，2000年). 此外，Kerr等人（1999）证明BDNF可以通过增强NMDA受体介导的反应来增强伤害性脊髓反射。尽管有这些发现，但对于内源性BDNF的活性依赖性释放，无论是来自初级感觉神经元还是其他类型的神经元，人们知之甚少。
由于传统检测方法检测生理刺激过程中释放的相对少量的这些因子的能力有限，对已鉴定神经元内源性神经营养素调节分泌的分析受到了阻碍。迄今为止的研究已使用ELISA检测组织切片或转染细胞中神经营养素过度表达后神经营养素的释放(Blöchl和Thoenen，1995年,1996;古德曼等人，1996年;Heymach等人，1996年;Canossa等人，1997年;Krüttgen等人，1998年;Griesbeck等人，1999年). 然而，尚不清楚过度表达到极高浓度是否会改变BDNF的正常运输和释放途径。此外，大多数关于调节神经营养素释放的研究都使用连续的膜去极化剂刺激细胞，包括升高的细胞外钾、藜芦碱或谷氨酸受体激动剂(Ghosh等人，1994年;Blöchl和Thoenen，1995年;Androutsellis-Theotokis等人，1996年;Goodman等人，1996年;Heymach等人，1996年;Griesbeck等人，1999年). 然而，众所周知，经典和肽类递质的释放取决于神经脉冲模式(Lundberg等人，1989年;惠姆和劳埃德，1994年).
为了解决这些问题，本研究使用一种改进的传统ELISA方法，即ELISA，比较了连续化学去极化和模式化电刺激对初级感觉神经元释放BDNF的影响就地。该技术由Beech等人（1997）为了测量T细胞释放的细胞因子，将针对感兴趣肽的底物结合单克隆抗体纳入细胞培养系统，以便立即捕获释放的肽，以便随后通过比色法进行检测。我们发现，使用这项技术，我们可以很容易地检测短期模式电刺激后新生初级感觉神经元内源性BDNF的释放。此外，我们发现，在同一时间段内，高频脉冲的短期刺激比KCl诱导的去极化更有效地释放BDNF。
材料和方法
细胞制备和培养。新生大鼠（Sprague-Dawley株；Zivic-Miller，Zelienople，PA）通过低温深度麻醉并斩首。（1）从动物身上无菌去除结节和岩神经节（NPG），（2）在0.1%胰蛋白酶（Worthington Biochemical，Lakewood，NJ）中消化，0.01%脱氧核糖核酸酶I（Sigma，St.Louis，MO）溶于Ca2+-和镁2+-在37°C、5%CO的增湿大气中，脱除HBSS（Mediatech，Herndon，VA）30分钟2和95%的空气，（3）在0.1%溶于钙的大豆胰蛋白酶抑制剂（沃辛顿）中冲洗2+-和镁2+-含有Dulbecco磷酸盐缓冲盐溶液（Mediatech），（4）转移至培养基，（5）通过硅化、火焰抛光的巴斯德吸管研磨。将分离的NPG神经元以每孔一个NPG的密度放置在紫外线消毒的96个平底ELISA板（MaxiSorp；Nalge Nunc International，Naperville，IL）中。NPG神经元培养物在补充有B-27无血清补充剂的Neurobasal-A培养基中培养3天，0.5 m米我-谷氨酰胺，0.025 m米谷氨酸和1%青霉素-链霉素-新霉素抗生素混合物（马里兰州盖瑟斯堡生命科技公司）。
BDNF免疫分析。使用BDNF E的常规和改良夹心ELISA测定BDNF蛋白最大值免疫分析系统（Promega，Madison，WI）符合制造商的协议，但抗BDNF单克隆抗体和抗人BDNF多克隆抗体的浓度分别为5和2μg/ml，抗IgY-HRP抗体的稀释度为1:1000。用0.2μm Acrodisc注射器过滤器（Pall，Ann Arbor，MI）对细胞电镀前使用的所有试剂进行消毒。
常规BDNF ELISA。NPG细胞生长在未涂层的96-well ELISA板中。在一些对照实验中，用不相关的单克隆抗体（抗NGF；Promega）预先包被微孔，以排除抗体存在对BDNF释放的任何潜在影响。这些微孔在细胞板之前进行处理，如下所述，以获得抗BDNF单克隆抗体。在试验当天，使用在用于细胞培养的相同培养基中稀释的BDNF为每个平板生成标准曲线。根据制造商的方案，将细胞条件培养基的标准品（一式两份）和未稀释的新鲜样品（一式两或三份）培养在预先涂有抗BDNF单克隆抗体的ELISA板中。在培养和清洗步骤后，应用抗人BDNF多克隆抗体（见下文）。
BDNF酶联免疫吸附试验现场。将96孔ELISA板进行紫外线消毒30分钟，并在4°C下用抗BDNF单克隆抗体涂覆16.5小时。接下来，清洗并封闭板，然后用培养基培养两个1小时，以去除ELISA洗涤液的任何残留物。然后如上所述制备NPG神经元，将其置于抗BDNF涂层的孔中，并在各种实验条件下生长3d（见结果）。用于生成标准曲线的BDNF样品在与细胞相同的平板中培养。在培养期结束时，对培养板进行广泛清洗，以清除所有细胞和细胞碎片，并应用抗人BDNF多克隆抗体，然后根据制造商的方案进行后续步骤。在设计用于比较传统BDNF ELISA和BDNF-ELISA的实验中就地，从应用抗人BDNF抗体开始，该方案的所有步骤在两种分析中同时进行。在450 nm处用平板读取器读取吸光度值（V最大值; 分子器件，加利福尼亚州森尼维尔）。对于省略抗BDNF单克隆抗体的对照孔，吸光度值与空白孔的吸光度没有显著差异。
电场刺激NPG神经元。按照上述BDNF ELISA方法制备NPG培养物就地在最初的三维培养后，三个相邻的培养孔通过渗透有培养基的1%琼脂糖凝胶薄片串联在一起，并通过Ag:AgCl刺激电极（根据Brevet等人，1976年;McDonough等人，1994年). 另外三口井也通过琼脂糖桥相互连接，但没有连接到刺激器，用作对照。将平板放回培养箱，用以各种模式递送的双相矩形脉冲刺激神经元30或60分钟（见结果）。在对比图案化电刺激和钾诱导连续去极化效果的实验中，向另外三口井中添加KCl，最终浓度为40 m米，在刺激期开始时。此外，同样在刺激期开始时，在同一个板中制备BDNF标准品。刺激后，在进行上述ELISA步骤之前，对所有微孔进行大力清洗。
计算和统计分析。使用SOFTmax PRO 3.0版软件（Molecular Devices），根据为每个平板准备的标准曲线计算BDNF水平。标准曲线在所用范围内呈线性（0-500 pg/ml），实验样品中BDNF的数量始终在标准曲线的线性范围内。数据表示为平均值±标准偏差。使用方差分析和邓肯多重比较程序对样本进行比较第页<0.05被认为是显著的。
免疫细胞化学。免疫细胞化学染色培养物用4%多聚甲醛固定在0.1米磷酸钠缓冲液，pH 7.4，室温下30分钟。如前所述进行蛋白基因产物（PGP）9.5免疫染色(Brady等人，1999年). 通过计数每孔所有PGP9.5-免疫活性细胞来评估每个培养物中的神经元数量。每个实验组用三种培养物进行三次实验。使用ANOVA和Duncan的多重比较程序对数值进行比较第页<0.05被认为是显著的。如前所述，进行TrkB和磷酸化cAMP反应元件结合蛋白（P-CREB）免疫染色(Brady等人，1999年)使用兔多克隆抗TrkB抗体（Chemicon，Temecula，CA）或兔抗磷酸-CREB IgG抗体（Upstate Biotechnology，Lake Placid，NY）和山羊抗兔生物素化IgG（Vector Laboratories，Burlingame，CA）。对照培养物中一级抗体被省略，完全没有染色。
抗TrkB IgG1（克隆47；转导实验室，肯塔基州列克星敦；目录#{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“T16020”，“term_id”：“518182”，“term_text”：“T16020”}}T16020型（特殊顺序，无添加剂）用于抑制BDNF与TrkB受体的结合（见结果）。我们确定5μg/ml抗TrkB足以抑制BDNF依赖性胚胎第16.5天NPG神经元的存活(埃里克森等人，1996年)在10 ng/ml BDNF的存在下生长。不依赖BDNF的新生NPG神经元的存活(Brady等人，1999年)，不受10μg/ml抗体处理的影响（对照组每孔1197.56±102.78个神经元，抗TrkB组每孔1025.5±80.49个神经元；n个= 9;第页= 0.37578).
结果
初步研究旨在比较在无（对照）或存在去极化浓度KCl（40 m）的情况下培养72小时的新生NPG神经元中BDNF的细胞外水平米;Brosenitsch等人，1998年;Brady等人，1999年)使用传统BDNF ELISA协议。使用这种方法，我们能够在对照培养物中仅检测到非常低水平的BDNF，并且与对照相比，KCl处理组的BDNF浓度没有显著变化（图。; 对照组2.88±0.84 pg/ml；n个= 23; KCl处理，4.92±0.81 pg/ml；n个= 21;第页= 0.88256). 这一结果与我们实验室先前的研究结果不一致，即内源性BDNF可以支持培养的NPG神经元在长期接触高KCl后的存活(Brady等人，1999年). 因此，我们试图通过改进传统ELISA（称为ELISA）来提高培养系统中BDNF的检测能力就地细胞生长在预先涂有针对感兴趣肽的单克隆抗体的微孔中，从而固定肽并随后使用标准比色法检测(Beech等人，1997年). 事实上，使用BDNF-ELISA就地，我们不仅能够测量对照培养物中较高水平的BDNF，而且能够检测到慢性去极化后BDNF的显著释放。具体而言，BDNF的浓度平均为65.34±5.29 pg/ml(n个=23）在72小时对照NPG培养基中和228.16±19.47 pg/ml(n个=21）用升高的KCl治疗72小时后(第页= 0.00011; 图。). 在KCl处理的培养物中检测到的BDNF水平的增加并不能归因于神经元存活率的增加（对照培养物中每孔1234.3±71.05个神经元，而KCl处理培养物中的每孔1429.6±91.22个神经元；n个= 9;第页= 0.53294). 同样，在细胞培养期间，BDNF抗体的存在并没有显著增加存活率（存在抗BDNF的每孔1234.3±71.05个神经元，而不存在抗BDNF的每孔1197.56±102.78个神经元；n个= 9;第页= 0.70989). 为了确定捕获抗体的存在是否刺激BDNF的释放，在KCl升高或不升高的情况下，在预先涂有无关抗NGF单克隆抗体的微孔中培养姐妹培养物，并使用传统BDNF-ELISA测定细胞外BDNF水平。在对照培养物中，单克隆抗体的存在对BDNF水平没有影响（抗NGF存在时为0.67±0.45 pg/ml，而不存在抗NGF时为0.73±0.26 pg/ml；n个= 8;第页=0.97377）或KCl处理的培养物（在有抗NGF的情况下为5.02±2.28 pg/ml，在无抗NGF情况下为4.76±1.46 pg/ml；n个= 8;第页= 0.89129). 然而，我们不能排除抗体的存在刺激释放低水平BDNF，低于常规ELISA检测极限的可能性。为了排除观察到的BDNF释放增加仅仅是由于添加KCl的培养基的渗透压增加的可能性，我们将在对照培养基中生长的培养物与添加40 m的培养物进行了比较米NaCl，并发现使用ELISA测量的BDNF水平就地，在NaCl升高的情况下没有变化（对照组92.38±13.24 pg/ml vs 76.76±7.38 pg/ml；n个= 9;第页= 0.46864).
长期暴露于升高的细胞外钾可诱导培养中新生NPG神经元释放BDNF。用标准ELISA和ELISA测定BDNF的平均水平就地在姐妹培养物中，在不存在的情况下生长72小时(控件，灰色条)或存在40 m米钾(KCl，黑色条).n个= 21; ***第页< 0.001;不另说明。，不显著。
这些发现表明，用ELISA法在对照组和KCl处理的NPG培养物中检测到了明显较高水平的BDNF就地与常规ELISA相比，这种差异不能归因于神经元存活率增加或其他非特异性效应。因此，我们假设就地检测方案通过快速捕获和固定释放的BDNF，从而保护肽不与细胞结合和/或降解，提高了BDNF的检测能力。为了测试这些可能性，将500 pg/ml外源性人重组BDNF（Promega）添加到含有单独培养基或NPG游离培养物的培养孔中。孵育72小时后，使用常规ELISA和ELISA比较两组的BDNF水平就地标准ELISA检测的BDNF水平之间没有显著差异（310.83±39.31pg/ml；n个=17）和ELISA就地（304.64±27.13微微克/毫升；n个= 10;第页= 0.88643; 图。)在仅含有培养基和BDNF的微孔中。该实验表明，两种分析的灵敏度没有本质差异。然而，当比较含有NPG神经元和BDNF的孔时，有一个高度显著的(第页=0.00047）两次分析检测到的BDNF水平之间的差异。具体来说，使用标准ELISA，BDNF浓度仅为32.12±5.42 pg/ml(n个=19）72小时后，该值与未添加BDNF的对照NPG培养基中BDNF水平无显著差异(第页= 0.30941; 图。). 这一结果表明，在NPG细胞存在的情况下，BDNF可能通过降解或与新生NPG神经元表达的高亲和力BDNF受体TrkB结合而随着时间的推移从培养基中丢失(卓和科，1996; 本研究，图。A类). 事实上，用功能阻断抗TrkB抗体处理培养物（转导实验室；有关详细信息，请参阅材料和方法）显著提高了传统ELISA检测添加到标准NPG培养物中BDNF的能力。特别是，添加抗TrkB抗体使常规ELISA检测BDNF的能力提高了近三倍，而对照组培养物没有抗TrkB（抗TrkB:211.58±62.71 pg/ml；n个= 5; 与对照组相比，68.36±11.44 pg/ml；n个= 13;第页= 0.00056; 图。B类). 这些数据表明，常规ELISA检测NPG培养物中BDNF释放的相对无能在很大程度上归因于培养细胞上BDNF与TrkB的结合。
标准ELISA法检测外源性BDNF与酶联免疫吸附试验就地将BDNF（500 pg/ml）添加到新生NPG培养物中(阴影灰色条)和培养基(医学。)独自一人(带阴影的白色条)在不存在的情况下孵育72小时(标准ELISA)或存在抗BDNF单克隆捕获抗体(ELISA原位检测). 在对照培养物中也测量了BDNF水平(实心灰色条)其中未添加外源性BDNF***第页< 0.001;不另说明。，不显著。
通过标准ELISA，抑制BDNF与细胞的结合可提高BDNF的检测能力。A类，用TrkB（Chemicon）胞外结构域抗体在无培养基条件下培养3天的新生儿NPG培养物中进行免疫染色(控制)或存在外源性BDNF(+BDNF公司500微微克/毫升）。B类，BDNF的平均水平，用标准ELISA检测，无(控制)或存在抗TrkB抗体(抗TrkB抗体，10μg/ml）在NPG培养物中(阴影灰色条)仅培养基(带阴影的白色条)在加入500pg/ml BDNF后48小时。在对照培养物中也测量了BDNF水平(实心灰色条)其中未添加外源性BDNF***第页< 0.001;*第页< 0.05;不另说明。，不显著。
与用标准ELISA获得的结果相反，ELISA就地检测到337.33±25.93 pg/ml BDNF(n个=18）72小时后，与在无细胞的情况下添加BDNF的孔中的水平无显著差异(第页= 0.92444; 图。). 这些数据表明，在整个培养期内存在的底物结合抗BDNF就地范式，成功地与细胞上与TrkB结合的BDNF竞争，从而增强BDNF在培养基中的检测能力。
先前对活性依赖性神经递质释放的研究表明，慢性去极化在释放经典递质和肽共递质方面明显不如高频电刺激有效(Belai等人，1987年;Agoston等人，1988年). 为了检测BDNF的释放是否受到类似的调节，我们比较了模式电场刺激30分钟（50个25毫秒的双相矩形脉冲，20赫兹，每5秒）和连续去极化30分钟（40米）的效果米KCl对新生NPG神经元释放BDNF的影响就地为了确定这些刺激方案是否对激活NPG神经元有效，我们用一种抗磷酸化形式CREB的抗体进行免疫染色，CREB是神经元去极化的标志(Ghosh等人，1994年;Moore等人，1996年). KCl处理和模式电场刺激都导致绝大多数细胞中P-CREB染色显著增加（图。A类)表明这两种方案都能有效激活这些培养物中的神经元。
与KCl诱导的连续去极化相比，模式化电刺激在新生NPG神经元释放BDNF方面明显更有效。A类，电场刺激30分钟后新生儿NPG培养物的P-CREB免疫染色（20 Hz；电刺激)或30分钟连续去极化(4000万米KCl公司)与非模拟控制相比。B类、在控制条件下30分钟（无刺激）、电场刺激（50个25毫秒的双相矩形脉冲，20赫兹，每5秒）或连续去极化40分钟，新生儿NPG神经元姊妹培养物中释放的BDNF平均水平米KCl公司。每个值代表刺激后测得的BDNF水平与刺激期开始时在姐妹文化中测得的水平之间的差异***第页< 0.001;不另说明。，不显著。
在30分钟的对照条件下、模式化电刺激或KCl诱导的慢性去极化后比较BDNF水平。20 Hz的模式化电刺激导致NPG神经元BDNF释放量显著增加（对照组为62.95±4.19 pg/ml，对照组为2.87±1.11 pg/ml；n个= 16;第页= 0.00011; 图。B） ●●●●。相反，KCl诱导的慢性去极化在相同时间段内对增加可检测的BDNF释放完全无效（-1.35±3.58 pg/ml；n个= 20;第页= 0.87134; 图。B类). 用1.5μ米河豚毒素（TTX），一种电压依赖性Na的抑制剂+通道，刺激前（TTX为1.50±0.70 pg/ml，无TTX为35.12±0.94 pg/ml；n个= 4;第页=0.0000001），表示此释放需要激活电压门控钠通道。为了排除BDNF释放增强是由于电激活对细胞造成损伤的可能性，我们比较了对照培养物和培养物之间的细胞存活率，培养物刺激30分钟，每5秒发出50次25毫秒、20赫兹的双相矩形脉冲。刺激后24小时，对照组和刺激组的细胞数无显著差异（每孔：对照组，1575±60.35；刺激组，1480±57.15；n个= 9;第页= 0.28485).
众所周知，肽类神经递质的释放可以通过不同的神经元活动模式进行不同的调节(Lundberg等人，1986年,1989;惠姆和劳埃德，1994年;Vilim等人，1996年). 为了研究刺激模式对NPG神经元释放BDNF的影响，我们使用了一种范式，在该范式中，脉冲总数、平均频率以及单个脉冲中的脉冲数保持不变，而脉冲内频率和脉冲间隔则不同。具体地说，在控制条件或电场刺激60分钟后，用50个10毫秒的双相矩形脉冲（以5、10、20和50赫兹的频率发送，间隔分别为0（强直刺激）、10、15和18秒）比较BDNF水平（图。A类). 在高频爆发刺激过程中，BDNF的释放显著较高（20 Hz，34.95±4.98 pg/ml；第页= 0.0144; 50赫兹，48.07±7.18微微克/毫升；第页=0.0005）与5 Hz时的强直刺激相比（18.09±2.79 pg/ml；n个= 10; 图。B类). 在不同的突发模式之间进行比较时，每20秒发出2秒50赫兹的突发刺激最有效，尽管这种模式的突发持续时间短，间隔长（图。).
BDNF的活性依赖性释放受刺激模式的调节。A类，适用于每组文化的刺激模式示意图。B类，新生NPG神经元在用50个10毫秒的双相矩形脉冲以5、10、20和50赫兹的频率进行60分钟电场刺激期间释放的BDNF平均水平，间隔分别为0、10、15和18秒，如图所示A类. ***第页< 0.001; *第页< 0.05;不另说明。，不显著。
脚注
这项工作得到了美国公共卫生服务国家心肺血液研究所对D.M.K.的资助。
通信地址：俄亥俄州克利夫兰市欧几里德大道10900号凯斯西储大学医学院神经科学系David M.Katz博士，邮编：44106。电子邮件：ude.urwc.op@4kmd.
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